牛乳鐵素優勢肽Lfcin B1-10 的生物信息學分析

宋成祺，于立權，崔玉東，

（1.黑龍江八一農墾大學動物科技學院，大慶 163319；2.黑龍江八一農墾大學生命科學技術學院）

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）又稱乳鐵轉運蛋白（Lactotransferrin，LTF），是一種分子量約為80 kDa 的鐵結合糖蛋白，屬于轉鐵蛋白家族[1]。LF 廣泛分布于人和哺乳動物乳汁、其他多種組織及其分泌液中，但乳汁中含量較高[2]，其中牛初乳中乳鐵蛋白含量最高。血液中LF 主要由多形核細胞分泌，骨髓、唾液腺及子宮內膜等也能分泌少量乳鐵蛋白[3]。LF 不僅對維持體內細胞鐵水平發揮關鍵作用，同時還對多種病毒、細菌、真菌和寄生蟲表現出強大的抗微生物活性，而且還具有抗炎和抗癌活性，也具有多種酶功能，是先天防御系統的關鍵組成成分[4]。

牛乳鐵素（Bovine Lactoferricin，Lfcin B）是牛乳鐵蛋白（Bovine Lactoferrin，LFB）在酸性條件下經胃蛋白酶水解后，從N 端釋放產生的一種由25 個氨基酸殘基組成的抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）[5-6]。Lfcin B 由牛乳鐵蛋白（LFB）的第17～41 位氨基酸殘基組成，序列為FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF，其中包括5 個色氨酸（Trp）、3 個賴氨酸（Lys）和多個芳香族氨基酸殘基。序列中的2 個半胱氨酸（Cys）通過形成分子內二硫鍵使Lfcin B 形成不完全的環狀結構[7]。Lfcin B 除不能結合鐵離子外，其他功能則與LFB 基本一致，同樣具有抗微生物、抗腫瘤、免疫調節以及抗氧化等多重生物學功能，它的抗菌活性甚至是LFB 的400 多倍[8]。Lfcin B 具有廣譜抗菌作用（包括G+菌、G-菌和真菌），如金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）以及白色念珠菌（Canidia Albicans）等，但對腸道細菌的抑制作用具有選擇性，而對腸道中的益生菌（如雙歧桿菌、熒光假單胞菌以及乳酸菌等）的抑制效果較差或無抑制作用[8]；甚至，Lfcin B 在一定濃度范圍內能夠劑量依賴性地促進益生菌嗜酸乳桿菌的生長繁殖[9]。

對于Lfcin B 的抗菌機制，國內外研究學者普遍認為是Lfcin B 與細胞膜相互作用有關。原核細胞膜含有大量帶負電的磷脂酰甘油，使細胞膜帶有凈負電荷，故帶正電荷的Lfcin B 可與細胞膜表面的負電荷基團通過靜電吸引相結合。研究表明，Lfcin B 氨基酸序列中的第4～9 位氨基酸殘基（RRWQWR）是Lfcin B 發揮抗菌作用的活性中心[10-11]，其中，3 個精氨酸（Arg）殘基側鏈與細胞膜成分通過正負電荷吸引，而Trp 的芳香環結構與磷脂頭部的甘油相互作用，通過疏水作用附著于外膜表面，利用疏水結構使Lfcin B 通過跨膜進入細胞，或者將多個Lfcin B 聚集到細胞膜上形成跨膜的離子通道，破壞了膜的完整性，使細胞膜通透性增強，導致細胞膜裂解，胞內容物外泄，最終死亡[8]。LfcinB 抗真菌的機制有兩種，一種是對真菌的直接殺滅作用，Lfcin B 可與真菌細胞質膜發生相互作用，并影響其細胞質；另一種是通過提高宿主防御反應而實現的。來源于Lfcin B N 端區域的十肽（FKCRRWQWRM）可通過提高蛋白酪氨酸激酶（Protein-Tyr Kinase，PTK）活性和激活NADPH氧化酶復合體來誘導活性氧簇分子產生而提高多形核白細胞（polymorphocuclear leukocytes，PMNs）吞噬活性和對念珠菌屬的殺菌作用[12]。

Ueta 等[12]將Lfcin B 氨基酸序列的第11～25 位氨基酸殘基去除，得到第1～10 位氨基酸殘基構成的寡肽，命名為Lfcin B1-10，其序列為FKCRRWQWRM，并證明具有良好的抗菌和激活嗜中性粒細胞活性。但作為一種來源于Lfcin B 的新型小分子抗菌肽，對Lfcin B1-10的理化性質、二級結構以及跨膜區等尚不清楚，進而影響了對Lfcin B1-10的構效關系及抗菌機制的認識。因此，研究利用在線生物信息學工具對Lfcin B1-10的氨基酸組成、理化性質、二級結構、跨膜區、信號肽及酶切位點等特征進行了分析，同時與Lfcin B 進行比較、預測，為Lfcin B1-10的深入研究及其構效關系、抗菌作用機制和實際應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

