辣椒疫霉病菌拮抗菌的篩選鑒定及生防潛力

鄭迪文，周游，謝芳玲，謝宗寶，劉峰，朱宏建*

辣椒疫霉病菌拮抗菌的篩選鑒定及生防潛力

鄭迪文1，周游1，謝芳玲1，謝宗寶1，劉峰2,3，朱宏建1*

(1.湖南農業大學植物保護學院，湖南 長沙 410128；2.嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室，廣東 廣州 510006；3.湖南農業大學園藝學院，湖南 長沙 410128)

從湖南省長沙、衡陽、岳陽等地辣椒種植區土樣中分離篩選出6株拮抗辣椒疫霉病菌的放線菌，采用含毒介質法檢測，發現L57–60菌株發酵液的5倍稀釋液對辣椒疫霉菌的抑制效果達到98.61%；通過形態學特征觀察、生理生化特性鑒定以及16S rDNA、基因、基因和基因聯合建樹分析，確定L57–60菌株為橄欖色鏈霉菌()?？咕V測定結果表明，L57–60菌株發酵液對辣椒枯萎病菌()、煙草炭疽病菌()、水稻紋枯病菌()等12種病原菌均有拮抗作用。運用正交試驗對L57–60菌株發酵培養基的碳源和氮源配比進行優化，結果最適培養基為高氏1號培養基，大米粉質量分數4%，黃豆粉質量分數0.5%。盆栽試驗結果表明，L57–60菌株發酵液對辣椒疫霉的防效達到73.1%。

辣椒疫??；橄欖色鏈霉菌；發酵培養基優化；盆栽防效

辣椒疫病是辣椒的主要病害之一，寄主廣泛并具有很強的環境適應能力[1–3]。對辣椒疫病的防治主要依賴化學藥劑[4]。但隨著化學藥劑的長期使用，抗藥性、環境污染以及防治效率降低等問題也相繼出現[5]，因而生物防治成為研究熱點。周成萍等[6]從原始林區采集的土壤中分離獲得1株對辣椒疫霉菌抑制效果明顯的放線菌WZ60，田間防效可達90%。劉曉瑜等[7]從15株植物內生菌中篩選獲得1株鏈霉菌，發現其發酵液粗提物和揮發性物質能夠明顯地抑制辣椒疫霉菌菌絲生長，并且其孢子液不僅能夠提高辣椒幼苗對辣椒疫病的抗性，還能促進辣椒幼苗的生長。王鑫[8]發現2株鏈霉菌能夠促進辣椒根系AM真菌共生結構的形成及其生態功能的發揮。黃大野等[9]發現1株淡紫色褐鏈霉菌與烯酰嗎啉具有相容性，聯合使用可以減少烯酰嗎啉在防控辣椒疫病中的藥劑使用量。盡管篩選的對辣椒疫病具有生防效果的鏈霉菌比較多，但能夠應用到生產實際的菌株仍然稀少。筆者從湖南省長沙、衡陽、岳陽等地辣椒種植區采集土樣，分離純化出472株放線菌株，與辣椒疫霉病菌進行拮抗試驗，最終篩選并鑒定了1株對辣椒疫霉菌具有明顯抑制效果的生防鏈霉菌；對其發酵培養基進行了優化，通過測定抑菌譜以及盆栽防效試驗，評價其生防潛力，以期為辣椒疫病的有效防治提供生防資源。

1　材料與方法

1.1　材料

2022年3—5月，分別從湖南省長沙、衡陽、岳陽等地辣椒種植區采集健康辣椒的根際土壤18、23、26份，裝入無菌密封塑料袋，置于4 ℃冰柜中儲藏。

供試靶標菌為辣椒疫霉病菌()。供試病原菌有尖孢炭疽病菌()、辣椒枯萎病菌()、煙草炭疽病菌()、水稻紋枯病菌()、冬瓜枯萎病菌(f. sp.)、馬鈴薯早疫病菌()、辣椒白絹病菌()、水稻惡苗病菌()、白菜黑斑病菌()、交鏈格孢()、西瓜枯萎病菌(f. sp.)、瓜果腐霉()、葡萄座腔菌()、小麥赤霉病菌()，由湖南農業大學植物保護學院保存。

1.2　方法

1.2.1辣椒疫霉菌拮抗菌的分離篩選及鑒定

采用稀釋涂布平板法[10]分離土樣中放線菌菌株；挑取單菌落，采用平板對峙法[11]和含毒介質法[12]篩選辣椒疫霉菌的拮抗菌，對產生抑菌帶的菌株進行純化保存。挑選抑菌效果最佳的菌株進行形態學鑒定[13]、生理生化特性測定[14]以及分子生物學鑒定[15]。

1.2.2辣椒疫霉菌拮抗菌發酵培養基配方的優化

采用單因素控制變量法[16]，對辣椒疫霉菌拮抗菌發酵培養基(高氏1號)[17]中的碳源(葡萄糖、可溶性淀粉、大米粉、玉米粉)和氮源(黃豆粉、酵母粉、蛋白胨、硫酸銨)進行優化；采用正交法[18]對碳源和氮源的配比進行優化。

