牛乳腺炎糞腸球菌cylA基因對牛外周血單核巨噬細胞完全吞噬功能的影響

王贊嘉，錫林高娃，吳金花，布日額，邢家輝，代牡蘭

（1.內蒙古民族大學 生命科學與食品學院，通遼 028043；2.內蒙古自治區乳源性致病菌防控工程技術研究中心，通遼 028043；3.內蒙古民族大學 乳源性致病菌研究所，通遼 028043）

糞腸球菌（Enterococcusfaecalis）是革蘭氏陽性兼性厭氧卵形球菌，其形成不同長度的鏈條狀；糞腸球菌生存能力強，種類多樣。具有在惡劣條件下（包括高鹽環境）和寬幅度溫度下（從10℃～45℃）生存的能力[1]。該細菌屬于人及動物腸道中的常在菌，但同時也是一種機會致病菌，在動物免疫力低時可引起感染[2]。腸球菌屬中有50多種成員，而且分布廣泛，其中以糞腸球菌和屎腸球菌為主要成員，占環境分離菌株的80%以上，已成為僅次于金黃色葡萄球菌的第二大醫源性感染致病菌[3]。

糞腸球菌的毒力基因聚集在一個毒力島上。毒力島基因長度在不同菌株之間只有微小差異，其長度約為150 kb，GC含量比基因組的其余部分低，兩側有末端重復序列[4]。盡管糞腸球菌具有致病潛力，但通常表現出較低的毒性水平，這可以從糞腸球菌作為大多數人類和動物胃腸道的天然定植菌，以及作為益生菌在人類和動物已使用了幾十年實踐來證明。在其毒力島上，最主要的致病因子是cylA溶血素（Cytolysin,cylA），又稱溶細胞素，在革蘭氏陽性菌中較普遍存在，cylA溶血素對真核和原核細胞都具有殺傷作用[5]?？梢允购型醚沫傊囵B基上出現溶血現象。在各種動物模型中，攜帶cylA致病因子的糞腸球菌比不攜帶cylA菌株致病性更強[6]。

糞腸球菌在以往曾被用作“益生菌”菌株在使用，但是由于發現其攜帶重要致病因子cylA溶血素后，被重新審視其“益生性”而關注其“致病性”。導致糞腸球菌存在致病性的基因除cylA外，還有多種毒力因子，可以引起多種疾病，致病機制復雜，各種毒力因子共同協作，其毒力因子主要分為兩種，其一為胞外分泌因子，如：絲氨酸蛋白酶（serine protease,sprE）、明膠酶（gelatinase,gelE），對宿主起到直接殺傷作用；另一種為表面蛋白，如：糞腸球菌表面蛋白（enterococcal surface protein,esp）、聚集物質（aggregation substance,AS）、膠原蛋白黏附素（adhesin of collagen,Ace）、腸球菌屬亮氨酸富集蛋白（enterococcal leucine-rich protein A,elrA）、心內膜炎抗原（endocarditis antigen,efaA），多為黏附素并且參與生物膜的形成，負責細菌的粘附與定植。作為機會性致病菌，引起炎癥反應需要具備相應的條件，免疫的第一道防線皮膚和黏膜會保護機體，不易被糞腸球菌感染。這時需要胞外分泌因子為糞腸球菌的粘附創造條件，而溶血素是分泌因子中最具殺傷力的，可以裂解真核細胞，使組織的完整性遭到破壞，為感染提供條件。因此，溶血素是使糞腸球菌具有致病性的主要毒力因子。

單核巨噬細胞是動物機體先天免疫系統的“第二道防線”[7]，在動物機體抵御病原感染中發揮重要的吞噬、殺滅作用，對于維護機體的健康扮演著重要的角色，同時具有重要的免疫調節作用。單核巨噬細胞在遇到致病菌侵染時可以分泌IL-4、IL-10、TNF-α和NOS2等多種細胞因子，這些細胞因子中有的作為前炎性細胞因子，具有關鍵的免疫調節機制。糞腸球菌是乳腺炎的病原菌之一，通過未經巴氏殺菌的鮮牛乳的銷售，有將致病性和耐藥性的糞腸球菌通過食物鏈傳遞到人類的風險。因此，本實驗擬觀察牛乳腺炎糞腸球菌cylA基因對體外培養的牛單核巨噬細胞吞噬作用的影響，為研究糞腸球菌的免疫逃逸機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株與細胞 奶牛乳腺炎糞腸球菌臨床分離菌株BME1708和奶牛乳腺炎糞腸球菌cylA基因缺失突變株BME1708ΔcylA由“內蒙古自治區乳源性致病菌防控工程技術研究中心”保存備用；牛外周血單核巨噬細胞BMC-7購買自青旗（上海）生物技術發展有限公司。

