江蘇省部分地區水禽腸道外致病性大腸桿菌的分離鑒定及生物學特性研究

郭長明，陳懷君，袁 橙，封 琦，王永娟，徐 海，吳 雙，朱善元

（1.江蘇農牧科技職業學院 江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室，泰州 225300；2.廣西大學動物科學技術學院，南寧 530004）

禽致病性大腸桿菌（Avian pathogenicEscherichia coli,APEC）屬于腸道外致病性大腸桿菌（Extraintestinal pathogenicEscherichiacoli,ExPEC)[1]，所引起的禽大腸桿菌病可通過多種途徑進行傳播，其特征是多器官組織的損傷并伴有肝炎和心包炎等癥狀，是一種復雜的綜合癥[2]。水禽大腸桿菌感染發病率和死亡率高，給水禽養殖業造成了嚴重的經濟損失。使用抗菌藥物仍然是治療水禽大腸桿菌病的主要手段，隨著抗生素的廣泛應用，使水禽大腸桿菌對常用抗生素的耐藥性日益嚴重，多重耐藥菌株增多，為臨床上防控和治療該病帶來極大的挑戰[3]。同時，不合理的使用抗菌藥物，也導致動物體內抗菌藥物的殘留，細菌的耐藥性可以通過動物源性食品傳給人類,從而威脅到人類的健康[4-5]。

禽大腸桿菌血清型數量眾多且復雜，并隨著時間和地域改變，使用疫苗對該病進行防治存在難度。我國各地分離到的APEC血清型達50余種，常見的O抗原血清型為O2、O76、O78、O92和O93等[6]。研究表明，通過系統進化分群對禽大腸桿菌進行分類，其主要類型為B2和D型[6]。毒力相關因子在禽大腸桿菌感染的過程中發揮重要作用，如與宿主組織定植相關的黏附素（F1菌毛、P菌毛）、參與攝鐵的耶爾森菌強毒力島（high pathogenicity island,HPI）、腸細胞脫落位點毒力島（locus of enterocyte effacement pathogenicity island,LEE）、Ⅲ型分泌系統2（ETT2毒力島）、溶血素（hemolysin E,HlyE）、自轉運蛋白溫度敏感性血凝素（temperature-sensitive hemagglutinin,TSH）等。研究表明，部分毒力因子之間相互作用影響菌株的致病力，通常含有4個以上毒力因子的禽大腸桿菌具有致病性[6]。

2020年1月—2020年9月本實驗室（江蘇省獸用生物制藥高技術研究重點實驗室）在江蘇省部分地區的水禽養殖場進行采樣，并分離鑒定出禽大腸桿菌24株。通過對分離株進行分子進化分群、O抗原血清型、毒力基因和耐藥情況的檢測，旨在明確江蘇省水禽大腸桿菌病的流行情況和為有效防治大腸桿菌病提供參考。加強對水禽致病性大腸桿菌流行病學的監測和防控，對水禽養殖業的健康發展和獸醫公共衛生具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 樣品來源 24株禽大腸桿菌為本實驗室于2020年1月—2020年9月從江蘇部分地區水禽養殖場發病死亡水禽的肝臟、心臟、腦中分離獲得。

1.2 主要試劑 2× RapidTaqMaster Mix、2×TaqMaster Mix均購自南京諾唯贊生物科技有限公司；LB培養基、麥康凱培養基、伊紅美藍培養基均購自英國OXOID公司；細菌基因組DNA提取試劑盒、DL2000 DNA Marker均購自寶生物工程（大連）有限公司；引物由蘇州金唯智生物科技有限公司合成；大腸桿菌O抗原單因子血清購自中國獸醫藥品監察所；藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

1.3 細菌的分離及16S rDNA PCR鑒定 用接種環在無菌條件下蘸取病死水禽的心臟、肝臟、腦組織，劃線于麥康凱平板上，37℃培養16 h，挑取單個紅色菌落接種于伊紅美藍培養基，37℃培養16 h，挑取金屬光澤疑似大腸桿菌單菌落，接種于LB培養基，置于搖床180 rpm、37℃恒溫培養6 h。分別取新鮮菌液1 mL，按細菌基因組DNA提取試劑盒說明書提取細菌基因組DNA。根據參考文獻[11]合成大腸桿菌16S rDNA PCR鑒定引物（表1），對24株分離菌株進行PCR鑒定。PCR反應體系共25 μL：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性15 s，53℃退火15 s，72℃延伸30 s，共30個循環；72℃再延伸5 min。反應結束后，取2.0 μL的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

表1 16S rDNA和毒力相關基因引物序列Table 1 Primers for 16S rDNA and virulence-related genes

1.4 O抗原血清型鑒定 按照大腸桿菌O抗原定型血清說明書制備抗原，取抗原和血清各50 μL于載玻片上混勻，涂成直徑約2 cm的圓膜，1 min內出現明顯凝集顆粒判定為陽性。同時以抗原與0.5%石炭酸生理鹽水混合物作對照，觀察有無自凝集現象。

