戊型肝炎病毒研究進展

李獲朋，胡重重，鄭 宇，田月薇，陳昭慧，劉 波，楊憶斐，劉天龍，佘銳萍，米榮升，石蕊寒，尹文嬌，肖 鵬，田紀景

（1.中國農業大學動物醫學院，北京 100193；2.北京市房山區新農村建設服務中心，北京 102488；3.中國農業科學院上海獸醫研究所，上海 200241；4.北京市農林科學院畜牧獸醫研究所，北京 100097；5.中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所，北京 102206；6.云南農業大學動物醫學院，昆明 650201）

戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）是一種重要的人畜共患病原，也是全球范圍內引起急性病毒性肝炎的主要原因。據世界衛生組織統計，全球每年約有2000萬人感染HEV，其中約有330萬臨床病例，導致4.4～7萬人死亡。HEV可感染多種家畜、家禽以及其他經濟動物，對動物生產以及人類動物源食品安全造成了嚴重的威脅。因此，了解HEV的流行病學、病原學及其對人類和動物健康的損傷，有助于預防病毒感染以及臨床治療藥物開發。

1 流行病學

1.1 HEV的全球分布及其生活史

HEV是目前已知的5種肝炎病毒之一，病毒分類學研究將其劃歸為戊型肝炎病毒科，其又可分為兩個屬，即正戊型肝炎病毒屬（Orthohepevirus）和魚戊型肝炎病毒屬（Piscihepevirus）。目前研究較多的哺乳動物和禽類HEV均屬于正戊型肝炎病毒屬，其主要分為A-D 4個種[1]，A種群可感染人、家豬、野豬、鹿類和兔等，包含至少8個基因型，HEV-1和HEV-2僅感染人類，主要流行于亞洲、非洲和拉丁美洲的熱帶和亞熱帶地區；HEV-3和HEV-4屬于人獸共患病毒，在全球范圍內均有流行；HEV-5和HEV-6僅在野豬中發現，HEV-7和HEV-8分別在阿拉伯單峰駱駝和中國雙峰駱駝中發現[2]；B為禽類HEVs，感染家禽和野生鳥類；C可感染鼠、雪貂和狐貍；D在蝙蝠、鹿和紅隼中發現。HEV基因型多樣性最大的地區是東南亞，而目前我國HEV流行基因型也已經從最初以HEV-1為主變成以人獸共患的HEV-4型為主（圖1）。

圖1 HEV-4、HEV-3、HEV-1和HEV-2全球分布Fig.1 Global distribution of HEV-4,HEV-3,HEV-1 and HEV-2

目前，HEV的生活史比較模糊，其侵入細胞的過程和宿主對應受體尚不清楚。Kenney等[3]認為，無囊膜的HEV（non-enveloped HEV,neHEV）粒子與細胞表面的硫酸肝素蛋白多糖（Heparin sulfate proteoglycan,HSPGs）[4]以及熱休克同源蛋白70（Heat shock homologous protein 70,HSP70）等受體結合，隨即病毒粒子通過動態蛋白-2（Dynamic protein-2）、網格蛋白（Clathrin）和膽固醇（Cholesterol）介導進入細胞[5]；而有囊膜的HEV（quasi-enveloped HEV,eHEV）粒子則可直接通過網格蛋白介導的信號通路進入細胞，隨后在HSP90和Grp78作用下將病毒運送到釋放基因組的位點。一旦釋放到細胞質中，正鏈RNA作為信使RNA（messenger RNA,mRNA）翻譯出開放閱讀框（open reading frame 1,ORF1）。在粗面內質網（rough endoplasmic reticulum,RER）或RER衍生的膜小泡中[6]，ORF1編碼的非結構蛋白在宿主蛋白（包括延伸起始因子）和病毒蛋白（如：ORF4編碼的蛋白）的參與下將正鏈RNA基因組轉錄成負鏈中間產物，后者翻譯出ORF2和ORF3蛋白[7]。在病毒裝配且在向質膜移動的過程中，ORF2與病毒基因組RNA結合并開始多聚，此時ORF3參與進來，通過ORF3蛋白與宿主空泡分選蛋白（如腫瘤抑制基因101）的相互作用，病毒顆粒進入細胞內小泡并在質膜處進行釋放[8-10]。經宿主消化系統，病毒囊膜會丟失。而釋放到血液中的HEV似乎保留了為了躲避宿主免疫系統的囊膜[3]（圖2）。

