GC-MS法測定溴地斯的明原料藥中基因毒性雜質溴甲烷

唐新茹　丁倩倩　金紅蘭　黃曉光　王雪　孫雪　楊慧

摘 要：采用氣相色譜-質譜聯用技術測定溴地斯的明原料藥中溴甲烷的殘留量，應用HP-1ms（30 m×0.25 mm×1.0 μm）毛細管柱分離樣品，設置起始柱溫為40 ℃、載氣為氦氣、柱流量為1.0 mL/min，質譜檢測方式為選擇性離子檢測（SIM），目標離子的m/z為94。結果表明，在此色譜條件下，溴甲烷與溴乙烷及相鄰雜質峰之間能較好分離，且空白溶劑、溴地斯的明不干擾檢測；溴甲烷的線性關系在10.00～100.00 ng/mL區域內表現良好（r=0.999）；平均回收率為98.53%（相對標準偏差RSD=1.26%，n=9）；檢測限和定量限分別是1.50、3.00 ng/mL。由此可得結論，該測定方法專屬性較好、靈敏度高，能用于溴地斯的明中溴甲烷的檢測。

關鍵詞：溴地斯的明；溴甲烷；氣相色譜-質譜聯用法；基因毒性雜質

溴地斯的明（Distigmine Bromide）的分子式為C₂₂H₃₂Br₂N₄O₄，相對分子質量為576.32。溴地斯的明片中溴地斯的明的質量分數不低于95.00%且不超過標示量的105.00%[1]。溴地斯的明是一種人工合成的可逆性膽堿酯酶抑制劑，屬于氨基甲酸酯類，由Schmid于1950年首次合成。其化學結構由兩個吡啶斯的明分子組成，由環氧亞甲基結構連接。在一些亞洲和歐洲國家，包括日本和德國，其主要臨床適應癥是重癥肌無力[2-3]。然而，其在日本也被用于治療青光眼和膀胱活動不足，特別是用于治療下尿路功能障礙以及手術、脊髓損傷和糖尿病引起的神經源性膀胱活動不足，還可以有效治療藥物和前列腺增大所致的尿液排泄功能障礙[4]。

溴甲烷（Bromomethane）又名甲基溴，是一種有機化合物，味甜，無色，可用在土壤中熏蒸殺蟲[5-6]。其主要損傷人體的呼吸道，中毒患者的臨床表現為頭痛惡心、四肢無力、頭暈及走路不穩、言語不清及酒醉感，嚴重者會出現高熱、意識模糊、癲癇甚至多種器官損傷[7]。溴甲烷的沸點是4.0 ℃，氣體的穿透力很強，因為不易燃易爆，所以可用作滅火劑、冷凍劑及甲基化劑等[5]；基因毒性雜質能直接破壞DNA并引起突變、重組，能間接引起染色體斷裂最終致癌變及致突變性的物質[8-9]；安全閾值很低，低濃度即可導致癌變。隨著法律法規的逐漸完善，對基因毒性雜質的檢測要求越來越嚴格，充分合理的基因毒性雜質研究決定了產品是否可以上市，這對企業的監管要求也更高[10]。因此，建立一種能對溴地斯的明中的溴甲烷殘留量進行準確檢測的方法是必要的。根據人用藥品注冊技術要求國際協調會（International Conference on Harmonization，ICH）[11]M7指南確定溴甲烷的限度，因為未查詢到溴甲烷的TD50數值，所以采用日安全劑量1.5 μg進行計算。溴地斯的明的最大日劑量為20 mg，遺傳毒性雜質溴甲烷的限度約為75×10^-6。鑒于對溴甲烷的嚴格控制要求，確定溴甲烷的限度為1×10^-6。比較常見的原料藥中基因毒性雜質檢測方法有高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）和氣相色譜（Gaschromatography，GC）等，但溴地斯的明中的溴甲烷限度較低，常規的單一儀器檢測方法靈敏度和專屬性達不到要求。因此，本研究建立了氣相色譜-質譜聯用法（Gas Chromatograph-Mass Spectrometer，GC-MS）對溴甲烷進行測定，且該檢測方法經過方法學驗證能準確、可靠地檢測溴甲烷的含量，為溴地斯的明中其他基因毒性雜質的檢測提供參考[12-14]。