1.5 毒力相關基因PCR鑒定 根據參考文獻[7-13]合成fimA、papC、irp2、eaeA、ECs3703、ECs3737、tsh、hlyE共8對毒力相關基因的檢測引物。對24株分離株進行PCR檢測，引物信息見表1。PCR反應體系共25 μL：2×TaqMaster Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。PCR反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性15 s，退火（退火溫度見表1）15 s，72℃延伸40 s，共30個循環；72℃再延伸5 min。反應結束后，取2.0 μL的PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

1.6 細菌分子進化分群PCR鑒定 根據參考文獻[7]合成大腸桿菌分子進化分群引物（引物信息見表2），采用三重PCR方法對分離菌株進行系統分群鑒定，大腸桿菌系統進化分群判定標準見圖1。PCR反應體系共25 μL：2× RapidTaqMaster Mix 12.5 μL，3對上、下游引物各1.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR反應條件：95℃預變性3 min；95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸15 s，共30個循環；72℃再延伸5 min。

圖1 大腸桿菌系統進化分群判定標準Fig.1 Standard for the determination of the Escherichia coli phylogenetic group

表2 大腸桿菌分子分群引物序列Table 2 Molecular clustering primer sequence of Eschorichia coli

1.7 藥敏試驗 選取24種抗菌藥依據美國臨床實驗室標準協會（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）制定的抗生素藥敏試驗標準，用Kirly-Baue紙片擴散法測定分離菌株耐藥性。取100 μL細菌培養液涂板、貼藥敏片，37℃培養18 h后觀察結果并量取抑菌圈大小，依據抑菌范圍解釋標準進行結果判斷。

2 結果

2.1 細菌的分離及16S rDNA PCR鑒定 用麥康凱培養基和伊紅美藍培養基分離培養大腸桿菌，再通過PCR鑒定，共分離到24株大腸桿菌。分離株在麥康凱和伊紅美藍培養基上的生長形態見圖2，部分菌株16S rDNA PCR鑒定結果見圖3。

圖2 大腸桿菌在麥康凱培養基（A）和伊紅美藍培養基上的形態（B）Fig.2 Morphology of Escherichia coli on MacConkey (A)and Eosin-methylene Blue medium (B)

圖3 部分菌株16S rDNA PCR產物電泳結果Fig.3 Agarose gel electrophoresis of PCR products of 16S rDNA gene of some strains

2.2 O抗原血清型鑒定 對24株分離菌株進行O抗原血清型鑒定，鑒定結果如表3所示。其中，血清型為O16、O68、O87、O126、O138、O164型的菌株各1株，O65血清型菌株共8株，占全部菌株的33.3%，其他血清型10株。

表3 24株禽致病性大腸桿菌的血清型分布Table 3 Serotype distributions of 24 strains of APEC

2.3 毒力基因的鑒定 通過PCR分別檢測了24株禽大腸桿菌分離株8種毒力基因，由檢測結果可知，除eaeA、papC、hlyE這3個毒力基因外，其余5種毒力基因均有檢測到（圖4～5）。其中fimA基因在所有菌株中被檢出20株（83.3%）、ECs3737基因18株（75%）、ECs3703基因16株（66.7%）、tsh基因8株（33.3%），均有較高的分布率，為重要的APEC毒力基因，而irp2基因檢測到3株陽性，檢出率為4.2%。

圖4 部分菌株毒力基因PCR產物凝膠電泳結果Fig.4 Agarose gel electrophoresis of PCR products of virulence genes of some strains

圖5 8種毒力相關基因在24株APEC中的分布Fig.5 Distribution of 8 virulence-associated genes in 24 strains of APEC

對24株分離菌株毒力基因組合分布進行統計，結果如表4所示，含有4個毒力基因組合的菌株共7株（29.2%），其中基因組合為fimA+ECs3703+ECs3737+tsh有6株，fimA+ECs3703+ECs3737+irp2組合1株。3種基因組合共9株（37.5%），其中組合fimA+ECs3703+ECs3737有7株。

表4 不同毒力基因組合在分離菌株中的分布Table 4 Distributions of combination of different virulence genes in isolated strains

2.4 細菌分子進化分群鑒定 對24株水禽大腸桿菌進行系統進化分群鑒定，可觀察到特異電泳條帶chuA（279 bp）、yjaA（211 bp）和TspE4.C2（152 bp）（圖6）。系統進化分群結果可知，非致病群A占45.8%（11/24），低致病群B1占33.3%（8/24），高致病群B2和D分別占8.3%（2/24）和1.3%（3/24）（表5）。

圖6 部分菌株系統進化分群電泳結果Fig.6 Results of phylogenetic electrophoresis of some strains

表5 不同進化分群在分離菌株中的分布Table 5 Distribution of different evolutionary clusters in isolated strains

2.5 藥敏試驗 藥敏試驗結果顯示，24株分離菌株對受試的抗菌藥物表現出多重耐藥。其中分離菌株均對恩諾沙星、強力霉素（100%）耐藥，對四環素、萬古霉素、紅霉素的耐藥率為91.7%。分離株對阿莫西林的敏感率僅為16.7%，但對阿莫西林/棒酸的敏感率為100%（表6）。多重耐藥統計結果可知，在24株分離菌株中，耐10種以上藥物的菌株占79.2%（19/24）（圖7）。