1.2 HEV對于社會生產實踐的影響 HEV因其廣泛的宿主適應性，不僅危害人類和動物的健康，同時也影響到動物源食品的安全。在禽類，HEV感染往往與其他病毒感染同時存在，如禽白血病病毒（Avian leukemia virus,ALV）、禽腺病毒（Avian adenovirus,FAdV）和雞傳染性貧血病毒（Avian infectious anemia virus,CIAV）[11]。我們在獸醫臨床中也發現HEV與豬圓環病毒（Porcine circovirus 2,PCV2）共感染的病例[12]。而近年在中國更是有人群聚集性感染HEV的相關報道，如2018年7月在山東青島就有一起因食用了未徹底加熱的豬肝而導致41人（14.5%，41/283）急性感染HEV事件，其中21人表現出臨床癥狀，經基因組學分析確診為HEV-4型感染[13]。因此，HEV作為一種重要的人獸共患病原，其對人類健康、畜牧獸醫生產以及動物源食品安全的潛在危害不容小覷。

2 HEV病原學研究

2.1 HEV病毒粒子結構 HEV是單股正鏈RNA病毒，病毒基因組為7.2～7.4 kb。該病毒在無囊膜狀態下直徑為27～34 nm，其基因組由4個開放閱讀框組成，即ORF1、ORF2、ORF3和ORF4（僅存在于HEV-1）（圖3）。病毒基因組5'端是以7-甲基鳥嘌呤開頭的非翻譯區（具有27個核苷酸），后接ORF1編碼區。ORF1是一個大的非結構蛋白，包括多個功能域，如甲基轉移酶（methyltransferase）、假定的木瓜蛋白酶樣半胱氨酸蛋白酶（papain-like cysteine protease,PCP）、X域、解旋酶和RNA依賴的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp），這些功能域決定了ORF1在HEV基因組復制方面的能力[14]。ORF2將寡聚形成二十面體衣殼，包裹病毒RNA。最近有研究報道ORF2衣殼蛋白有三種形式，即感染性/細胞內ORF2（ORF2i）、糖基化ORF2（ORF2g）和切割ORF2（ORF2c）。ORF2i蛋白使得HEV顆粒具有感染能力，而ORF2g和ORF2c蛋白與HEV顆粒的感染性無關[15]。因此，推測機體對HEV過量的免疫反應極有可能是對后兩者的反應，這可能是HEV免疫逃逸的機制之一。目前普遍認為ORF3是HEV RNA的重要離子通道，其除了可以磷酸化外，N端的半胱氨酸殘基還可被一種尚未確認的棕櫚酰轉移酶棕櫚?；?，該轉移酶不僅決定其膜結合位點和亞細胞定位，也是細胞釋放感染性病毒過程所必需的酶[16]。ORF4可編碼一個20 kDa的內質網應激蛋白，該蛋白與宿主和病毒蛋白相互作用，控制病毒遺傳物質依賴的RNA聚合酶的活性[17]。因此，推測ORF1和ORF2決定了病毒的宿主特異性，ORF3與HEV感染性相關。

圖3 HEV RNA模式圖Fig.3 HEV RNA diagram

2.2 HEV-1型和HEV-2型 HEV-1與HEV-2僅感染人類，主要經過糞-口途徑或受污染的水源傳播，孕婦感染有更嚴重的臨床癥狀。懷孕可能會導致HEV復制效率增高，病毒血癥持續時間較長。研究發現，HEV-1可以使蛻膜和胎盤基質中的趨化因子、生長因子等分泌紊亂，從而利于HEV-1傳播，同時也會導致組織損傷[18]。HEV-2感染孕婦的致死率可達25%，這可能是由于肝臟生物合成受阻、代謝紊亂等因素造成，此外也表現出早產、流產與死胎。HEV-2也通常在年輕人中引起短暫急性自限肝炎，臨床癥狀與其他急性病毒性肝炎沒有區別。

