我國弓形蟲Chinese 1優勢基因型感染對小鼠組織中微量金屬元素代謝的影響

幸憶恩，蔡亦紅

安徽醫科大學公共衛生學院衛生檢驗與檢疫學系，安徽醫科大學病原生物學安徽省重點實驗室，安徽醫科大學人畜共患病安徽高校省級重點實驗室，安徽 合肥 230032

剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種專性細胞內寄生的原蟲，感染全球超過30%的人口，相關疾病負擔較高[1-2]。速殖子是弓形蟲的快速增殖階段，可通過血流播散并感染中樞神經系統、眼、骨骼、心肌、胎盤以及肝、腎等組織和器官[3-4]。弓形蟲還可長期潛伏在腦、心臟和肌肉等人體組織中，以緩殖子的形式存在，當機體免疫力下降或環境刺激時會被再次激活，引發嚴重疾病，甚至致死[5]。弓形蟲在全球普遍存在，不同地區基因型差異明顯[6]，Chinese 1 型（ToxoDB#9）是我國弓形蟲的優勢基因型蟲株，其中TgCtwh6為成囊株[7]。

微量金屬元素，如銅、鋅、鐵、錳等，是維持細胞正常功能的重要元素，也是哺乳動物發育的關鍵調節劑[8-9]。本課題組前期研究發現，小鼠急性感染Chinese 1 型弓形蟲TgCtwh3、TgCtwh6 會誘導體內各組織微量元素含量發生改變，說明蟲體入侵會打破機體內微量元素穩態，進一步誘導宿主新陳代謝紊亂[10-11]。本研究主要通過構建我國流行的弓形蟲優勢基因型Chinese 1 型弱毒株（TgCtwh6）感染小鼠模型，分別在感染急性期和慢性期測定小鼠心臟、肝臟、脾臟和腎臟中Cu2+、Zn2+、Fe2+、Mn2+、Mg2+等金屬元素含量，并進一步探討不同感染階段金屬元素含量的改變，以及對宿主功能代謝的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗小鼠 6 周齡雌性C57BL/6J 小鼠，體重17～21 g，購于杭州子源實驗動物科技有限公司（生產許可編號：SCXK2019-0004)。小鼠飼養條件：光照12 h/黑暗12 h 循環，相對濕度40%～60%，溫度18～26 ℃，能隨意獲得食物。

1.2 弓形蟲蟲株 TgCtwh6 蟲株（ToxoDB#9）為本實驗室液氮保種，復蘇后直接于昆明鼠腹腔內注射傳代，經傳2～3 代后用于正式實驗。TgCtwh6株包囊鼠由本課題組傳代保存，取TgCtwh6蟲株保種小鼠腦組織，用5 mL PBS 通過200 目無菌濾網進行研磨勻漿，光鏡下對包囊進行觀察和計數，再以無菌PBS稀釋勻漿。

1.3 主要試劑與儀器 硝酸（HNO3，優級純，批號：220712）、30%雙氧水（30%H2O2，分析純，批號：221023）購自國藥集團化學試劑有限公司；24 種多元素混合外標溶液（濃度：100 μg/mL，批號：220315）和7種多元素混合內標溶液（濃度：10μg/mL，批號：220517）購自國家有色金屬及電子材料分析測試中心；鼠源辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase,HRP）標記的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydroge-nase, GAPDH）單抗（批號：1000292）購于武漢三鷹生物技術有限公司；兔源ZIP 8 單抗（批號：00045855）購于美國Proteintech 公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性檢測試劑盒（批號：202210）購于江蘇酶免實業有限公司；渦旋混合器（型號：XW-80A）購自上海馳唐電子有限公司；分析天平購自METTLER TOLEDO 有限公司；純水儀（型號：HK-UV-20）購自合肥宏科科技有限公司；36 孔石墨消解儀（型號：ST36-iTouch）購自Digi Block 公司；Clin-ICP-QMS-Ⅰ微量元素分析儀（型號：Ⅰ型）購自北京毅新博創生物科技有限公司。

