乙酰紫草素體外抗2型單純皰疹病毒機理的研究

廉梅芳，時黎明，鄭文學，李娟，李桂霞，于廣福

1.山東第一醫科大學，山東省醫學科學院，山東省高等學校新發傳染病重點實驗室，山東 泰安 271000 2.菏澤市立醫院

皰疹病毒屬DNA病毒，為有包膜病毒，包括1型單純皰疹病毒（herpes simplex virus type 1,HSV-1）、2 型單純皰疹病毒（herpes simplex virus type 2,HSV-2）和水痘-帶狀皰疹病毒（varicella-zoster virus, VZV）等[1]。單純皰疹病毒（herpes simplex virus,HSV）基因組大小約為152 kbp，表面編碼17 種包膜蛋白，包括12 種糖基化的包膜蛋白，其中型特異性糖蛋白gG可以區分HSV-1和HSV-2[2]。HSV-2屬皰疹病毒科α 皰疹病毒亞科，是引起生殖器皰疹的主要病原體之一[3-4]；該病毒還可感染白細胞和神經元細胞[5-7]，導致腦炎和傳播性疾病，影響其他器官系統[8-9]。全世界有超過5 億人感染HSV-2，并且以每年2 300 萬人的速度增加[10]。目前還沒有可以有效預防HSV-2 感染的疫苗[11]，阿昔洛韋（acyclovir, ACV）作為抗HSV-2 藥物，安全有效、耐受性好[12]，然而ACV 耐藥性問題的出現嚴重影響其對HSV-2 的臨床抑制效果[13]，因此亟須開發其他有效的抗HSV-2藥物對其進行預防和治療。

紫草始載于《神農本草經》，從紫草中分離的乙酰紫草素（acetylshikonin, AS）純度達到98.4%[14]。AS 可通過直接殺滅病毒、抑制病毒復制、免疫調節等機制發揮抗病毒作用[15]。同時，研究表明AS 對副流感病毒[16]、人類免疫缺陷病毒[17]、柯薩奇病毒[18]等均有抑制作用。多項研究結果證明，AS 在臨床上具有獨特的研究價值和廣闊的應用前景，本研究擬明確AS 體外抗HSV-2 的作用，為抗HSV-2 感染提供新的治療思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞和病毒 成年非洲綠猴腎細胞（Vero）、HSV-2 由本實驗室保存；實驗中HSV-2 于維持液（97%DMEM+2%FBS+1%青霉素-鏈霉素溶液）中培養，滴度為10-5.5TCID50/100 μL。

1.1.2 藥物 AS（貨號：SA8980）購于北京索萊寶科技有限公司，ACV（國藥準字：H10900095）購于湖北科益藥業股份有限公司。

1.1.3 其他主要試劑和儀器 CCK-8 試劑購于北京索萊寶科技有限公司；Evo M-MLV 反轉錄試劑預混液、SYBR Green Pro Taq HS 預混型qPCR 試劑盒購于AG 艾科瑞生物。儀器設備主要為7500 Fast 熒光定量PCR 儀（美國Thermo Fisher Scientific公司），酶標儀（美國BioTek 公司），371 型CO2恒溫培養箱（賽默飛世爾科技中國有限公司），1388 A2生物安全柜（賽默飛世爾科技中國有限公司），高壓滅菌機（重慶雅馬拓科技有限公司），高速冷凍離心機（賽默飛世爾科技中國有限公司），倒置顯微鏡（尼康株式會社）。

1.2 方法

1.2.1 AS 對Vero 細胞的毒性測定 用維持液將AS 和ACV 按2 倍梯度稀釋為2-1、2-2……2-9，并以連續稀釋的AS 或ACV 溶液接種在長滿單層Vero 細胞的96 孔板中作為實驗組，不加藥物作為細胞對照組，空白對照組無細胞、無藥物。細胞培養板在37 ℃5% CO2培養箱中培養2 d。每孔加入10 μL CCK-8 試劑，1 h 后用酶標儀在450 nm 波長測定吸光度（A），Graphpad Prism 5.0 軟件計算最大無毒濃度（maximal atoxic concentration, TC0），檢測AS 對Vero細胞的毒性作用。