1.2.3辣椒疫霉菌拮抗菌的抑菌譜及盆栽防效測定

1) 參照李婧婷等[19]的方法，以尖孢炭疽菌、辣椒枯萎病菌、煙草炭疽病菌等14種病原真菌為指示菌，測定拮抗菌的抑菌譜。

2) 種植辣椒48盆，待辣椒長出6片真葉, 先灌根30 mL藥液, 在灌根1 d后接種1×105cfu/mL的辣椒疫霉孢子液5 mL后，設置6個處理組：A組，無菌玉米培養液；B組，稀釋400倍的甲霜靈錳鋅可濕性粉劑；C組，拮抗菌株發酵液；D組，稀釋2倍的拮抗菌株發酵液；E組，稀釋3倍的拮抗菌株發酵液；F組，稀釋4倍的拮抗菌株發酵液。7 d后開始調查辣椒苗發病情況，計算病情指數和防治效果[20]。

1.3　數據處理

采用Excel 2010和SPASS 20.0統計軟件處理分析試驗數據；運用MEGAX軟件繪制系統發育樹。

2　結果與分析

2.1　辣椒疫霉病拮抗菌的篩選及鑒定結果

從湖南省長沙、衡陽、岳陽等地辣椒種植區采集的67份土壤中分離出472株放線菌，以辣椒疫霉病菌為指示菌，共篩選出6株拮抗鏈霉菌，其中L57–60菌株的抑菌效果最佳，該菌株的5倍無菌發酵液的抑制率能達到98.61%(圖1)。觀察發現，菌株L57–60的發酵液能使辣椒疫霉菌的菌絲發生扭曲、變形(圖2)。

1　CK；2　稀釋5倍液；3　稀釋10倍液。

圖2　L57–60菌株發酵液對辣椒疫霉菌菌絲的抑制作用

菌株L57–60在蔗糖察氏平板上生長良好，其氣生菌絲呈淺褐灰色，基絲為黃褐色，表面不光滑(圖3)。生理生化特性測定結果表明，菌株L57–60可利用葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖、麥芽糖、肌醇、山梨醇、酪氨酸、鼠李糖和半乳糖，不能利用阿拉伯糖、果糖和木糖；能夠水解淀粉，不產硫化氫，明膠液化快，能夠在纖維素上生長。結合形態學觀察和生理生化特性測定結果，初步鑒定該菌株為鏈霉菌屬()。

圖3　L57–60菌株在蔗糖察氏培養基上的菌落形態

通過試劑盒提取L57–60菌株DNA，分別用16S rDNA、、、引物對進行PCR擴增，結果見圖4。經測序可知，16S rDNA、、、基因大小分別為1416、915、1012、972 bp。將序列置NCBI進行比對，L57–60菌株與橄欖色鏈霉菌()的序列相似性達到97.78%。選取高度相似的序列并查找該序列對應物種的其他3個基因的序列，通過BioEdit和Clustal進行比對和編輯，并利用Mega X對同一物種的不同基因進行拼接后建樹。結果表明，L57–60菌株與橄欖色鏈霉菌在同一分支上(圖5)。

圖4　16S rDNA、recA、atpD、rpoB引物PCR擴增凝膠電泳結果

圖5　16S rDNA、recA、atpD、rpoB多基因聯合建樹

2.2　辣椒疫霉菌拮抗菌發酵培養基的較優配方

單因素試驗結果表明，當高氏1號培養基以大米粉和玉米粉為碳源時，拮抗菌發酵液抑菌率達100%；以黃豆粉為氮源時，拮抗菌發酵液的抑菌率達96.64%(表1)。綜合考慮發酵成本，選擇大米粉和黃豆粉為碳源和氮源。

表1　不同碳源和氮源的L57–60發酵液的抑菌率

同列數據后的不同字母表示差異有統計學意義(<0.05)。

選擇大米粉作為碳源，黃豆粉作為氮源，設計L16(42)的正交試驗，L57–30發酵液抑菌率列于表2。結果表明，第9、10、12、13號組合的抑菌率較高，其中質量分數4%大米粉和質量分數0.5%黃豆粉組合的抑菌率達100%，說明發酵液抑菌效果最好，確定較優發酵培養基碳源為質量分數4%大米粉，氮源為質量分數0.5%黃豆粉。

表2　菌株L57–60發酵培養基碳源和氮源正交試驗的抑菌率

同列不同字母表示正交組合間抑菌率的差異有統計學意義(<0.05)。

2.3　辣椒疫霉菌拮抗菌的抑菌譜及盆栽防效

選取14種植物病原真菌，測定L57–60菌株的抑菌譜，發現該菌株的抑菌譜較廣，對12種植物病原真菌有抑制作用，其菌絲生長抑制率為5.16%～85.19%(表3)。其中，對馬鈴薯早疫病菌、葡萄座腔菌的抑制效果較好，其抑制率分別為85.19%和80.15%，對白菜黑斑病菌、西瓜枯萎病菌沒有抑制效果。