1.4 小鼠模型的建立 將18 只雌性C57BL/6J 小鼠在標準條件下適應性喂養1 周后，隨機分為對照組、感染急性期組和感染慢性期組，每組6 只。對照組小鼠每只經口灌胃200 μL無菌生理鹽水，1個月后頸椎脫臼處死，收集小鼠心臟、肝臟、脾臟和腎臟；TgCtwh6 感染急性期組小鼠每只經口灌胃200 μL無菌生理鹽水懸液（內含約20 個TgCtwh6 包囊），模型建立后每天觀察小鼠狀態，約1～2 周發現有豎毛、弓背、行動遲緩、畏光等現象時，頸椎脫臼處死，收集小鼠心臟、肝臟、脾臟和腎臟；TgCtwh6感染慢性期組小鼠每只經口灌胃200 μL 無菌生理鹽水懸液（內含約20 個TgCtwh6 包囊），感染1 個月后，頸椎脫臼處死，收集小鼠心臟、肝臟、脾臟和腎臟。收集的所有臟器經液氮速凍后轉移至-80 ℃保存。

1.5 小鼠組織內金屬元素測定 取出-80 ℃保存的小鼠臟器，用超純水清洗3 次，濾紙吸干表面水分，準確稱取0.1 g 組織，分別轉移至玻璃消解管，每個樣品分3 次加入混酸溶液（HNO3與H2O2的體積比為2∶1），共3 mL。置于36 孔石墨消解儀加熱消解，當組織消解完畢且消解管內溶液約為0.5 mL時取出消解管，待冷卻后使用超純水定容。用Clin-ICP-QMS-Ⅰ微量元素分析儀測定并計算Fe2+、Cu2+、Mn2+、Zn2+、Mg2+含量，各元素含量（μg/g）=樣品元素濃度（μg/mL）×樣品定容體積（mL）/樣品質量（g）。

1.6 ZIP 8（Zrt-and-Irt-like protein 8）蛋白表達測定用組織總蛋白提取試劑盒提取肝臟組織總蛋白，BCA 法檢測蛋白濃度。采用Western blot 檢測ZIP 8 蛋白表達，將三組小鼠的肝臟蛋白樣本進行SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白后轉印到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h，TBST洗膜3 次（10 min/次）后，使用ZIP 8 單抗（1∶1 000），4 ℃孵育過夜，同上洗滌后，將膜轉至1∶10 000稀釋的羊抗鼠二抗中室溫孵育1.5 h，最終用凝膠成像儀成像。

1.7 SOD 活性測定 稱取0.1 g 小鼠肝臟組織，加入0.9 mL的PBS，充分勻漿，1 000×g離心20 min，收集上清。按照超氧化物歧化酶活性試劑盒說明書采用分光光度法測定肝臟SOD活性。

1.8 圖像與數據分析 使用Image J 1.8.0 軟件對Western blot 結果進行分析。使用GraphPad Prism 6.02 軟件進行數據統計分析，多組間均數采用方差分析，若差異有統計學意義，采用Bonferroni 法進行兩兩比較，檢驗水準α=0.05。

1.9 倫理學聲明 所有程序嚴格遵循安徽醫科大學動物中心生物醫學研究所機構審查委員會制定的倫理標準（許可證號：AMU26-081108）。

2 結 果

2.1 TgCtwh6 感染小鼠模型的構建 TgCtwh6 感染小鼠發病后，將其頸椎脫臼處死，無菌狀態下取小鼠腹水，取10 μL 腹水在載玻片上制片，顯微鏡下可觀察到TgCtwh6速殖子，說明急性期感染模型構建成功（圖1A）；TgCtwh6 感染小鼠1 個月后，在小鼠腦組織勻漿中可觀察到包囊的形成，說明慢性期感染模型構建成功（圖1B）。

圖1 TgCtwh6感染小鼠模型的構建Figure 1 Construction of TgCtwh6 infected mice model

2.2 TgCtwh6感染小鼠不同組織金屬元素含量

2.2.1 Fe2+含量 三組小鼠肝臟、脾臟和腎臟內Fe2+含量組間差異均有統計學意義（F=21.420、6.881、5.196，P均＜0.05）。急性期組和慢性期組肝臟內Fe2+含量分別為（76.348±11.613）μg/g 和（88.545±10.555）μg/g，高于對照組的（52.388±6.165）μg/g；急性期組和慢性期組脾臟內Fe2+含量分別為（128.519±13.531）μg/g 和（120.309±10.023）μg/g，低于對照組的（147.720±15.303）μg/g；急性期組腎臟內Fe2+含量為（39.918±3.120）μg/g，低于慢性期組的（46.352±4.816）μg/g，差異均有統計學意義（P均＜0.017）。心臟內Fe2+含量組間差異無統計學意義（F=1.293，P＞0.05）。見圖2A。