1.2.2 AS 抗HSV-2 活性作用測定 以2 倍梯度稀釋的AS 和ACV 分別與HSV-2 等體積混合，HSV-2病毒感染復數（multiplicity of infection, MOI）為0.1。在37 ℃5%CO2培養箱中培養2 h 后，接種于Vero細胞，細胞培養板繼續培養2 d。每孔加入10 μL CCK-8 試劑，1 h 后于450 nm 波長測其吸光度（A），GraphPad Prism 5.0 軟件計算半數有效濃度（50%effective concentration,EC50）。

1.2.3 AS 對HSV-2 病毒復制的影響 根據HSV-2復制周期的不同[10,18]，分別在病毒感染前期、病毒生物合成期、病毒吸附期、病毒進入期以及病毒釋放期加入AS 藥物，HSV-2 病毒MOI 為0.1，AS 藥物濃度為3.785 μmol/L，通過顯微鏡觀察病毒感染24 h后Vero 細胞的形態變化。病毒感染前期，Vero 細胞中加入AS 培養5 h，隨后接種HSV-2 培養1 h，棄培養上清并用PBS 清洗，用維持液培養12、24、36 h后收集細胞。病毒生物合成階段，Vero細胞中接種HSV-2 培養1 h，隨后加入AS 培養6 h，棄培養上清并用PBS 清洗，用維持液培養12、24、36 h 后收集細胞。病毒吸附階段，Vero細胞中接種HSV-2，4 ℃培養1 h 后收集細胞。病毒進入階段，Vero 細胞中接種HSV-2，4 ℃培養1 h、37 ℃培養2 h 后收集細胞。病毒釋放階段，Vero細胞中接種HSV-2培養1 h，棄培養上清并用PBS 清洗，用維持液培養6 h，加入AS 培養12、24、

36 h 后收集培養上清。同時設置維持液對照組和AS 直接滅活病毒組，AS 直接滅活病毒組是將AS 與HSV-2 混合后培養1 h，接種于Vero細胞12、24、36 h 后收集細胞，培養TRIzol 法提取細胞總RNA 測定病毒載量；培養上清進行半數組織培養感染劑量（50% tissue culture infective dose,TCID50）測定。

將提取的細胞總RNA反轉錄為cDNA，然后通過實時熒光定量PCR 擴增cDNA 來檢測HSV-2gG2 基因（型特異性抗原，常用于HSV 診斷分型）和β-actin內參基因（常作為組織細胞基因表達內參）的Ct 值，其中HSV-2gG2 基因引物序列參照文獻[19]；β-actin內參基因引物序列參照文獻[20]。采用2-△△Ct計算HSV-2 病毒mRNA 相對表達量，評估AS在HSV-2復制周期不同階段的抗病毒效果。

1.2.4 AS 對HSV-2 噬斑形成抑制實驗 以AS 和ACV 最大無毒濃度稀釋液分別與HSV-2（MOI=0.100、0.010、0.001）等體積混合，在37 ℃5% CO2培養箱中作用2 h；取病毒混合液接種Vero 細胞并孵育1 h，棄去上清，PBS 清洗，滴加1.2%甲基纖維素覆蓋細胞單層，繼續培養至72 h；用1%結晶紫溶液染色，計算斑塊，評估AS抗病毒作用。

1.2.5 AS 對HSV-2 病毒粒子超微結構的影響 用HSV-2（MOI=0.1）接種Vero 細胞，當病變程度達到90%，將細胞反復凍融，離心去除細胞沉淀，0.45μm濾膜過濾上清除菌；82 700×g，4 ℃離心2 h，棄上清，沉淀于PBS 溶解過夜；將病毒樣液用2.5%戊二醛固定送樣。TC0和EC50的AS分別與HSV-2（MOI=0.1）等體積混合，在37 ℃5%CO2培養箱中作用1 h，取病毒混合液制片，將切片放入TEM 透射電鏡中觀察并拍照。