表3　L57–60菌株發酵液的抑菌譜

同列數據不同字母表示對病原菌抑制率間的差異有統計學意義(<0.05)。

接種辣椒疫霉孢子液7 d后，A組、D組、E組和F組的辣椒植株莖基部溢縮，出現褐色病斑。病情指數和盆栽防效列于表4。結果顯示，使用玉米發酵培養基處理的植株病情指數最高，發病情況比較嚴重；使用稀釋400倍的甲霜靈錳鋅處理的植株病情指數最低，盆栽防效為84.6%；使用L57–60發酵原液處理的植株病情指數較低，其防治效果為73.1%，說明L57–60菌株發酵液對辣椒疫病具有較好的防治效果。

表4　L57–60菌株對辣椒疫病的盆栽防效

3　結論與討論

結合菌株L57–60在特定培養基上的形態學特征、生理生化特性測定結果以及分子生物學鑒定結果，鑒定其為橄欖色鏈霉菌()，其發酵液對辣椒疫霉菌有較好的抑制作用。辣椒疫霉菌的菌絲在含發酵液的PDA平板上出現明顯的扭曲、萎縮，說明菌株L57–60的發酵產物中可能含有影響辣椒疫霉菌菌絲生長發育的物質。抑菌譜的測定結果表明，菌株L57–60的抑菌譜較廣，發酵液盆栽防效達到73.1%。

潘峰等[21]發現鏈霉菌對辣椒疫霉菌的抑制效果極好；EZZIYYANI等[22]發現鏈霉菌聯合使用對辣椒疫霉菌具有拮抗作用的哈茲木霉()和羅氏鏈霉菌()，可使土壤中的病原菌數量減少75%，對辣椒疫病具有良好的防效。除此之外，還有許多報道提出在鏈霉菌的發酵液中發現對辣椒疫霉具有抑制作用的化合物：TIAN等[23]發現鏈霉菌sp. SN028的發酵產物中含有5種對辣椒疫霉菌具有抑制作用的化合物；LI等[24]發現一種鏈霉菌.發酵液中含有抗生素X–14952B，對辣椒疫霉具有較好的抑制效果[24]；CHANADECH等[25]從1株灰橙鏈霉菌()的發酵液中分離出能夠抑制辣椒疫霉的化合物。HE 等[26]在A217 中分離出1種化合物，其對辣椒疫霉的 EC50值為 50.36 μg/mL。這些都說明鏈霉菌大多通過發酵產物中的特殊化合物來抑制辣椒疫霉菌的生長。近幾年來，在鏈霉菌的發酵產物中發現許多不同種類并具有新型結構的活性天然產物，如大環內酯、生物堿、萜類、聚酮類、等物質[27]。后續將進一步對菌株L57–60發酵液組分及抑菌機理進行研究。

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Screening and identification of antagonistic strain againstand the biocontrol potential

ZHENG Diwen1，ZHOU You1，XIE Fangling1，XIE Zongbao1，LIU Feng2,3，ZHU Hongjian1*

(1.College of Plant Protection, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China; 2.Guangdong Laboratory for Lingnan Modern Agricultural, Guangzhou, Guangdong 510006, China; 3.College of Horticulture, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128, China)

Six strains of antagonistic actinomycetes againstwere isolated and screened from soil samples of pepper planting areas in Changsha, Hengyang and Yueyang, Hunan Province. The results showed that the 5 times sterile dilution of the fermentation broth of strain L57-60 had 98.61% inhibition effect on. Strain L57-60 was identified asby morphological characteristics, physiological and biochemical identification, combined with joint tree established based on 16S rDNA,,andgenes. Antimicrobial spectrometry showed that fermentation broth of strain L57-60 showed antagonistic effect on 12 pathogens includingin pepper,in tobacco and(Frank) Donk. The fermentation medium of strain L57-60 was optimized by orthogonal experiment. The results showed that the optimal fermentation medium formula for strain L57-60 was composed of corn flour 4%, soybean flour 0.5%. Pot experiment showed the control effect of strain L57-60 againstwas 73.1%.

pepper blight;; fermentation medium optimization; potted control effect

S436.418.1

A

1007–1032(2023)04–0442–06

10.13331/j.cnki.jhau.2023.04.010

2022–11–26

2023–05–15

嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室項目(NT2021004)；湖南省科學技術廳麓山種業項目(2021NK1006)；湖南省教育廳高?？萍紕撔缕脚_建設項目(20K071)

鄭迪文(1997—)，男，湖南衡陽人，碩士研究生，主要從事植物病理學研究，414040734@qq.com；*通信作者，朱宏建，博士，副教授，主要從事植物病理學研究，hongjian62@163.com

鄭迪文，周游，謝芳玲，謝宗寶，劉峰，朱宏建．辣椒疫霉病菌拮抗菌的篩選鑒定及生防潛力[J]．湖南農業大學學報(自然科學版)，2023，49(4)：442–447．

ZHENG D W，ZHOU Y，XIE F L，XIE Z B，LIU F，ZHU H J．Screening and identification of antagonistic strain againstand the biocontrol potential[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2023，49(4)：442–447．

http://xb.hunau.edu.cn

責任編輯：羅慧敏

英文編輯：羅維