HEV-1型曾在我國新疆等地暴發過，導致數十萬人感染[19]。近十年來，隨著我國公共衛生環境的改善，HEV-1的感染率逐年下降。有相關文獻指出，HEV感染可能已由HEV-1為主的形式轉變為以HEV-4為主，并偶爾呈散發性流行或聚集性暴發[13,20]。

2.3 HEV-3型和HEV-4型 這兩種基因型HEV為人獸共患病原，廣泛分布于全球各地，但其主要宿主為家豬和野豬。HEV-3可在免疫功能低下的患者中呈現慢性感染；而由HEV-4導致的慢性感染也有零星報道[21]。慢性感染最顯著的肝外表現包括格林-巴利綜合征（Guillain-Barre syndrome,GBS）、神經性肌萎縮癥（Neuralgia muscle atrophy,NA）、腦膜腦炎、多發性神經炎等的神經系統后遺癥[22]以及膜增生性腎小球腎炎、冷球蛋白血癥（Cryoglobulinemia）等癥狀的腎臟損傷[23]。日本的一項全國性調查發現，在2625名實體器官移植患者（99名心臟移植患者和2526名腎臟移植患者）中，有12名HEV陽性患者，其中42%的患者發展為慢性肝炎[24]。Sooryanarain等[25]研究指出，慢性戊型肝炎病例在接受心臟、肝臟、肺臟或腎臟移植的患者中較為常見。由此可見，HEV-3型和HEV-4型慢性感染及其所導致的肝外損傷值得特別關注。

2.4 HEV-5～HEV-8型 這幾種基因型HEV主要在動物中有報道，但近年也證實了從野生環境中分離出的HEV-5可感染非人靈長類動物，充分說明其在人群中具有潛在的傳播風險[26]。HEV-7和HEV-8分別在阿拉伯單峰駱駝和中國雙峰駱駝體內被檢測到[2]，而前者已在肝移植受體患者中發現[27]。鑒于這幾種類型HEV發現較晚，其在人群和動物的感染和流行情況還有待于進一步的調查研究。

3 HEV感染對機體的損傷及其致病機制

3.1 戊型肝炎臨床癥狀及肝臟損傷 在散發HEV感染病例中，最常見的是引起黃疸、發熱和腹痛，也可表現為急性或慢性肝病從而導致急性呼吸困難，腹水和出血。在發達國家，大多數老年男性感染后表現為急性、自限性疾??；若既往有肝病史的患者將會存在肝衰竭、肝硬化和慢性肝炎的風險。感染初期，谷丙轉氨酶（alanine aminotransferase,ALT）和谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase,AST）明顯升高；Malcolm等[28]研究顯示HEV感染引起肝細胞凋亡、局灶性壞死以及細胞質膽紅素沉積。Liu等[29]研究表明在HEV感染沙鼠后，沙鼠肥大細胞數目明顯高于對照組，說明肥大細胞在HEV引起的肝損傷過程中發揮重要作用。

3.2 消化系統是HEV侵入機體的第一道防線 HEV作為一種可經糞-口途徑傳播的病毒，腸道是其侵入機體的第一道障礙。Mao等[30]研究發現，感染沙鼠的十二指腸、空腸、回腸的黏膜上皮處檢測到了HEV的抗原陽性信號。Marion等[31]研究發現，HEV可在腸上皮細胞中復制，并在HEV感染患者十二指腸和回腸的深層腸隱窩中檢測到ORF2蛋白。另外，胰腺炎的發生也與HEV感染有潛在聯系[32]。深入研究HEV在消化道，特別是腸道黏膜上皮細胞的定植和傳播，以及腸道黏膜免疫是否參與HEV感染和逃逸過程的研究，將有助于揭示HEV入侵和感染機體的分子機制。