1.3 統計分析 采用GraphPad Prism 5.0軟件對數據進行分析，計量資料以均數± 標準差（-x±s）表示，采用重復設計的方差分析對數據進行分析，對不同時間點兩組之間比較采用獨立樣本t檢驗，對多組之間比較采用單因素方差分析（組間多重比較采用LSD法），檢驗水準α=0.05。

2 結 果

2.1 AS 對Vero 細胞的毒性及抗HSV-2 活性測定AS的TC0為3.785μmol/L，陽性對照藥物ACV的TC0為1 110.100μmol/L，此時細胞存活率＞90%。AS 在1.678～3.785μmol/L抑制HSV-2的復制，AS的EC50為0.334μmol/L，ACV的EC50為0.678μmol/L（圖1）。

圖1 AS和ACV在Vero細胞中的毒性及抗病毒活性測定Figure 1 Determination of toxicity and antiviral activity of AS and ACV in Vero cells

2.2 AS對HSV-2病毒復制的影響 實驗組病毒感染前期（圖2A）、生物合成期（圖2C）添加病毒和藥物后，細胞均變圓、收縮和分離，表明存在細胞毒性。在病毒感染前期12、24和36 h，實驗組與病毒感染對照組病毒載量差異均無統計學意義（6.04±1.24vs.6.09±1.46，5.98±1.27vs.6.17±1.44，5.91±1.23vs.6.17±1.41；t=0.164、9.648、1.016，P均＞0.05）（圖3A）。在生物合成期12、24 和36 h，實驗組與病毒感染對照組病毒載量差異均無統計學意義（6.78±1.05vs.6.78±1.10，6.68±1.03vs.6.78±1.07，6.69±1.09vs.6.78±1.12；t=1.942、1.516、5.752，P均＞0.05）（圖3B）。相比其病毒感染對照組（圖2L），AS 直接滅活病毒組（圖2K）鏡檢觀察活細胞數相對較高，細胞單層在形態學上與細胞對照組更具可比性。在12、24、36 h，AS直接滅活病毒組的病毒載量低于病毒感染對照組（0.24±0.09vs.1.35±0.07；4.46±0.06vs.6.75±0.04；2.70±0.04vs.5.27±0.10），差異均有統計學意義（t=9.920、33.360、24.020，P均＜0.05）（圖3C）。在病毒吸附進入階段，病毒載量與其相應的病毒感染對照組相比，差異無統計學意義（P＞0.05）（圖3D）。在病毒釋放階段，藥物AS加入12 和36 h 后，實驗組的病毒TCID50低于病毒感染對照組（13.43±10.04vs.127.00±0.32；3.47±0.55vs.5.80±0.12），差異均有統計學意義（t=8.359、4.161，P均＜0.05）（圖3E）。

圖2 AS抗病毒活性的測定（×100）Figure 2 Determination of the antiviral activity of AS against HSV-2(×100)

圖3 通過實時熒光定量PCR和TCID50測定的AS抗病毒活性Figure 3 Measurement of the antiviral activity of AS against HSV-2 by RT-qPCR

2.3 AS 抑制HSV-2 噬斑形成 噬斑形成抑制實驗中，HSV-2（MOI=0.100、0.010、0.001）感染Vero 細胞72 h后，1%結晶紫溶液染色后細胞中的空斑數量顯著減少。不同劑量HSV-2與AS和ACV的混合液分別接種Vero細胞后空斑數量明顯減少。見圖4。