以牛乳鐵素Lfcin B1-10為研究對象，氨基酸序列為FKCRRWQWRM；以牛乳鐵素（Lfcin B）作為參照，其氨基酸序列為FKCRRWQWRMKKLGAPSITCVRRAF。

1.2 方法

利用在線生物信息學分析工具對牛乳鐵素Lfcin B1-10及牛乳鐵素（Lfcin B）的氨基酸組成、理化性質、二級結構、跨膜區、信號肽及酶切位點等特征進行分析，所用分析工具如表1 所示。

表1 用于生物信息學分析的工具Table 1 Software for bioinformatic analysis

2 結果與分析

2.1 氨基酸組成

Lfcin B1-10含有10 個氨基酸殘基，由7 種基本氨基酸組成；Lfcin B 含有25 個氨基酸殘基，由15 種基本氨基酸組成。Lfcin B1-10與Lfcin B 所含氨基酸殘基數目和占比如表2 所示。

表2 Lfcin B1-10 和Lfcin B 的氨基酸組成Table 2 Amino acid composition of Lfcin B1-10 and Lfcin B

結果顯示，Lfcin B1-10包含1 個極微殘基（C）、1個小側鏈殘基（C）、3 個芳香族殘基（F+W）、5 個非極性（疏水性）殘基（F+C+W+M）、5 個極性（親水性）殘基（K+R+Q）以及4 個帶正電荷（堿性）殘基（K+R，占殘基總數的40%），不含脂肪族殘基和帶負電荷（酸性）殘基；Lfcin B 則包含7 個極微殘基（C+G+A+S+T）、9 個小側鏈殘基（C+G+A+P+S+T+V）、3 個脂肪族殘基（L+I+V）、4 個芳香族殘基（F+W）、14 個非極性（疏水性）殘基（F+C+W+M+L+G+A+P+I+V）、11 個極性（親水性）殘基（K+R+Q+S+T）以及8 個帶正電荷（堿性）殘基（K+R，占殘基總數的32%），同樣也不含帶負電荷（酸性）殘基。

以上結果可以看出，Lfcin B1-10的熱穩定性要低于Lfcin B（前者無脂肪族殘基，而后者含有3 個），更易于降解，這提示其在相對高溫的環境中（如機體內）的抗菌作用可能弱于Lfcin B。因Lfcin B1-10的極性與非極性殘基數相等（各占殘基總數的50%），而Lfcin B 的極性殘基數少于非極性（分別占殘基總數的44%和56%），故推測其疏水性弱于Lfcin B。AMPs的抗菌活性與其所含正電荷數密切相關，一般認為正電荷數越高則抗菌活性越強，而Lfcin B1-10的正電荷殘基數僅為Lfcin B 的1/2，且二者均無負電荷殘基，這表明Lfcin B1-10的抗菌活性可能弱于Lfcin B。

2.2 理化性質

經ProtParam 分析，Lfcin B1-10及Lfcin B 的分子式、相對分子質量、等電點、帶電荷氨基酸數目、半衰期、穩定性、脂溶性及親水性等理化性質如表3 所示。

表3 Lfcin B1-10 及Lfcin B 的理化性質Table 3 Physicochemical properties of Lfcin B1-10and Lfcin B

結果顯示，Lfcin B1-10的理論等電點與Lfcin B 基本相同，且均大于11，這可能是它們只含堿性氨基酸，而不含酸性氨基酸的原因。Lfcin B1-10與Lfcin B均可被紫外分光光度計（280 nm）檢測。Lfcin B1-10的不穩定指數達到了108.53，Lfcin B 的不穩定指數則為77.92，表明二者均屬于不穩定多肽，且相較于Lfcin B，Lfcin B1-10則更不穩定；同時，Lfcin B1-10的脂肪族指數為0.00，Lfcin B 的脂肪族指數為50.80，表明二者熱穩定性均較差，且Lfcin B1-10次于Lfcin B，這與氨基酸組成分析的結果一致，預示其在實際應用中有一定局限性；親水性平均系數反映多肽的親水性強弱，其值范圍在-2～2 之間，負值越大表示親水性越強，正值越大表示疏水性越強，Lfcin B1-10和Lfcin B 的親水性平均系數分別為-1.550 和-0.576。雖然Lfcin B1-10的疏水性殘基數與親水性殘基數相等，且Lfcin B 的疏水性殘基數還大于親水性殘基數，但分析結果卻表明Lfcin B1-10和Lfcin B 均為親水性多肽，且Lfcin B1-10的親水性強于Lfcin B，推測這可能與氨基酸殘基的排列順序有關。同時，這也應證了氨基酸組成分析的結果。

