穩定表達PRRSV GP2蛋白的Marc-145細胞系的構建

烏東高娃，溫永勝，郭 昊，劉春羽，趙洪哲，王鳳雪，溫永俊

（1.內蒙古農業大學獸醫學院，呼和浩特 010018；2.內蒙古元山生物科技有限公司，呼和浩特 010018）

豬繁殖與呼吸綜合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）引起的一種高度傳染性疾病，也是全球最重要的動物病原體之一[1-2]。其臨床癥狀為母豬嚴重的繁殖障礙，斷奶仔豬普遍發生肺炎、生長遲緩以及死亡率增加[3-4]。自從發現該病毒以來，在流行病學和分子學研究方面已經取得了重大進展，但是尚無有效的防治措施來消除這種病毒的感染[5]。在PRRSV中，全長單鏈基因組RNA的長度為15 kb左右，帶有5'帽子結構和3'聚腺苷酸化尾巴結構。具有10個開放閱讀框（ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7），分別編碼PP1a、PP1ab、GP2a、E、GP3、GP4、GP5、ORF5a、M和N蛋白，兩側為5'和3'非翻譯區[6-9]。

GP2a蛋白由ORF2a編碼，分子量為29～30 kDa[10]，GP2a與GP2為同一種蛋白，只是不同文章的表述差異。GP2a為具有Ⅰ端信號序列和C端膜錨的推定的Ⅰ類整合膜蛋白，包含兩個預測的N-糖基化位點[11]。PRRSV GP2通過二硫鍵和GP3、GP4在包膜表面組裝形成同源或異源多聚體（GP2-GP3-GP4復合物），對于病毒進入易感宿主細胞至關重要[10]。與GP3、GP4等其他結構蛋白相比，GP2蛋白的異質性較低。它由預測的N端信號序列，168個殘基的胞外域，一個跨膜（TM）螺旋和20個殘基的內域組成[12]。

Bautista等[13]使用痘苗病毒為表達載體，驗證了GP2多肽可以誘導T淋巴細胞增殖。Das等[14]研究表明小包膜糖蛋白GP2a和GP4與受體CD163特異性相互作用。Welch等[15]利用感染性基因克隆的研究缺失ORF2基因，發現GP2蛋白對病毒的復制必不可少。劉益民[16]發現GP2羧基端10個氨基酸的缺失，不影響重組病毒Marc-145細胞上的生長復制，也不改變重組病毒的中和抗原，推斷GP2蛋白可能與PRRSV侵染宿主細胞和調控宿主免疫反應有關。

1 材料和方法

1.1 質粒和細胞 Marc-145細胞、HEK293FT細胞、慢病毒載體pLV-EF1a -EGFP-2A、pMD2.G質粒、pSPAX2質粒均由內蒙古農業大學獸醫學院傳染病實驗室保存；Trans5α感受態細胞購自TOLOBIO公司。

1.2 主要試劑 PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase購自TaKaRa公司；限制性內切酶、T4 DNA Ligase購自NEB公司；Plasmid Mini Kit、Gel Extraction Kit購自OMEGA公司；Lipofectamine 3000購自Invitrogen公司；TIANamp Genomic DNA Kit購自天根生化科技（北京）有限公司；細胞培養基DMEM、細胞培養基MEM、新生胎牛血清GIBCON FBS購自Invitrogen公司；胎牛血清FBS（CLARK）購自Bioscience公司；0.25%胰酶、0.05%胰酶購自Biological Industries公司。

1.3 重組慢病毒質粒的構建 根據慢病毒載體pLVEF1a-EGFP-2A序列選取單一的酶切位點NotⅠ和BamHⅠ，并根據PRRSV感染性克隆pJXwn06設計ORF2的特異性擴增引物：ORF2-F：5'-AAGGA AAAAAGCGGCCGCATGAAATGGGGTCTATGC AA-3'，ORF2-R：5'-CGCGGATCCTCACCATGA GmTTCAAAAG-3'，下劃線為限制性內切酶識別位點。以感染性克隆pJXwn06為模板，通過特異性引物PCR擴增PRRSVORF2基因序列。PCR反應條件：94℃預變性2 min；98℃變性10 s，60℃退火15 s，68℃延伸50 s，35個循環；68℃再延伸7 min。擴增的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收目的條帶。將慢病毒載體pLV-EF1a-EGFP-2A以及膠回收產物用NotⅠ和BamHⅠ雙酶切，膠回收酶切產物并用T4 DNA連接酶連接，轉化于Trans5α感受態細胞，取100 μL涂布于氨芐抗性的LB培養平板。12 h后挑取單個菌落接種到液體培養基中進行搖菌，菌液提取質粒后進行雙酶切鑒定，將鑒定正確的陽性樣品進行雙向測序。將測序正確的質粒命名為pLVEF1a-EGFP-2A-GP2。

