北疆地區馬鏈球菌分離鑒定及耐藥性和毒力基因分析

孫丹嵐，買占海，佟盼盼，陳見興，羅 潔，張 磊，布阿依夏木·吾斯曼，況 玲

（新疆農業大學動物醫學學院，烏魯木齊 830052）

鏈球菌種類繁多，有的屬于動物正常菌群，而有的是致病菌，如化膿性鏈球菌、肺炎鏈球菌、豬鏈球菌、無乳鏈球菌、停乳鏈球菌等，可引起動物的肺炎、敗血癥、腦膜炎、乳腺炎等，給畜牧養殖業和公共衛生造成嚴重威脅。肺炎鏈球菌（Streptococcuspneumoniae,SP）發現于1881年，是各種感染如社區獲得性肺炎、中耳炎、腦膜炎、膿腫、敗血癥等的主要致病菌之一，尤其對于嬰幼兒和老年人，其中肺炎、敗血癥和腦膜炎致死率較高[1]。SP有超過90種血清型，且目前的疫苗不能完全覆蓋[2-3]。SP攜帶多種毒力基因，其導致各種感染疾病的具體機制有待明確，毒力基因在此過程中可能具有重要作用，這種作用可能體現在毒力基因的有無和表達水平兩個方面[4-6]。

馬鏈球菌（Streptococcusequi,S.equi）屬于蘭氏分群的C群β溶血鏈球菌，包括獸疫亞種（Streptococcusequisubspecieszooepidemicus,SEZ）、馬亞種（Streptococcusequisubspeciesequi,SEE）和類馬亞種（Streptococcusequisubspecies ruminatorum,SER）三個不同的亞種[7]。馬腺疫（Strangles）是一種散發性或地方流行性的馬屬動物接觸性傳染病，該病以發熱、上呼吸道黏膜炎癥、頜下淋巴結腫脹化膿為典型特征[8]。帶菌馬已被認為是維持病原體長期存在和暴發感染的重要因素[9]。其發病率可達100%，死亡率達10%[10]。病菌隨病馬噴鼻、咳嗽及膿腫破潰排出體外，經消化道、上呼吸道黏膜、扁桃體或受損皮膚感染健康馬匹[11]?；疾∮遵x也可因吮乳，將細菌傳染給母馬，引起馬乳房炎，甚至引發敗血癥[12]。

馬鏈球菌的致病性和耐藥性研究在國內研究較少，常見的毒力基因有fneB[13]，臨床常用青霉素、四環素和磺胺類藥物等進行治療[14]，同時，耐藥鏈球菌的出現也導致基層馬場遭受很大經濟損失，臨床用藥亟需新的思路。本實驗通過對馬場采集樣品進行細菌分離培養，利用藥敏實驗和PCR檢測，測定并分析馬鏈球菌及其他鏈球菌的耐藥性和毒力基因，從而為基層馬場臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌種來源 24株鏈球菌分離自2019年9月至2020年4月昌吉及伊犁馬場的132份健康及患病馬匹馬鼻拭子樣本。

1.2 主要試劑 THB培養基購自青島高科技工業醫海博生物技術有限公司；革蘭氏染色試劑盒購自珠海貝索生物技術有限公司；藥敏紙片：青霉素、氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢他啶、頭孢噻肟、四環素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素、強力霉素、恩諾沙星、磺胺甲基異惡唑購自杭州濱和生物公司。

1.3 細菌分離培養與純化 無菌狀態下吸取采集的馬鼻拭子樣品1 mL加入到3 mL THB液體培養基中，在37℃、160 rpm的搖床中震蕩培養12～24 h，進行增菌培養。用接種環沾取菌液在THB固體培養基上進行平板劃線接種，倒置于37℃的恒溫培養箱中過夜培養，觀察菌落形態，挑取針尖大小的菌落繼續培養。一般需要提純3次或3次以上，直到培養基菌落單一、穩定為止。

