犬細小病毒河南方城株分離及VP2基因序列分析

林瑜婷，翟 頎，翟少倫，呂殿紅，周秀蓉，賈春玲，霍 瑋，溫肖會，魏文康,3

（1.仲愷農業工程學院動物科技學院，廣州 510225；2.廣東省農業科學院動物衛生研究所 廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室 農業農村部獸用藥物與診斷技術廣東科學觀測實驗站，廣州 510640；3.廣東省農業科學院農業生物基因研究中心，廣州 510640）

犬細小病毒病是由細小病毒科（Parvoviridae）細小病毒屬（Parvovirus）的犬細小病毒（Canine parvovirus,CPV）感染犬只引起的致命性傳染病[1]，該病常以出血性腸炎、白細胞含量顯著減少、腥臭血便和嚴重脫水等為主要臨床特征，部分表現為突然死亡的急性心肌炎型[2]。犬細小病毒病傳染性強，死亡率較高，全年都可以流行，嚴重危害犬只健康，給我國寵物飼養業造成巨大的經濟損失。CPV基因組全長5233 bp，含兩個開放閱讀框，分別編碼兩個結構蛋白（VP1、VP2）和非結構蛋白（NS1、NS2）[4]，VP1基因全長2181 bp，編碼726個氨基酸，而VP2基因完全包含在VP1的序列中，全長1755 bp，編碼584個氨基酸。VP2蛋白是CPV病毒衣殼的主要組成部分，在病毒的感染和復制過程中起著重要作用[6]，其幾個關鍵堿基和氨基酸的改變就可能導致病毒發生變異[7]，自1970年CPV被成功分離以來，病毒不斷發生突變形成了新的基因型CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c，并在不同地區之間流行，形成了具有不同地理特征的毒株[8]。

本研究于2019年收集8份河南省方城縣某動物醫院疑似CPV感染犬糞便樣品，并在貓腎細胞（Crandell-Rees feline kidney cell,CRFK）上接種培養，通過PCR檢測、細胞病變（cytopathic effct,CPE）情況、電鏡檢測、TCID50測定以及VP2基因序列分析，對病毒進行分離鑒定和毒株亞型的確定，為了解河南省CPV的變異狀況和流行趨勢提供參考和依據。

1 材料與方法

1.1 樣品、細胞和主要試劑 樣品采集于河南省方城縣某動物醫院犬糞便；CRFK細胞由廣東省農業科學院動物衛生研究所動物疫病診斷中心實驗室保存；DMEM培養液、胎牛血清購自Gibco公司；pMD-19T克隆載體、DL2000 DNA marker、DNA凝膠回收試劑盒、Top10感受態細胞、DNA提取試劑盒、質粒提取試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 樣品處理 向樣品中加入含0.1%雙抗的DMEM培養液，混合均勻，反復凍融3次，8000 ×g離心10 min后取上清液，0.22 μm濾膜過濾上清液，收集濾液于-80℃保存，待用。

1.3 樣品PCR檢測 將處理好的樣品按照DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取。參考本實驗室已建立的犬瘟熱病毒（Canine distemper virus,CDV）、犬副流感病毒（Canine parainfluenza virus,CPIV）和CPV的多重PCR檢測方法[9]鑒定CDV、CPV、CPIV。具體引物序列見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應體系為：DNA模板 2 μL，所有引物各0.5 μL，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O補至25 μL。PCR反應程序：50℃反轉錄30 min；95℃預變性2 min；95℃變性30 s，53℃退火30 s，72℃延伸60 s，共30個循環；72℃再延伸7 min，12℃保存。PCR產物于1.2%瓊脂糖凝膠中進行電泳，檢測樣品中是否有犬細小病毒。

表1 PCR引物序列Table 1 Primers used for PCR Assay

1.4 病毒增殖 將處理好的樣品上清液接種于CRFK細胞中，細胞長成單層后加入含2% FBS的DMEM細胞培養液，于37℃、5% CO2細胞培養箱進行培養，另設不接種病毒的CRFK細胞作為陰性對照。每天觀察細胞生長情況和細胞病變并記錄，棄掉盲傳3代無CPE的細胞；產生CPE的細胞繼續盲傳3代，當出現80%的CPE時，收獲病毒，于-80℃保存待用。

1.5 病毒電鏡觀察 超速離心純化病毒液，吸附銅網1 min，1%磷酸鎢染液負染后，透射電鏡下觀察病毒粒子形態。

1.6 病毒TCID50測定 調整CRFK細胞懸液濃度接種于96孔板，并對病毒樣品的F6代細胞毒10倍倍比稀釋，同步接種，每個稀釋度接種8孔，同時設置正常細胞作為對照，每天觀察并記錄CPE孔數，按Reed-Muench法計算病毒的TCID50。