3.3 HEV感染引起泌尿系統組織損傷 除消化系統外，腎臟也是HEV感染的潛在靶器官之一。Geng等[33]在自然感染HEV患者和人為感染HEV猴的尿液中均檢測到了HEV RNA和ORF2抗原，并在猴腎臟檢測到ORF2蛋白陽性以及觀察到腎小管蛋白管型和間質炎性細胞浸潤。Wu等[34]也在HEV感染實驗兔腎臟中檢測到HEV RNA陽性。HEV侵入腎臟并引起泌尿系統損傷的機制還有待于進一步研究。

3.4 HEV感染引起生殖系統損傷 妊娠期雌性生殖系統是HEV侵入機體主要攻擊目標之一。盡管孕婦高死亡率的致病機制尚未完全被解析，但通常歸因于宿主遺傳背景、妊娠期激素水平和機體免疫力的改變。Xia等[35]利用兔模型證實，HEV是通過進入胎盤中復制并完成垂直傳播的，且母乳中未檢測到HEV。An等[36]研究顯示豬源HEV可以感染兔并在其卵巢中復制，卵巢間質和卵泡細胞表現出分散性壞死，淋巴細胞浸潤以及卵巢組織中出現細胞加速凋亡的現象，并且感染了HEV的卵子一旦受精，病毒便可以進入受精卵。

對于雄性生殖系統，HEV抗原蛋白可在睪丸間質細胞（Leydig cells,LCs）和曲細精管周圍肌樣細胞（Myoid cells around testicular tubule,TPC）中被檢測到，此外即使血液中病毒被清除后，仍可在睪丸中長期被檢測到[37]。Soomro等[38]的研究發現，HEV感染沙鼠的睪丸支持細胞排列松散，細胞核固縮，腔內生殖細胞脫落，并形成多核巨細胞，生精小管基底膜變薄。精原細胞和生精細胞排列松散、稀疏和無序，細胞發生變性、壞死，附睪內的精子密度較低，導管結構發生畸變。但目前尚未有證據表明HEV感染與男性不育有必然聯系。

3.5 免疫系統參與HEV的識別及慢性感染過程 HEV感染在免疫抑制患者（如器官移植、HIV感染）中常呈現慢性，但有研究表明在有系統性紅斑狼瘡病的人群中也可觀察到慢性HEV感染[39]；與健康人相比，免疫功能正常的急性戊型肝炎患者，其外周血中NK細胞的比例略低，活化NK細胞比例卻較高[44]，所以推測NK細胞在病毒清除過程中起著重要的作用。另外，研究發現RIG-I信號通路參與識別HEV抗原蛋白和HEV RNA 3'端非編碼區的核苷酸序列，并可進一步誘導細胞干擾素基因的轉錄和表達上調，從而發揮抗病毒效應[41-44]。

3.6 HEV可在神經系統中復制并引起神經癥狀 神經系統并發癥是HEV感染最為常見的癥狀，也是最受人們關注的一點。Shi等[45]的研究發現，HEV可以感染沙鼠腦和脊髓組織并在其中復制，且感染沙鼠腦組織中緊密連接蛋白ZO-1（Zonula occlidens-1）表達量下降，而星形膠質細胞數量顯著增加。這一結果證實HEV能夠破壞血腦屏障（Blood brain barrier,BBB），并與神經系統損傷有直接關系。HEV感染引起的神經系統并發癥主要有兩種臨床表現：第一種是有周圍神經參與，最常見的表現為GBS和NA。第二種是中樞神經系統損傷，表現為腦膜炎（Meningitis）、腦炎（Encephalitis）等。雖并不是所有GBS都由HEV感染所致，但不可否認HEV確實是GBS發生的一個重要誘因，與GBS不同，已有研究證實了HEV與NA的關系，該研究結果顯示在47名NA患者中，所有患者都有HEV感染病史[46]，有5名（10.6%）有近期HEV感染的血清學證據。在動物模型中，HEV感染則可引起病毒性腦炎相關的病理變化，血腦屏障的破壞以及線粒體介導的神經細胞凋亡是HEV引起神經系統損傷的潛在原因[47-48]。而HEV突破血腦屏障并引起神經系統損傷的分子機制還有待于進一步深入研究。

4 細胞和動物模型研究進展

HEV體外培養和動物感染實驗在近年取得了較大的進步。目前，比較常用的細胞包括HepG2、PLC/PRF/5、Huh7、A549、Caco-2、PK-15和ST等；兔、豬、沙鼠以及非人靈長類動物等也已被證實可成功感染HEV。