2.2.2 Cu2+含量 三組小鼠心臟內Cu2+含量組間差異有統計學意義（F=8.558，P＜0.05），急性期組和慢性期組分別為（5.189±0.255）μg/g和（5.631±0.485）μg/g，低于對照組的（6.440±0.740）μg/g，差異均有統計學意義（P均＜0.017）。肝臟、脾臟和腎臟組間差異均無統計學意義（F=2.805、1.367、1.993，P均＞0.05）。見圖2B。

2.2.3 Mn2+含量 三組小鼠心臟和肝臟內Mn2+含量組間差異均有統計學意義（F=3.977、23.180，P均＜0.05）。急性期組小鼠心臟內Mn2+含量為（0.605±0.052）μg/g，低于對照組的（0.686±0.051）μg/g；急性期組和慢性期組肝臟內Mn2+含量為（1.298±0.065）μg/g 和（1.405±0.066）μg/g，高于對照組的（1.141±0.110）μg/g，差異均有統計學意義（P均＜0.017）。脾臟和腎臟組間差異均無統計學意義（F=0.535、3.332，P均＞0.05）。見圖2C。

2.2.4 Zn2+含量 三組小鼠心臟和肝臟內Zn2+含量組間差異有統計學意義（F=11.550、8.125，P均＜0.05）。急性期組和慢性期組小鼠心臟內Zn2+含量分別為（17.034±0.974）μg/g和（16.858±0.953）μg/g，低于對照組的（19.258±0.965）μg/g；急性期組和慢性期組小鼠肝臟內Zn2+含量分別為（17.506±0.824）μg/g和（17.031±0.907）μg/g，高于對照組的（15.650±0.305）μg/g，差異均有統計學意義（P＜0.017）。脾臟和腎臟組間差異無統計學意義（F=0.878、0.013，P均＞0.05）。見圖2D。

2.2.5 Mg2+含量 三組小鼠心臟內Mg2+含量組間差異有統計學意義（F=4.084，P＜0.05），急性期組為（153.346±3.221）μ g/g，低于對照組的（163.012±8.204）μg/g，差異有統計學意義（P＜0.017）；肝臟、脾臟和腎臟組間差異均無統計學意義（F=1.612、0.247、2.380，P均＞0.05）。見圖2E。

2.3 TgCtwh6 感染小鼠肝臟組織中ZIP 8 蛋白表達 Western blot 結果表明，對照組、急性期組和慢性期組小鼠肝臟ZIP 8相對表達量組間差異有統計學意義（F=35.240，P＜0.05）。急性期組和慢性期組均高于對照組，且慢性期組高于急性期組，差異均有統計學意義（P均＜0.017）。見圖3。

圖3 肝臟中ZIP 8蛋白相對表達量差異Figure 3 Difference of ZIP 8 relatively expressed in the liver

2.4 TgCtwh6感染小鼠肝臟組織中SOD 活性 對照組、急性期組和慢性期組小鼠肝臟SOD 活性分別為（14.041±0.734）U/mL、（16.463±0.616）U/mL和（15.859±0.780）U/mL，組間差異有統計學意義（F=9.370，P＜0.05），急性期組和慢性期組均高于對照組，差異均有統計學意義（P均＜0.017）。

3 討 論

在弓形蟲急性感染期，快速生長的速殖子通過血流播散并感染如中樞神經、眼睛、骨骼、心臟以及胎盤等多處組織，可引起強烈的炎癥反應并造成組織破壞，從而引發相應的臨床表現。急性發病期后，蟲體可長期潛伏在宿主體內形成緩殖子，緩殖子被厚厚的包囊壁包圍，在腦、心臟和骨骼肌中持續存在，并且緩殖子還可從包囊中被釋放出來，發育增殖為速殖子，引起眼病、腦病等[12]。本研究通過構建弓形蟲感染急性和慢性期小鼠模型，觀察不同組織中微量金屬元素留存情況，進一步探索弓形蟲不同感染狀態下，宿主代謝功能的改變，為研究弓形蟲病的發病機制提供線索。