1.7 CPVVP2基因PCR擴增 對5份樣品的F6代細胞毒按照DNA提取試劑盒說明書進行DNA提取，參考GenBank中已發表的CPVVP2基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計特異性引物，序列見表1，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。反應體系為：DNA模板 2 μL，VP2-F/R各0.5 μL，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O補至25 μL。PCR反應程序：95℃預變性2 min；95℃變性30 s，56℃復性30 s，72℃延伸90 s，共35個循環；72℃再延伸10 min，12℃保存。PCR產物于1.2%瓊脂糖凝膠中進行電泳鑒定，并用DNA凝膠回收試劑盒進行回收純化。將純化后的回收產物連接到pMD-19T載體上，送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.8 CPVVP2基因序列分析 運用DNAMAN軟件對測序結果進行拼接，將所獲得的VP2基因序列與NCBI上已公布的CPV的標準毒株（GenBank登錄號：M24003.1)、疫苗株（GenBank登錄號：GU21279.1、FJ197846.1）、22株國內外不同基因型的CPV分離株進行比對分析，運用MEGA 7.0進行核苷酸序列同源性比對，運用DNAStar分析氨基酸序列，分析氨基酸變異情況并確定所分離的CPV毒株基因型[10]（表2）。運用MEGA 7.0 Neighbor-joining程序（參數設置為1000 replications）繪制系統進化樹。

表2 犬細小病毒基因分型方法Table 2 Genotyping method of Canine parvovirus

2 結果

2.1 樣品PCR檢測 參考本實驗室已建立的PCR檢測方法進行檢測，將PCR擴增產物經1.2%瓊脂糖凝膠電泳。結果顯示，本次收集的8份樣品中，1、2、5、6、7號樣品采用CPV擴增引物均能擴增出1033 bp目的條帶，其余3、4、8號樣品未出現目的條帶，8份樣品采用CDV和CPIV特異性引物擴增未出現目的條帶（圖1）。

圖1 糞便樣品PCR鑒定結果Fig.1 PCR result of stool samples

2.2 病毒增殖 將5份陽性樣品分別接種于單層培養的CRFK細胞，觀察細胞病變。接毒細胞均出現拉網、空泡和變圓脫落的典型細胞病變，對照組細胞正常（圖2）。接毒細胞繼續盲傳3代，觀察到穩定的細胞病變現象，證明成功分離到5株病毒，將出現CPE的樣品分別命名為China-HN-01、China-HN-02、China-HN-05、China-HN-06、China-HN-07。

圖2 感染CPV的CRFK細胞和健康CRFK細胞Fig.2 Healthy CRFK cell and CRFK cell infected with CPV

2.3 電鏡形態學觀察 取純化后的CPV病毒液進行1%磷酸鎢負染，透射電鏡下5株CPV分離株均可觀察到外形結構呈圓形或二十面體結構、直徑為20～25 nm的無囊膜病毒粒子（圖3），符合細小病毒的形態大小特征。

圖3 病毒粒子電鏡下形態觀察Fig.3 Electron microscopy image of virus particles

2.4 TCID50測定結果 將5株CPV分離株的細胞毒倍比稀釋后同步接種于CRFK細胞，每日觀察CPE情況，處理數據后按照Reed-Muench法計算毒株的TCID50（如表3）。

表3 CPV毒株TCID50測定結果Table 3 TCID50 of CPV isolates

2.5 CPVVP2基因PCR擴增 提取5株CPV毒株的F6代細胞培養液中DNA，對其VP2基因進行擴增，通過1.2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測。結果表明，5份樣品均在1755 bp處出現目的條帶（圖4）。

圖4 CPV VP2 PCR鑒定結果Fig.4 The PCR result of CPV VP2

2.6 CPVVP2基因序列分析

2.6.1 CPV毒株亞型分析 根據測序所獲得的CPVVP2基因序列翻譯獲得其氨基酸序列，參考分型標準確定CPV毒株亞型。對CPV毒株進行氨基酸突變分析，發現5株CPV毒株的第297位氨基酸都由S突變為A，且China-HN-01、China-HN-02、China-HN-05、China-HN-07毒株中第426位氨基酸為N，故其屬于New CPV-2a亞型，China-HN-06發生了5A→G、370Q→R、426N→E和440A→T的突變，通過和參考毒株的比對以及參考分型標準，確定China-HN-06為CPV-2c亞型。

2.6.2 CPV VP2主要氨基酸位點突變分析 CPVVP2基因全長為1755 bp，共編碼584個氨基酸。通過核苷酸序列翻譯5株CPV毒株及參考毒株的氨基酸序列，運用MEGA 7.0軟件進行比對分析，結果見表4。與4株基因型為New CPV-2a的參考毒株相比，China-HN-01、China-HN-05較為保守，VP2蛋白沒有發生氨基酸突變，China-HN-02、China-HN-07發生了不同程度的氨基酸突變。與5株基因型為CPV-2c的參考毒株相比，China-HN-06在VP2蛋白上發生了4處氨基酸突變。New CPV-2a亞型毒株的突變情況為China-HN-02的T101A、I357T和China-HN-07的P74L，CPV-2c亞型毒株China-HN-06發生氨基酸突變的位點較多，有R16G、R191G、T223I、L294S共4處突變。