1?儀器與試劑

1.1? 試驗儀器

氣相色譜-質譜聯用儀（7010B-8890，Agilent公司）；毛細管色譜柱（HP-1ms）；電子天平（BT-125D型，Sartorius公司）。

1.2? 試驗試劑

乙醇（色譜純，Eternal公司）；溴甲烷（批號：218061559，AccuStandard公司）；溴乙烷（687432，Dr.Ehrenstorfer GmbH公司）；溴地斯的明（批號：220706、220712、220713，吉林省博大偉業制藥有限公司）。

2?方法與結果

2.1? GC-MS條件

2.1.1? 色譜條件

采用規格為30 m× 0.25 mm×1.0 μm的HP-1ms毛細管柱，載氣為氦氣，柱流量為? ? ?1 mL/min；進樣口溫度為200 ℃；頂空平衡溫度為50 ℃，平衡時間為20 min；初始柱溫為? 40 ℃，維持3 min；以25 ℃/min升至290 ℃，維持5 min。

2.1.2? 質譜條件

采用電離源EI，離子源溫度為230 ℃，傳輸線溫度為290 ℃，四級桿溫度為150 ℃，電離電壓為70 eV，碰撞器為氮氣，溶劑延遲1 min，采集模式為選擇性離子檢測（Selected Ion Monitor，SIM），溴甲烷的采集離子為97，溴乙烷的采集離子為108。

2.2? 溶液配制

2.2.1? 對照品溶液的制備

精確稱取適量溴乙烷加乙醇稀釋，制成每1.00 mL中約含溴乙烷1 mg的溶液，再精確量取適量溴乙烷加水稀釋，制成每1.00 mL中約含溴乙烷100 ng的溶液，作為內標溶液；精確量取適量溴甲烷對照品溶液，用內標溶液稀釋，配制成每1.00 mL中約含50 ng溴甲烷的溶液，精確量取2.00 mL作為對照品溶液。

2.2.2? 供試品溶液的制備

精確稱取適量溴地斯的明，加溴乙烷定位溶液溶解，再用溴乙烷定位溶液稀釋至適當濃度，精確量取2.00 mL置于頂空瓶中作為供試品定位溶液。

2.2.3? 混標溶液的制備

精確稱取適量溴地斯的明，加溴乙烷定位溶液溶解并稀釋至適當濃度，精確加入適量溴甲烷對照品，搖勻，精確量取2.00 mL作為混標溶液。

2.3? 方法學考察

2.3.1? 專屬性考察

分別精確量取配制好的供試品溶液2.00 mL、溴甲烷對照品溶液2.00 mL、溴乙烷對照品溶液2.00 mL、混標溶液2.00 mL置于頂空瓶中，進樣結果如圖1—5所示。

結果表明，在此色譜條件下，溴甲烷與溴乙烷及相鄰雜質峰之間能較好地分離，且空白溶劑、溴地斯的明不干擾檢測。

2.3.2? 檢測限和定量限試驗

精確量取適量溴甲烷對照品溶液及溴乙烷并稱定，用水稀釋至不同濃度，按規定色譜條件進樣，主成分信噪比約為10∶1及3∶1時的進樣質量濃度分別為定量限及檢測限。測定結果表明，溴甲烷的檢測限為1.50 ng/mL、定量限為3.00 ng/mL，溴乙烷的檢測限為5.04 ng/mL、定量限為10.08 ng/mL。

2.3.3? 線性關系考察

精確量取適量溴甲烷對照品溶液，以內標溶液稀釋成每1.00 mL中約含溴甲烷500 ng的溶液，作為線性儲備液。精確量取線性儲備液0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，用內標溶液稀釋并定容。分別精確量取上述溶液各2.00 mL置于頂空瓶中，密封，50 ℃預熱20 min，頂空進樣，記錄結果。以質量濃度為橫坐標，以溴甲烷與溴乙烷峰面積的比值為縱坐標，結果線性回歸方程為：Y=0.023X－0.098，相關系數r=0.999。所得結果表明當進樣量為2.00 mL時，在10.00～100.00 ng/mL范圍內，質量濃度與峰面積比值呈良好的線性關系。