4.1 細胞模型 HEV細胞感染模型最常用的有PLC/PRF/5和A549等，其還可在極化的Caco-2細胞中復制，并且能從細胞頂膜釋放，而HEV-1型和3型可在JEG-3細胞中復制。人原代肝細胞（Primary human hepatocytes,PHHs）和少突膠質細胞系也被用于HEV體外感染。另外，多能干細胞（Pluripotent stem cells，hESC/iPSC）誘導的肝細胞樣細胞（Hepatocyte like cells,HLCs）也是一個在HEV研究中很有意義的細胞系[49]。

4.2 動物模型 HEV感染豬的動物模型不僅成功證實HEV是嗜肝病毒，并且發現它可在肝外組織中復制，如小腸、淋巴結和結腸[50]。Cao等[51]建立了在免疫抑制條件下慢性HEV感染豬的動物模型，而這種模型將有助于開發針對慢性HEV感染的治療藥物。除此之外，豬作為HEV的保存宿主亦可作為生產HEV抗體的試驗動物。

兔也可作為研究HEV跨種間感染的動物模型。兔易感HEV-3型，但也可感染其他型，因此，可作為動物模型用于研究神經系統疾病和妊娠期感染。研究發現，在HEV感染的孕兔體內天冬氨酸轉氨酶、谷草轉氨酶、TNF-α和IFN-γ水平顯著升高[52]。另外，兔也被用于戊型肝炎疫苗研究。如Chen等[53]利用HEV-4型不同的三個ORF2多肽片段完全保護了兔子免受豬源HEV感染。

嚙齒類也是重要的實驗動物。但直到最近，才有報道大鼠HEV毒株LA-B350能夠有效的感染裸鼠[54]。然而，Schlosser等[55]研究發現Wistar大鼠似乎對HEV-1、HEV-3和HEV-4型具有一定抵抗力。具體能否作為模型還有待進一步研究。事實上，人肝嵌合鼠不乏是一種有效的動物模型。Sayed等[56]通過HEV-3感染人肝嵌合鼠模型證實了ORF2-Ag可用作活動性HEV感染的標志物，可用于評估抗病毒治療的效果。長爪沙鼠也是研究HEV致病機制常用的實驗動物，研究發現，在感染沙鼠的多個組織器官，包括肝臟、睪丸、腦和脊髓等組織均可檢測到HEV RNA陽性或抗原蛋白的表達[29,38,45]。

雞是禽HEV的宿主，HEV通過糞-口途徑在雞群間傳播。雞模型已被證明在疫苗研究中有不可磨滅的作用，Wang等[57]使用pTX8048載體構建了以ORF2為抗原基礎的三種口服疫苗，可以有效控制雞的aHEV感染。

除此之外，雪貂等已經被證明可以作為研究HEV感染和致病機制的動物模型。Wang等[58]的研究結果顯示，在我國實驗雪貂和養殖雪貂中均檢測到不同的戊型肝炎病毒C2基因型；而Li等[59]在一篇HEV動物模型的文章中明確指出雪貂在持續性戊型肝炎研究領域的重要意義。

5 目前存在的問題以及展望

HEV在全球廣泛分布和流行，對人類健康造成嚴重隱患?？茖W證據已充分證明了豬、鹿以及其他動物性食品，成為了人類感染HEV-3型或4型的重要來源。關于HEV的生活史，Kenney等[3]提出了一個相對完善的模型，但有關HEV進入細胞所依賴的具體蛋白還未完全闡明。HEV的肝外損傷成為近年的熱門方向，但大多停留在現象的觀察上，對于入侵途徑、致病機制等問題的研究還比較欠缺。除此之外，有關HEV的病毒純化仍存在一定困難。綜上所述，HEV感染雖是以引起肝臟損傷為主，但肝外癥狀也受到人們越來越多的關注，完善HEV動物和細胞培養模型，將有助于揭示HEV的生活史、感染史和致病機制，以及抗病毒藥物和治療藥物的開發。