表4 CPV VP2蛋白氨基酸突變位點Table 4 Variable amino acid sites of VP2 protein

2.6.3 同源性分析 將此次分離得到的5株CPV毒株和GenBank上已發表的國內14株和國外11株CPV的基因序列進行比對。結果可知，5株CPV毒株之間的核苷酸同源性為95.1%～99.7%，與商品化疫苗株GU212791.1和FJ197846.1的同源性為97.8%～98.7%，與其他參考毒株的同源性為94.0%～99.0%（圖5）。

圖5 CPV毒株VP2基因核苷酸同源性比對分析Fig.5 Nucleotide homology alignment analysis of VP2 gene of the CPV isolate

2.6.4 系統進化樹分析 運用MEGA 7.0軟件，對5株CPV毒株以及GenBank數據庫中14株國內和11株國外CPV的VP2基因序列進行比對，繪制系統進化樹。由結果可知，China-HN-01、China-HN-02、China-HN-05、China-HN-07與國內四川地區分離到的同為New CPV-2a亞型毒株的親緣關系較近；China-HN-06與蒙古國的CPV-2c亞型分離株位于同一分支，親緣關系較近，與我國河南地區分離到的其中1株CH-HN-D27親緣關系接近但不同屬一支，與河南地區的CH-HN-D22、CH-HN-D23、CH-HN-D25株CPV-2c分離株親緣關系較遠，5株CPV毒株與疫苗株Nobivac DHPPL和Vanguardplus5屬于不同分支，親緣關系較遠（圖6）。

圖6 CPV VP2核苷酸序列遺傳進化樹Fig.6 The nucleotide sequence genetic tree analysis of VP2 gene of CPV

3 討論

本實驗從8份疑似CPV感染的犬只糞便中檢測出5份CPV陽性樣品，后經PCR檢測、電鏡檢測、細胞病變觀察和VP2基因測序分析確定所增殖的病毒為CPV。根據CPV亞型分型標準對毒株進行分型和命名，確定China-HN-01、China-HN-02、China-HN-05、China-HN-07為New CPV-2a亞型，China-HN-06為CPV-2c亞型。目前全球流行的CPV毒株主要為2a、2b和2c亞型，我國以New CPV-2a亞型為主要流行毒株[11]，2000年，CPV-2c于意大利首次被報道[12]，其后，CPV-2c逐漸成為歐美國家的主要流行亞型。2010年，我國首次檢測到CPV-2c[13]，2014年成功分離第一株中國CPV-2c毒株[14]，隨后，我國多個城市陸續發現CPV-2c型，包括吉林、黑龍江、北京、廣西等地[15]，本研究從河南方城地區再次檢測到CPV-2c毒株，說明CPV-2c亞型毒株在我國的流行呈上升趨勢。

VP2基因是CPV的特異性基因，是最主要的毒力基因，可以誘導機體產生中和抗體。本試驗根據VP2基因參考序列設計合成特異性引物，對VP2基因進行了克隆分析。結果顯示，5份樣品的細胞培養物均能擴增出1755 bp的目的片段，測序比對顯示目的序列與已發表的CPV同源性均達99%以上，從分子水平證明了5株均為CPV毒株。經過氨基酸序列比對，發現China-HN-02株的VP2基因發生了T101A突變，但是China-HN-02株的VP2蛋白功能是否發生改變還有待后續研究。CPV-2c亞型的China-HN-06毒株與疫苗株的核苷酸同源性稍低為97.8%和97.9%，且該毒株與參考毒株比對有4個氨基酸位點突變：R16G、R191G、T223I、L294S，但這四個非同義位點的突變是否會對病毒的生物學特性產生影響還有待進一步研究。系統進化樹分析表明，CPV在進化過程中形成不同的分支，4株New CPV-2a亞型毒株與四川分離株的親緣關系最近，屬于同一分支，推測4株New CPV-2a的毒株可能由四川分離株進化而來。CPV-2c亞型的China-HN-06毒株與另外3株河南地區的CPV-2c分離株不在同一分支，親緣關系較遠，說明CPV仍在不斷進化突變，河南地區目前已經存在不同突變的CPV-2c亞型的分離株，因此有必要及時監測CPV的變異情況，加強對CPV-2c亞型的監測。

本實驗對河南方城地區發現的CPV毒株進行分析，為研究CPV變異株在河南地區的傳播和寵物疫病防控提供了理論依據。