以上結果表明，Lfcin B1-10和Lfcin B 均為不穩定的、親水性的陽離子型（Lfcin B1-10的凈電荷數為+4，Lfcin B 的凈電荷數為+8）小分子抗菌肽。

2.3 二級結構

如圖1 所示，經SOPMA 分析（運行參數：視窗寬度為17，相似度閾值為8，構象狀態數目為4），Lfcin B1-10的二級結構僅有無規則卷曲（10 個氨基酸殘基均參與），表明無規則卷曲可能是Lfcin B1-10發揮抗菌作用的結構基礎；Lfcin B 的二級結構較Lfcin B1-10復雜，主要為α 螺旋。其中，α 螺旋占44.00%（11 個氨基酸殘基參與），延伸鏈占16.00%（4 個氨基酸殘基參與），β 轉角占20.00%（5 個氨基酸殘基參與），無規則卷曲占20.00%（5 個氨基酸殘基參與），推測α 螺旋可能是其發揮抗菌作用的重要結構基礎。

圖1 Lfcin B1-10 及Lfcin B 的二級結構預測Fig.1 Secondary structure prediction of Lfcin B1-10 and Lfcin B

2.4 跨膜區

跨膜區（transmembrane domain，TMD）是跨膜蛋白的疏水性氨基酸（跨越膜兩側）區域，通常為α 螺旋結構。Lfcin B1-10及Lfcin B 均來源于LFB，而LFB并非跨膜蛋白，理論上不存在跨膜區，但Lfcin B1-10及Lfcin B 的殺菌作用又與使病原菌細胞膜裂解現象密切相關，為了探究其殺菌機制是否與跨膜作用有關，使用分析工具TMHMM-2.0 對Lfcin B1-10、Lfcin B 及LFB 的跨膜區存在與否進行預測分析，結果顯示，LFB 全序列均不存在跨膜區，這表明Lfcin B1-10及Lfcin B 的殺菌機制與跨膜作用無關，推測Lfcin B1-10和Lfcin B 在與病原菌作用過程中，首先通過靜電相互作用吸附、聚集在病原菌表面，然后其疏水氨基酸通過疏水作用插入磷脂雙分子層中，最終導致病原菌細胞膜通透性增加，直至裂解死亡。

2.5 信號肽

信號肽（signal peptides，SPs）是一種引導新合成的蛋白質向分泌通路轉移的短肽鏈，常指新合成多肽鏈中用于指導蛋白質的跨膜轉移（定位）的N-末端的疏水性氨基酸序列（有時不一定在N 端）。經SignalP-6.0 預測分析的結果顯示，LFB 的第1～22 位氨基酸中可能存在信號肽，而Lfcin B1-10與Lfcin B的氨基酸序列中均不含信號肽。

有研究認為，AMPs 的無規則卷曲結構除了作用于病原菌胞膜，改變胞膜的通透性外，還有助于在病原菌胞膜上形成孔洞，然后進入病原菌細胞，與胞內核苷酸或酶作用，干擾其正常代謝，最終抑制或殺死病原菌，這也與研究學者普遍認同的Lfcin B 的抗菌機制類似。但研究結果表明，Lfcin B1-10和Lfcin B 均無信號肽，這表明其自身并不能實現跨膜轉移，理論上無法進入病原菌胞內，故其殺菌機制可能并非與穿膜作用有關。

2.6 酶切位點

如表4 所示，經Peptide Culter 分析，Lfcin B1-10和Lfcin B 可同被11 種蛋白酶剪切。

對于Lfcin B1-10，Arg-C 蛋白酶、胰凝乳蛋白酶（高特異性）、糜蛋白酶（低特異性）、梭菌蛋白酶、蛋白酶K 和胰蛋白酶均有多個剪切位點（≥3），胃蛋白酶（pH＞2）有2 個剪切位點，LysC、LysN、胃蛋白酶（pH 1.3）和嗜熱菌蛋白酶僅有1 個剪切位點；對于Lfcin B，胃蛋白酶（pH 1.3）有2 個剪切位點，而除胃蛋白酶（pH 1.3）外，其余10 種酶均有多個剪切位點（≥3）。同時，Lfcin B1-10序列中僅第3 和第7 位氨基酸殘基為非酶切位點。而Lfcin B 序列中也僅第3、7、14 和16 位氨基酸殘基為非酶切位點。同時，Lfcin B的酶切位點包含了Lfcin B1-10的所有位點。此外，二者均存在同一位點可被多種酶剪切的特點。