1.4 菌株的形態觀察 顯微鏡觀察挑取純化的單菌落進行革蘭氏染色，在油鏡（100×）下觀察其形態特征。

1.5 菌株的PCR鑒定及測序 以提取的分離菌株基因組DNA為模板，用16S RNA通用引物，進行PCR擴增。PCR反應體系（50 μL）為：上、下游引物各2 μL，DNA模板2 μL，2×TaqPCR Green Mix 25 μL，ddH2O補至50 μL。用凝膠成像分析系統觀察結果。擴增條件為：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，49℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35個循環。目標條帶大小為197 bp。將鑒定有目標條帶的PCR產物測序。

1.6 藥敏實驗 采用標準K-B紙片擴散法，檢測分離菌株對青霉素、氨芐西林、頭孢氨芐、頭孢他啶、頭孢噻肟、四環素、氯霉素、紅霉素、慶大霉素、強力霉素、恩諾沙星、磺胺甲基異惡唑12種抗生素的敏感性。

1.7 菌株耐藥基因及毒力基因的檢測 通過PCR和瓊脂糖凝膠電泳分析從鏈球菌中提取的DNA，確定是否存在耐藥基因或毒力基因。根據相關文獻報道和現有研究，選取流行率較高的基因[15-17]。耐藥基因分別為：耐β-內酰胺類（blaTEM、blaCTX-M）、耐四環素類（tetA）、耐磺胺類（SulI）、耐喹諾酮類（qnrA、aac(6')）。以上6個耐藥基因PCR擴增引物序列和反應運行參數見表2。毒力基因分別為：ply、pspA、nanA、psaA、lytA、seM、fneB。以上7個毒力基因PCR擴增引物序列和反應運行參數見表2。引物合成由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系（20 μL）為：2×TaqPCR Green Mix 10 μL，上、下游引物1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O補至20 μL。用凝膠成像分析系統觀察結果，膠回收產物于-20℃保存備用。

表1 PCR所用引物序列Table 1 Primer sequences for PCR

表2 鏈球菌對常見菌藥敏實驗結果Table 2 Results of drug sensitivity test of Streptococcus to common bacteria

2 結果

2.1 培養結果 鏈球菌在THB固體培養基平板上培養，直徑0.1～1.0 mm，灰白色，表面光滑，邊緣整齊的小菌落。馬鏈球菌在綿羊血平板上長出針尖大小白色菌落，有溶血環（圖1）。

圖1 馬鏈球菌馬亞種在綿羊血培養基上的菌落形態Fig.1 Colony morphology of Equi on sheep blood

2.2 鏡檢結果 菌體呈藍紫色，為革蘭氏陽性菌，直徑0.6～1.0 μm。菌體似矛頭狀排列單個或多個排列成鏈狀，無芽孢、無菌毛（圖2）。

圖2 鏈球菌革蘭氏染色鏡檢結果（100×）Fig.2 Microscopic examination of Streptococcus by Gram staining (100×)

2.3 PCR結果 根據目的條帶顯示，對采集樣品進行PCR鑒定，共得到24株鏈球菌。圖3為其中兩株菌的結果。

圖3 鏈球菌16S PCR擴增結果Fig.3 Amplification results of Streptococcus 16S PCR

2.4 測序結果 對在197 bp目的條帶下的11株菌進行測序，通過測序確定9株馬鏈球菌馬亞種（Y1、Y2、Y3、D1、D2、D3、L1、L2、L3），兩株肺炎鏈球菌（0-1，35-61）。

2.5 藥敏結果 24株鏈球菌對12種抗菌藥物的耐藥情況由表2和表3可見，本實驗所分離的肺炎鏈球菌對強力霉素、青霉素的耐藥率很高，對四環素、頭孢他啶的耐藥率也較高，對磺胺甲基異惡唑、恩諾沙星、氨芐西林、氯霉素都較為敏感。所分離的馬鏈球菌對磺胺甲基異惡唑耐藥性較高，對氨芐西林、頭孢噻肟、四環素的耐藥性也超過半數，對氯霉素、頭孢氨芐、頭孢他啶、慶大霉素、強力霉素的耐藥性較低，對紅霉素、恩諾沙星敏感。

表3 馬鏈球菌對常見菌藥敏實驗結果Table 3 Drug sensitivity test results of Streptococcus equi to common bacteria