1.4 慢病毒的包裝 將HEK293FT細胞接種到T25小瓶，當細胞密度達到90%時進行轉染。設置pLVEF1a-EGFP-2A質粒為陽性對照，按照Lipofectamine 3000試劑盒說明，將pLV-EF1a-EGFP-2A-GP2（10 μg）、pMD2.G（5 μg）、psPAX2（5 μg）三質粒共轉染HEK293FT細胞，6 h后更換新鮮2%FBS DMEM維持液。觀察48 h，收集病毒上清液后更換新鮮維持液，72 h再次收集病毒上清液。離心去除細胞殘渣，于-80℃保存。

1.5 測定嘌呤霉素的殺滅曲線 嘌呤霉素在哺乳動物細胞上的推薦使用濃度為1～10 μg/mL，不同細胞嘌呤霉素的工作濃度也不同，因此需要殺滅曲線來確定。將Marc-145細胞接種到24孔板，12 h后棄掉原培養基，加入新鮮的不同濃度嘌呤霉素（1～10 μg/mL，共設置10個梯度濃度）篩選培養基進行孵育。根據細胞的生長狀態，每2～3 d更換一次含有嘌呤霉素的10%FBS MEM培養基。每日監測細胞生長狀態，觀察細胞存活率，從而篩選4～6 d內有效殺死所有非轉導細胞的嘌呤霉素最低工作濃度。

1.6 慢病毒轉導和細胞克隆 將狀態良好的Marc-145細胞接種到6孔板，當細胞密度達到80%時進行轉導。將收集的慢病毒液放置冰上慢慢融化，棄掉6孔板中原有的培養基，加入混有1/2病毒原液的新鮮培養基感染細胞，37℃感染4 h，補齊培養基。24 h后棄掉孔內的原有培養基，加入新鮮維持液繼續培養。感染48 h后棄去原培養基，更換為新鮮的含有嘌呤霉素的10%FBS MEM培養，每天觀察細胞狀態，待陰性對照的細胞全部死亡后終止篩選。將篩選出來的細胞制成細胞懸液，取樣進行臺盼蘭染色和計數。取部分細胞進行有限稀釋并加入96孔板，使細胞含量分別2個/孔、1個/孔和0.5個/孔。每天觀察細胞克隆的生長情況，選擇只有一個細胞生長的孔，棄掉兩個以上和沒有細胞生長的孔，兩周后將生長狀態良好的細胞擴大培養并傳代，傳至10代后對細胞系進行鑒定。

1.7 細胞系的PCR鑒定 將Marc-145 細胞作為陰性對照，用TIANamp Genomic DNA Kit提取Marc-145細胞以及細胞系的DNA并進行PCR擴增，鑒定ORF2基因是否成功整合到宿主細胞染色體。PCR 反應條件參考步驟1.3。將PCR擴增的產物混合10× loading buffer進行1%瓊脂糖凝膠電泳，并使用凝膠成像系統檢測分析結果。

1.8 細胞系的蛋白免疫印跡（Western blot）鑒定 本實驗設置空載轉染Marc-145細胞及Marc-145細胞作為對照。挑選PCR鑒定陽性的細胞系，用高效RIPA裂解液裂解，混合 5×loading buffer 高溫煮樣后進行12%的SDS-PAGE電泳，轉移至 PVDF膜，5%脫脂乳室溫封閉4 h，PBS洗滌3遍，GP2單克隆抗體（1∶1000倍稀釋）37℃孵育2 h，PBST洗滌3次，每次15 min。HRP 標記山羊抗小鼠IgG（1∶2000 倍稀釋）37℃孵育1 h，PBST洗滌3遍，每次15 min。用凝膠成像系統曝光并分析結果。