圖4 AS對噬斑形成的抑制作用Figure 4 The inhibitory effect of AS against plaque formation

2.4 AS 影響HSV-2 病毒粒子超微結構 鏡檢結果顯示，正常HSV-2 呈球形（圖5A、圖5F），最外層為典型的脂質雙層囊膜，上有刺突。有包膜的病毒直徑為150～200 nm。當用低濃度（1.678 μmol/L）AS 處理病毒時，原本呈球形的病毒粒子表面形狀發生改變（圖5B、圖5C），缺損處明顯可見（圖5G、圖5H）；當AS濃度增加時，即用高濃度（3.785μmol/L）處理病毒，病毒粒徑變小，約為70～80 nm，遠小于正常HSV-2病毒粒徑（圖5D、圖5E、圖5I、圖5J）。

圖5 透射電鏡下AS對HSV-2病毒的影響（×100 000）Figure 5 Effect of acetylshikonin on HSV-2 virions under electron microscope(×100 000)

3 討 論

近幾年來，中草藥在疾病預防及治療中的作用越來越被重視，特別是在抗擊新型冠狀病毒感染疫情期間，人參及其復方制劑等中草藥發揮了重要作用[21]，中草藥抗病毒效果及其機制研究的重要性日益凸顯。既往研究表明，AS 可以阻斷宿主細胞表面人體免疫缺陷病毒1 型進入輔助受體的表達，從而抑制病毒感染，主要作用于病毒吸附過程發揮抗病毒作用[17]；AS 還可直接滅活柯薩奇病毒A16 型，并且可以阻斷病毒在體外的吸附/穿入過程，進而有效地抗柯薩奇病毒A16 型感染[18]。紫草素酯衍生物能夠抗H1N1流感的侵襲[22]；此外，還能抑制橫紋肌肉瘤細胞中促炎細胞因子（IL-1b、IL-6、IL-8 和TNF-a）的表達，表現出對腸道病毒的抗病毒活性[23]。多項研究證實，紫草素及其衍生物具有廣譜的抗病毒活性，可以通過多種抗病毒途徑或機制實現，本研究同樣表明，AS 對HSV-2 具有一定的抗病毒效應。

HSV-2 是人類皰疹病毒家族中α 亞族的一種嗜神經性雙鏈DNA 病毒，由包膜、被蓋、衣殼和雙鏈DNA 分子組成[24]。病毒通過吸附、穿入、脫殼、生物合成、組裝與釋放這五個主要階段完成病毒在宿主體內的復制。本研究用HSV-2 感染Vero 細胞，用安全濃度范圍內的AS 處理被感染的細胞，結果表明，AS 能有效抑制HSV-2 對Vero 細胞的感染。此外，病毒感染細胞主要表現為致細胞病變和噬斑形成，AS 可保護細胞免受病毒誘導的細胞損傷并且可以顯著降低病毒感染引起的空斑數量，對MOI 為0.001～0.100 的HSV-2，AS 均具有抑制作用。AS 對HSV-2 不同復制階段的抑制作用，主要表現在AS直接滅活病毒顆粒時可降低細胞里的病毒載量，在病毒釋放階段對子代病毒有一定抑制作用，體現出良好的體外抗HSV-2活性。透射電鏡結果證實，AS 對病毒的形態結構具有破壞作用，并且隨著藥物濃度的增加，對病毒的損傷逐漸明顯，說明AS對HSV-2的抗病毒作用可能是通過改變病毒顆粒的包膜結構，降低病毒的感染能力。由此推測，AS 破壞病毒包膜可能是抑制HSV-2 的作用機制之一。

綜上，一定濃度范圍內的AS 可以在體外直接抑制病毒，然而本次研究表明AS 仍有其局限性，其細胞毒性較強，且雖然表現出較強的體外直接抗病毒作用，但對病毒感染沒有預防作用。AS 在體外對病毒的直接抑制作用可為開發治療2 型單純皰疹病毒感染新藥物提供新思路，但更深入的抗病毒作用機制尚需進一步研究。

利益沖突聲明全部作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明廉梅芳負責實驗實施、數據整理、論文撰寫；鄭文學參與實驗實施與數據分析；李娟、時黎明、李桂霞參與實驗指導；于廣福負責實驗設計、論文修改