2.6 耐藥基因檢測結果 對鑒定出的24株鏈球菌分離株進行6種耐藥基因檢測，檢測結果如表4所示，除blaCTX-M、tetA、SulI和aac(6')基因外，其余2種耐藥基因均有檢測到。其中blaTEM基因在17個菌株中均被檢出，對各菌株耐藥基因組合分布進行統計，含有2個以上耐藥基因的菌株有2株（8.3%），其余7株菌未檢測出任何耐藥基因（表4）。部分陽性結果見圖4、圖5。

圖5 qnrA基因檢測結果Fig.5 qnrA gene detection results

表4 不同菌株的耐藥基因檢測情況Table 4 Detection of drug resistance genes

2.7 毒力基因檢測結果 對鑒定出的24株鏈球菌分離株進行7種毒力基因檢測，檢測結果可知，除pspA、nanA、psaA和seM基因外，其余3種毒力基因均有檢測到。其中lytA和fneB基因分別在8個和9個菌株中均被檢出，對各菌株毒力基因組合分布進行統計，含有3個以上毒力基因的菌株有3株（12.5%），其余10株菌未攜帶毒力基因（表5）。部分陽性結果見圖6～8。

圖6 ply基因檢測結果Fig.6 ply gene detection results

圖7 lytA基因檢測結果Fig.7 lytA gene detection results

圖8 fneB基因檢測結果Fig.8 fneB gene detection results

表5 不同菌株的毒力基因檢測情況Table 5 Detection of virulence genes

3 討論

馬亞種馬鏈球菌是馬腺疫的主要病原，在馬和驢的膿腫淋巴結中也曾分離出，馬鏈球菌的致病性耐藥性研究在國內研究較少，本研究分離出的鏈球菌中，有9株馬鏈球菌，其中D1、D2、D3、L1、L2、L3 6株馬鏈球菌來自昌吉某馬場，Y1、Y2、Y3 3株菌來自伊犁某馬場，Neamat-Allah等[17]認為馬腺疫全年發病，但在春季發病率較高，Radostits等[18]研究得出馬腺疫多發生于寒冷季節的結論，本研究的樣品為秋季和春季末采集。

本實驗分離出的肺炎鏈球菌和馬鏈球菌馬亞種，樣品均采樣自昌吉某馬場。分離出的馬鏈球菌馬亞種中有1株對慶大霉素、氯霉素耐藥；有5株對四環素耐藥；有5株對頭孢噻肟耐藥；有1株對頭孢他啶耐藥；有4株對氨芐西林耐藥。

根據耐藥基因的結果，24株菌株中，有17株攜帶β-內酰胺類耐藥基因blaTEM，說明在鏈球菌中blaTEM基因有較高攜帶幾率，其中1株鏈球菌（HW5-1-2）和1株馬鏈球菌（Y1）同時攜帶了喹諾酮類耐藥基因qnrA，為多重耐藥菌株。經過耐藥表型和耐藥基因數據的對照可知，耐藥表型與耐藥基因并不完全相符，如馬鏈球菌和其他鏈球菌對四環素類藥物的耐藥率均較高，馬鏈球菌5株，其他鏈球菌10株，但因為只檢測了一種四環素類耐藥基因（tetA），并沒有檢測出相關耐藥基因的存在，可能是菌株DNA中還有沒發現的其他耐藥基因存在，本次實驗沒有檢測到。根據毒力基因的結果來看，有5株鏈球菌攜帶lytA基因，9株馬鏈球菌均攜帶fneB基因，值得關注的是，有3株馬鏈球菌同時攜帶3個毒力基因，分別為ply基因，lytA基因及FneB基因。根據耐藥性結果和毒力基因結果綜合分析，馬鏈球菌（Y1），同時攜帶兩種耐藥基因（blaTEM基因和qnrA基因）及一種毒力基因（fneB基因）。在臨床用藥中應盡量避免在對馬鏈球菌引起的疾病中用β-內酰胺類藥物進行治療。

通過本次實驗可知，北疆地區馬源鏈球菌對常見藥物有較高的耐藥率，提示該地區耐藥情況比較嚴重；應重視由耐藥菌株引起的鏈球菌病在馬場中傳播的嚴峻形勢。綜上所述，應做到抗生素輪換使用并謹慎選擇，避免因濫用抗生素出現大量耐藥菌。