生物金屬元素是幾乎所有細胞生長過程中蛋白質的輔助因子，在寄生蟲和宿主細胞的代謝中都扮演著十分重要的角色，生物金屬元素的攝取、流失及轉運與疾病進展密切相關[10]。鐵元素與免疫細胞功能相關，當機體受感染時，巨噬細胞中輸出鐵元素可激發機體抗菌潛力[13]。鋅元素參與細胞凋亡的調節，具有抗氧化和抗炎作用[14]。本研究發現，在弓形蟲感染急性和慢性期，小鼠不同組織中各微量金屬元素均發生了不同水平的改變。通過對急性和慢性期金屬元素含量進行分析，發現相較于對照組，感染急性和慢性期小鼠肝臟中錳元素均上調，且慢性期錳元素上調更明顯。錳元素是細胞活動的必需微量元素，在物質代謝中起著重要作用，錳元素缺乏會增加細胞對氧化損傷的敏感性，導致細胞產生SOD 的能力下降，促進細胞損傷[15]。最新研究表明，缺乏錳元素的小鼠體內腫瘤細胞生長加快，外源性添加錳元素則可有效激活人或小鼠抗原遞呈細胞的cGAS-STING 通路，增強NK 細胞的免疫監視作用，促進細胞毒性T 細胞的浸潤和腫瘤特異性殺傷功能[16]。弓形蟲慢性感染后小鼠肝組織內錳元素含量上調是否是機體在抵抗寄生蟲感染過程中啟動免疫細胞功能的自我保護策略，有待進一步研究。

細胞攝取微量金屬元素必須通過相應的轉運體進行運輸，如ZIP 家族[17]。ZIP 8 是ZIP 家族金屬轉運蛋白的成員之一，可轉運鋅、錳和鐵等[18]。ZIP 8 在宿主防御病原體感染中發揮作用，有研究表明ZIP 8 的缺失會導致感染肺炎鏈球菌的小鼠炎癥反應增加、組織損傷加重[19]。前期研究已證明弓形蟲Chinese 1 型另一蟲株TgCtwh3 感染急性期小鼠肝細胞膜上的ZIP 8可通過轉運鋅對肝臟起保護性作用[11]。本研究中也發現小鼠肝臟中ZIP 8 的表達在弓形蟲TgCtwh6感染急性和慢性期均上調，且慢性感染期上調更為顯著。同時，本研究發現在弓形蟲感染后小鼠肝臟中通過ZIP 8 轉運的鋅、鐵等其他元素含量也有所上調，這與ZIP 8 表達上調的結果一致。

SOD 是有氧代謝系統中的抗氧化物酶之一，根據活性中心所含金屬離子的不同，分為Cu/Zn-SOD、Mn-SOD 和Fe-SOD 三種，前兩者可存在于真核細胞生物，后者存在于原核生物中[20]。本研究發現急性和慢性感染期小鼠肝臟SOD 活性均上調，可能由于感染小鼠肝臟內ZIP 8 表達上調，導致多種金屬含量增加，使得Cu/Zn-SOD和Mn-SOD的活性被激活。雖然錳元素的含量在感染慢性期上調更為明顯，但是急性期和慢性期SOD 活性差異無統計學意義，可能由于Cu/Zn-SOD 主要存在于胞漿內，而Mn-SOD 則存在于線粒體中。有待進一步檢測急性和慢性感染期線粒體中Mn-SOD 的活性差異，從而探索不同感染狀態下的致病機制。

綜上，我國弓形蟲優勢基因型Chinese 1 弱毒株（TgCtwh6）感染小鼠在急性和慢性感染期肝組織內ZIP 8 表達上調，多種金屬元素含量受調節，SOD 活性被激活。本研究從體內微量元素代謝的角度，初步探索了蟲體與宿主之間的相互關系，為進一步研究弓形蟲的致病機制提供了新的方向。

利益沖突聲明全部作者聲明無利益沖突

作者貢獻聲明幸憶恩負責研究實施及論文撰寫；蔡亦紅負責研究設計和論文撰寫指導