圖7 24株APEC對24種抗生素的多重耐藥統計結果Fig.7 Results of multiple drug resistance of the 24 APEC isolates to 24 antibiotics

表6 24 株分離菌株的藥敏試驗Table 6 Drug sensitivity assay for 24 isolated strains

3 討論

近年來，隨著全球經濟的發展，人類對肉蛋奶等動物相關產品的需求量也與日俱增，在養殖業規模不斷擴大的同時伴隨著動物疫病頻發[14]。APEC具有復雜多樣的血清型，因此，使用疫苗對該病進行預防較為困難。由于一些養殖場不合理地使用甚至濫用抗菌藥物，致使細菌耐藥性、多重耐藥性問題日趨嚴重。若動物源食品中含有抗菌藥物殘留，會給人類和動物的健康帶來不利影響。因此，對APEC進行分子流行病學調查十分必要，以便掌握其流行特點及規律，為精準防控該病奠定基礎。

本研究分離得到的24株APEC，通過血清型鑒定發現，優勢血清型主要為O65，與董向磊[15]報道的山東地區流行的優勢血清型結果一致。但是與國內外其他研究報道的APEC優勢血清型為O2、O76、O78、O92、O93、O119的結果差異較大[6,16-17]。研究表明，國內外不同地區的禽大腸桿菌分離株O抗原血清型存在一定差異，可能是采樣地點、季節及時間的不同所導致。此外，水禽的跨地域銷售運輸和疫苗防控也可能使當地的優勢血清型發生改變[18]。因此，需要針對各個地區流行的APEC血清型及相應的環境氣候采取較為有效的防控措施。

系統進化分群是對大腸桿菌進行分型的一種重要的方法，可以追溯大腸桿菌進化起源[18]。本研究發現，24株分離菌株主要為A和B1進化分群，與Kobayashi等[19]研究報道的巴西某屠宰場的優勢進化分群結果相一致，但與其他國家及國內某些地區研究結果不同，部分研究顯示分離菌株的優勢進化分群為B2群[6,20]。分離菌株的進化分群類型有所差異可能是由于采樣地點、動物來源、飼養環境及采樣時間的不同所致。

本研究設計合成的8種毒力基因與禽大腸桿菌的致病性、耐藥性存有一定聯系。fimA基因在所有分離菌株中的檢出率為83.3%，ECs3737基因為75%，ECs3703基因為66.7%，均有較高的分布率，為重要的禽大腸桿菌毒力基因。而tsh、irp2基因在本研究中檢出率略低，分別為33.3%、4.2%。24株分離菌株同時也存在多種毒力基因組合形式，含有4個及以上毒力基因組合的菌株共7株，其中，fimA+ECs3703+ECs3737+tsh基因型有6株，fimA+ECs3703+ECs3737+irp2基因組合為1株。3基因組合共9株，其中fimA+ECs3703+ECs3737基因組合有7株。攜帶毒力基因較多的菌株可能致病性也較強，各分離株的致病性尚需進一步驗證。

藥敏試驗結果顯示，分離菌株均為多重耐藥菌株，其中79.2%（19/24）的菌株耐10種以上藥物，由此可見，目前水禽大腸桿菌多重耐藥現象較為嚴重，這可能與其血清型復雜、不合理使用抗菌藥物有關[21]。APEC分離株對恩諾沙星、強力霉素兩種藥物的耐藥率為100%，出現對同種藥物耐藥的現象，可能與江蘇地區各養殖場的用藥習慣有關，這些藥物可能長期用于水禽大腸桿菌病的防控，導致耐藥性的產生。Dou等[22]研究表明，在中國東部分離的243株APEC中，對四環素耐藥的菌株占98%。本研究24株分離菌株中對四環素耐藥的占91.7%，耐藥率較高，與該研究結果一致。胡紫萌等[23]研究結果表明，分離的APEC對四環素、氟苯尼考、恩諾沙星、氧氟沙星的耐藥率分別為100%、86%、70%、36%，鐘舒紅等[24]研究報道，在廣西分離的禽源致病性大腸桿菌中，對氟苯尼考、恩諾沙星、慶大霉素的耐藥率分別為47.8%、22.8%、26.5%，與本文研究結果均有所差異，這可能跟分離株的時空分布、各地的用藥習慣不同有關。由本研究結果可以看出，國內不同地區的水禽大腸桿菌分離菌株均有不同程度的多重耐藥現象，因此科學、合理、精準的使用抗菌藥物對有效控制水禽大腸桿菌病的發生、減抗限抗的推廣都具有重要意義。

本研究通過對江蘇省部分規?；蒺B殖場分離的24株水禽腸道外致病性大腸桿菌進行O抗原血清型測定、毒力基因及系統進化分群檢測及耐藥性研究，為水禽致病性大腸桿菌致病機理及防控提供參考，同時為后續對禽大腸桿菌耐藥機制的研究奠定基礎。