1.2 主要試劑 DMEM、澳洲胎牛血清（FBS）購自GIBCO；臺酚藍、胰蛋白酶、PBS、100×三抗（青霉素、鏈霉素、兩性霉素B）、DMSO、BHI培養基購自索萊寶公司。

1.3 主要儀器與設備 BSC-1100生物安全柜購自北京東聯哈爾儀器制造公司；SHP-150智能生化培養箱購自上海鴻都電子科技公司；CKX41倒置顯微鏡、日本奧林巴斯、BPN-50CH CO2培養箱購自上海一恒科技有限公司；DM500光學顯微鏡購自德國萊卡。

1.4 牛乳腺炎糞腸球菌的鑒定 配制BHI固體及液體培養基，取出-80℃冰箱凍存備用的糞腸球菌菌株，于BHI液體培養基中活化。將活化后的糞腸球菌菌株于鮮血固體培養基上培養，12 h后觀察結果是否出現溶血表型。挑取出現溶血表型的菌落接種于BHI液體培養基中，擴增后進行革蘭氏染色鏡檢和糖發酵實驗，對菌株進行鑒定。同時對cylA基因缺失突變株進行溶血活性檢測。

1.5 牛外周血單核巨噬細胞的復蘇 按90%DMEM+10%FBS+1% 100×三抗（青霉素、鏈霉素、兩性霉素B）配制完全培養基。將凍存管從液氮罐中取出，直接浸入37℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。用移液槍吸出細胞懸液，加到離心管并滴加5倍以上完全培養基混勻，1000 ×g離心10 min。棄去上清液，重懸離心管底部細胞沉淀，在T25培養瓶中加入5～6 mL完全培養基，計數，調整細胞密度，接種培養瓶，37℃培養箱靜置培養。

1.6 牛外周血單核巨噬細胞的培養 將細胞分裝至T25細胞培養瓶，加入完全培養基，置于37℃、5% CO2恒溫培養箱中靜置培養，每48 h換液一次。細胞愈合度達到80%時，進行傳代，吸出完全培養基，PBS緩沖液輕沖洗3遍，加入胰酶2 mL消化（具體時間視細胞而定），待細胞成球形用完全培養基終止消化并將細胞沖洗下來。1000 ×g離心10 min，棄上清液收集細胞。重懸細胞，血細胞計數板計數。按每孔1.0×106個細胞，接種至12孔板，培養至貼壁。

1.7 牛外周血單核巨噬細胞的凍存 按90%FBS+10%DMSO配置細胞凍存液（現用現配）。取待凍存的細胞用2.0 mL胰酶消化2 min，用完全培養基將細胞沖洗下來。1000 ×g離心10 min，棄上清液收集細胞。加入1.0 mL細胞凍存液制成細胞懸液，裝入3支凍存管中。凍存管在4℃下存放30 min，轉放-20℃下放置1.5～2 h，再轉入-70℃下放置4～12 h 后即可轉移到液氮內（-196℃）。

1.8 糞腸球菌侵染牛外周血單核巨噬細胞臺酚藍染色觀察 將糞腸球菌以100∶1的比例稀釋后對巨噬細胞進行侵染，吸去細胞培養液，每孔加入1×108個BME1708或BME1708ΔcylA，37℃侵染30 min，加入三抗，PBS清洗兩次，加入完全培養基。按照時間梯度2、4、8、12、24、48 h取樣，臺酚藍染色，觀察。計算吞噬率（phagocytic rate,PR）和吞噬指數（phagocytic index,PI）[8]。PR（%）=噬菌細胞數÷細胞總數×100%；PI=被噬菌總數÷噬菌細胞數。

2 結果

2.1 糞腸球菌溶血表型鑒定結果 野生型糞腸球菌在含有兔血的固體培養基上出現明顯的β溶血圈，符合攜帶cylA溶血素基因的糞腸球菌溶血特性，cylA基因缺失突變株，無溶血素表達，無β溶血圈（圖1）。

圖1 糞腸球菌溶血表型鑒定Fig.1 Identification of hemolysis of Enterococcus faecalis

2.2 革蘭氏染色鏡檢觀察結果 活化后的BME1708菌株，經革蘭氏染色后于光學顯微鏡油鏡下觀察，細菌呈紫色、橢圓形，形成長度不等的鏈條狀排列（圖2）。

圖2 糞腸球菌革蘭氏染色鏡檢觀察結果（2000×）Fig.2 Gram staining results of Enterococcus faecalis（2000×）