穩定性是衡量AMPs 能否投入實際生產應用的重要指標，而以上結果表明，Lfcin B1-10和Lfcin B 在機體內均易降解，預示它們在機體內的環境穩定性較差，這也與ProtParam 分析的理化性質結果一致。這雖不利于Lfcin B1-10和Lfcin B 的生物表達與開發應用，但通過蛋白酶的酶解作用有助于Lfcin B1-10和Lfcin B 被降解轉化為易被機體吸收利用的小分子氨基酸類物質。因此，Lfcin B1-10和Lfcin B 不僅具有良好的生物安全性，同時還有一定的營養價值。

3 討論

1992 年，Bellamy 等[6，13]首次發現LFB 的抗菌結構域的一級結構對應于其氨基酸序列N-末端的第17～41 位殘基，他們從LFB 的胃蛋白酶體外酶解物中分離得到這段序列，并將其命名為Lfcin B。而Lfcin B1-10則是通過順序去除Lfcin B 氨基酸序列的C-末端殘基來設計的，其保留了Lfcin B 中具有抗菌活性的最小基序RRWQWR，即Lfcin B 氨基酸序列中發揮抗菌作用的優勢片段[14-16]。Lfcin B1-10的生物學功能與其結構有關，通過對Lfcin B1-10的生物信息學分析，可以為進一步探究其構效關系與抗菌機制提供參考。

有研究表明，疏水性氨基酸有助于AMPs 選擇性靶向病原菌胞膜，從而抑制或殺滅病原菌[17]。國內外對Lfcin B 抗菌活性作用機制的普遍觀點認為，Lfcin B 靠其本身所帶有的正電荷與G+菌細胞膜上的磷壁酸或G-菌細胞膜上的脂多糖產生靜電相互吸引，使Lfcin B 附著于膜的表面，然后靠其疏水氨基酸造成細胞膜結構的改變，并進一步引發形成離子通道，或直接插入細胞膜使膜裂解，導致胞內容物外瀉，使細菌死亡[18]。故Lfcin B1-10和Lfcin B 的疏水性殘基可能在一定程度上增強了它們的抗菌活性。

一般來說，陽離子型AMPs 的抗菌活性較強，且通常帶有2～9 個正電荷氨基酸殘基（主要為賴氨酸、精氨酸和組氨酸等）。研究結果顯示，Lfcin B1-10和Lfcin B 的氨基酸序列中分別含有4 和8 個正電荷殘基（K+R），無負電荷氨基酸，凈電荷數分別為+4 和+8，說明二者均為強陽離子型AMPs，這可能是它們發揮抗菌作用的重要基礎[19]。同時，Lfcin B1-10的凈正電荷數僅為Lfcin B 的1/2，推測Lfcin B 的抗菌作用可能強于Lfcin B1-10。但有研究表明，Lfcin B 擁有最強抗菌活性時所需的最低凈正電荷為+4[20]，故理論上Lfcin B1-10本身即可發揮與Lfcin B 達到最強抗菌活性時同等的抗菌作用。

研究表明，Lfcin B 并不會使病原菌細胞膜裂解，但能夠穿透細菌細胞質膜，由于細胞質內含有大量多聚陰離子，這些多聚陰離子可作為Lfcin B的作用位點，從而使細胞質內脂質體融合[21]。也有研究發現核苷酸可能是Lfcin B 在細胞內的潛在靶點之，Lfcin B 可以穿透核膜[22]。一般認為，蛋白若形成跨膜通道需要包含至少18 個氨基酸殘基[23]。但本研究對Lfcin B1-10和Lfcin B 的跨膜區及信號肽的預測分析結果顯示，無論是僅含有10 個氨基酸殘基的Lfcin B1-10還是含有25 個氨基酸殘基的Lfcin B，均不存在跨膜區和信號肽，表明Lfcin B1-10和Lfcin B的抗菌作用機制似乎與跨膜作用及穿膜作用均無關，其具體的抗菌作用機制較為復雜，有待進一步研究。通過對Lfcin B1-10和Lfcin B 的酶切位點分析發現，兩種多肽可被多種蛋白酶酶解，在機體內穩定性較差。

4 結論

利用生物信息學方法對牛乳鐵素Lfcin B1-10和Lfcin B 進行了比較分析。研究發現二者均為不穩定的強陽離子型親水性抗菌肽，均沒有跨膜區和信號肽，均可被機體內多種酶降解，生物安全性較高。與Lfcin B 相比，Lfcin B1-10保留了Lfcin B 的最大抗菌活性，二級結構僅含有無規卷曲，較為簡單。為進一步研究牛乳鐵素Lfcin B1-10的構效關系、抗菌機制提供了理論參考，也為發現和臨床開發牛乳鐵素衍生抗菌肽提供了有價值的實際應用信息。