2 結果

2.1 重組慢病毒質粒的構建及包裝 以pJXwn06為模板擴增ORF2基因序列并純化回收。用NotⅠ和BamHⅠ雙酶切純化后的PCR產物以及pLV-EF1a-EGFP-2A載體，膠回收酶切產物后連接、轉化、涂板、挑菌并進行搖菌，菌液提取質粒進行NotⅠ、BamHⅠ雙酶切鑒定，并設置pLV-EF1a-EGFP-2A為陰性對照，雙酶切得到約9452 bp和771 bp的條帶（圖1），成功獲得重組的慢病毒質粒pLV-EF1a-EGFP-2A-GP2。將慢病毒pLV-EF1a-EGFP-2A質粒設置為陽性對照，將重組的慢病毒表達質粒pLVEF1a-EGFP-2A-GP2與輔助質粒pMD2.G、pSPAX2共轉染293FT細胞。24 h后通過倒置熒光顯微鏡觀察熒光，如觀察到綠色熒光則表明慢病毒載體中GFP表達，慢病毒包裝成功。

圖1 質粒雙酶切驗證Fig.1 Plasmid double restriction digestion verification

2.2 嘌呤霉素殺滅曲線的確定 將Marc-145細胞接種到24孔板孵育過夜，棄掉原培養基并加入不同濃度嘌呤霉素（1～10 μg/mL）篩選培養基繼續孵育。每日觀察細胞的生長狀態，每2～3 d更換一次新鮮的含有嘌呤霉素的篩選培養基。最終確定4～6 d內有效殺死非轉導細胞的最低嘌呤霉素濃度為6 μg/mL。

2.3 慢病毒的轉導及細胞系的篩選 將包裝好的慢病毒顆粒轉導Marc-145細胞，用6 μg/mL嘌呤霉素進行篩選，通過有限稀釋法，將篩選后的細胞稀釋到96孔板中，挑選只有1個細胞生長的孔繼續孵育培養，兩周左右細胞已克隆成團后可以擴大培養，成功篩選得到目的細胞株。

2.4 細胞系的PCR及Western blot鑒定 提取細胞系的DNA，PCR擴增ORF2基因序列，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果顯示在771 bp左右處有特異性條帶（圖2）。裂解細胞系，提取細胞系總蛋白并進行Western blot鑒定，經凝膠成像系統顯示在28 kDa左右處有目的條帶（圖3）。PCR、Western blot鑒定結果表明成功獲得穩定表達PRRSV GP2蛋白的Marc-145細胞系。

圖2 PCR檢測細胞系中ORF2基因Fig.2 PCR amplification of ORF2 gene in cell lines

圖3 Western blot檢測細胞系中GP2蛋白的表達Fig.3 Western blot detection of GP2 protein expression in cell lines

3 討論

逆轉錄病毒載體是一種可用于人類基因治療的有吸引力的工具。目前所應用的慢病毒屬于復制缺陷型病毒，對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能力，慢病毒載體還可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而實現持久表達，是一種理想的用于篩選穩定細胞系的基因轉移載體[17-18]。建立穩定的細胞系，在研究基因功能、藥物開發等生物研究中具有重要作用[17]。

針對PRRSV相關細胞系的研究，Lee等[19]建立了可以穩定表達CD163的PAM細胞系，該細胞株完全允許1型和2型PRRSV株。這種允許PRRSV的PAM細胞系將不僅是促進病毒繁殖的重要工具，而且是推進病毒發病機理的體外研究的寶貴工具。Song等[20]構建了穩定表達N蛋白的BHK-21細胞系，同時構建缺失部分ORF7的PRRSV感染性克隆，通過反式互補成功拯救出復制缺陷型的PRRSV病毒。Pujhari等[21]利用星形孢菌素處理誘導了細胞的凋亡，發現Marc-2a細胞系中凋亡細胞的數量顯著減少，推測GP2蛋白可能有抑制細胞凋亡的作用。

慢病毒過表達載體pLV-EF1a-EGFP-2A可以使EGFP蛋白和GP2蛋白在同一個啟動子下表達，但互不影響分別發揮作用。因此我們可以通過觀察細胞的熒光表達情況確定轉染是否成功以及GP2是否整合到宿主染色體中。

在本研究中，我們旨在生成一組穩定的Marc-145-GP2細胞系，通過熒光顯微鏡觀察細胞呈綠色熒光。利用ORF2特異性引物PCR擴增到ORF2序列，表明ORF2基因已成功整合到靶標染色體中。采用Western blot技術，利用GP2單克隆抗體證實GP2蛋白的恒定高水平表達。本試驗成功構建了穩定表達PRRSV GP2蛋白的Marc-145細胞系，為研究PRRSV蛋白的結構功能，特別是研究GP2蛋白的免疫學特性和功能奠定了基礎；同時為研制抗PRRS的新型復制缺陷型疫苗奠定了基礎。