2.3 糖發酵實驗結果 BME1708菌株對木糖、棉子糖發酵實驗結果為陰性，對葡萄糖、果糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、甘露醇、山梨醇和水楊素發酵實驗結果為陽性，與糞腸球菌糖發酵特性相符。

2.4 牛外周血單核巨噬細胞培養結果 用倒置顯微鏡觀察巨噬細胞生長狀態。體外培養的巨噬細胞貼壁生長，呈梭形、圓形及橢圓形（圖3）。實驗發現0.25%的胰酶不易消化貼壁細胞，符合巨噬細胞具有強大貼壁能力的特點。

圖3 巨噬細胞體外培養觀察結果（1000×）Fig.3 Results of macrophage culture in vitro（1000×）

2.5 糞腸球菌侵染巨噬細胞臺酚藍染色觀察結果 經利用BME1708和BME1708ΔcylA菌株對牛體外培養的單核巨噬細胞侵染實驗后，結果表明，被巨噬細胞吞噬的糞腸球菌可以在細胞內存活，形成明顯的吞噬泡，隨著侵染時間的延長有部分巨噬細胞死亡（圖4）。而且巨噬細胞對BME1708ΔcylA的吞噬率和吞噬指數明顯高于BME1708，吞噬率和吞噬指數具有顯著差異（P＜0.05），表明牛乳腺炎糞腸球菌cylA基因對牛外周血單核巨噬細胞的完全吞噬功能具有一定的負調控作用。吞噬指數及吞噬率見表1和圖5。

表1 吞噬率和吞噬指數Table 1 Phagocytic rate and phagocytic index

圖4 糞腸球菌侵染巨噬細胞Fig.4 Enterococcus faecalis infection of macrophages

圖5 BME1708及BME1708ΔcylA菌株侵染巨噬細胞的吞噬率（PR/%）和吞噬指數（PI）Fig.5 Phagocytosis rate（PR/%）and phagocytosis index（PI）of BME1708 and BME1708ΔcylA infected macrophages

3 討論

過去，糞腸球菌在食品工業中被用作發酵劑，一些可以產生腸球素的菌株被用作生物防腐劑[9]。糞腸球菌的致病機制依賴于多種因素[10]。隨著抗生素的過度使用，糞腸球菌的耐藥性也逐漸增強，耐藥性增強導致感染后的治療難度加大，同時毒力基因更容易使糞腸球菌在宿主體內定植，使得近年來糞腸球菌感染率呈明顯的上升趨勢。

與其他致病菌不同的是糞腸球菌編碼的毒力因子主要對宿細胞具有黏附作用。Ró?ańska等[11]研究發現，從2000份患有乳腺炎的牛奶樣本中分離出的腸球菌屬的細菌中，糞腸球菌占85%，其中有45%的糞腸球菌具有3種以上的耐藥表型。Yun等[12]對乳制品公司的散裝牛奶中乳腺炎病原體的檢測發現，糞腸球菌的含量僅次于葡萄球菌位居第二。Yoon等[13]從乳制品公司的散裝牛奶中分離腸球菌，其中糞腸球菌占90.23%。這些研究成果表明，該致病菌在牛乳中的存在，足以構成牛乳及其產品的生物危害風險和公共衛生危害。

糞腸球菌現已成為奶牛乳腺炎的主要致病菌，根據對內蒙古自治區東部地區奶牛乳腺炎乳樣的菌株篩查發現，糞腸球菌的分離率高達70%。在本研究中采用的奶牛乳腺炎糞腸球菌臨床分離菌株BME1708的全基因組測序中發現，該菌具有27種抗生素耐藥基因和82個相關毒力因子，并且發現了p38-MAPK信號通路的存在[14]。我們主要研究其中的關鍵毒力因子溶血素，而cylA基因編碼的蛋白在溶血素的形成過程中起到最關鍵的激活功能[15]。本研究以糞腸球菌cylA基因陽性野生型菌株和cylA基因缺失突變株侵染巨噬細胞，發現cylA基因可以抑制單核巨噬細胞對糞腸球菌的吞噬作用。在48 h后野生型菌株在巨噬細胞內仍有“內生”的現象，推測cylA與糞腸球菌被單核巨噬細胞吞噬后的“內生”現象有關。

本研究為下一步利用BME1708和BME1708ΔcylA基因缺失突變株侵染巨噬細胞，根據IL-4、IL-10、TNF-α和NOS2等多種細胞因子的轉錄及表達差異情況，以及p38-MAPK信號通路的激活情況，來獲得糞腸球菌“逃逸”單核巨噬細胞的吞噬及清除功能的分子機制奠定實驗基礎。為有效防控該致病菌提供新的思路。