2.3.4? 精密度試驗

首先，精確量取適量溴甲烷對照品溶液，以內標溶液稀釋成每1.00 mL中約含50 ng溴甲烷的溶液，作為精密度試驗溶液。其次，精確量取2.00 mL置于頂空瓶中，按照設定的色譜條件連續測定6次，測得溴甲烷相對標準偏差（Relative Standard Deviation，RSD）為3.94%，溴乙烷RSD為8.98%，峰面積比值RSD為6.03%，儀器精密度良好（n=6）。

2.3.5? 重復性試驗

取溴地斯的明約100 mg，精確稱定，置于頂空瓶中，精確加入內標液2.00 mL，振搖使其溶解，密封，作為供試品溶液；另按精密度試驗方法配制對照品溶液；頂空平衡溫度為50 ℃，平衡時間為20 min，分別取對照品溶液和供試品溶液頂空進樣測定，記錄色譜圖，連續測定6次，按內標法計算溴甲烷殘留量。結果顯示，6次測定溴甲烷的檢出量RSD為5.86%，重復性良好。

2.3.6? 回收率試驗

精確稱取供試品約250 mg置于5.00 mL容量瓶中，用內標液稀釋“線性試驗”項下的線性儲備液0.25、0.50、? ? 0.75 mL各3份，并定容，振搖使其溶解，作為低、中、高3種質量濃度的溶液（分別為限量質量濃度的50.00%、100.00%、150.00%）。另按上述方法制備對照品溶液，各精確量取2.00 mL，置于頂空瓶中，密封，50 ℃預熱? ? ? ?20 min，頂空進樣測定，計算回收率。測定結果如表1所示。該結果表明，9份樣品溴甲烷平均回收率為98.53%，RSD為1.26%，回收率符合要求。

2.3.7? 中間精密度試驗

按照重復性測定方法，由另一試驗人員另取6份供試品溶液進行測定，合并計算12次測定結果。結果表明，12次測定溴甲烷的檢出量RSD為5.30%，中間精密度良好。

2.3.8? 耐用性試驗

在柱流速和溫度發生微小變化時，分別精確量取對照品溶液和供試品溶液各2.00 mL，置于頂空瓶中，密封，50 ℃預熱20 min，頂空進樣，記錄色譜圖，觀察色譜條件發生的微小變化，溴甲烷的檢出量在0.12%～0.15%，影響不大，故耐用性良好。

2.3.9? 樣品測定

取3批溴地斯的明（220706/220712/220713）配成供試品溶液，按規定的色譜條件進樣，3批樣品中溴甲烷的質量分數分別為0.000 005%、0.000 004%、0.000 007%，表明3批樣品中溴甲烷的殘留量均符合標準。

3?討論

3.1? 監測離子的選擇

精確稱取適量溴甲烷對照品溶液及溴乙烷，頂空進樣并分析。采用SCAN全掃描模式在50～150 amu質量掃描范圍內對溴甲烷、溴乙烷進行測定，所得質譜如圖6、圖7所示，定性分析確定溴甲烷的定量離子（m/z）為94，溴乙烷的定量離子（m/z）為108。

3.2? 各參數條件的篩選

毛細管柱的選擇很重要，不同毛細管柱（VF-624ms、VF-WAXms）對溴甲烷的影響很大，會出現響應值低和空白溶劑存在干擾的情況。HP-1ms毛細管柱檢測出的峰形較好，空白溶劑不干擾檢測，專屬性強，故采用此毛細管柱。

在其他色譜條件的摸索過程中，首先采用的是不分流進樣，發現色譜峰的響應值不符合要求，峰形不完整。若采用分流進樣，當分流比為15∶1時，溴甲烷和溴乙烷能分離出來，且響應值正常，故采用分流進樣。

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