利用CRISPR/Cas9技術構建豬的LDLR基因敲除細胞

韓佃剛，胡娟，董俊，周思佳，陳朝林，張家翔，信吉閣*

利用CRISPR/Cas9技術構建豬的基因敲除細胞

韓佃剛1,2，胡娟3，董俊2，周思佳3，陳朝林3，張家翔3，信吉閣3*

(1.云南農業大學動物科學技術學院，云南 昆明 650201；2.昆明海關技術中心，云南 昆明 650200；3.云南農業大學動物醫學院，云南 昆明 650201)

利用CRISPR/Cas9系統構建豬的低密度脂蛋白受體基因敲除細胞：根據NCBI數據庫豬基因(Gene ID為396801)序列設計sgRNA靶位點，構建敲除打靶載體，通過電轉染豬胎兒成纖維細胞，經G418篩選獲得細胞克隆，進行PCR擴增和T載體克隆測序，經序列比對計算基因敲除效率。結果表明，依照CRISPR/Cas9系統GN20GG法則，在基因第一外顯子上設計1條sgRNA，測序結果顯示靶序列已正確連接，轉染、篩選后共獲得30個單細胞克隆，23個測序成功，其中有7個細胞克隆為基因敲除細胞克隆，敲除效率為30.4%。

豬；低密度脂蛋白受體基因；基因敲除；CRISPR/Cas9系統

動脈粥樣硬化是引起急性心肌梗死、卒中等重大疾病的首要病因[1]。這些疾病的發病過程中，低密度脂蛋白受體(LDLR)和載脂蛋白E(ApoE)起著關鍵性的作用。LDLR是一種細胞表面糖蛋白，廣泛存在于體內組織或細胞中，如肝臟、腎上腺、成纖維細胞、平滑肌細胞和血管內皮細胞等[2]。LDLR可以與ApoE結合，進而清除血中的脂蛋白顆粒；另外，LDLR可通過與低密度脂蛋白(LDL)顆粒上的脂蛋白B(ApoB)相互作用，清除血中的LDL[3]。由此可見，LDLR在清除血液中的膽固醇和甘油三酯富集的脂蛋白顆粒中扮演著非常重要的角色。嚙齒類動物是目前應用最廣泛的動物模型，–/–基因敲除的小鼠、大鼠被廣泛作為動脈粥樣硬化的模型動物，而其與人親緣關系較遠，遺傳背景、體型以及壽命等方面與人類有較大差異，轉化醫學和臨床前研究需要非嚙齒類動物模型。豬在解剖結構、生理代謝及疾病發生機理等方面與人有很多相似之處，被認為是理想的動物模型[4]。構建豬動物模型在心血管相關研究及轉化醫學領域優勢明顯。CRISPR/Cas9基因編輯系統作為基因編輯系統的第3代工具，具有操作簡單、敲除效率高、實驗成本低等優勢，為大動物基因編輯提供了一個有效的技術支持[4–7]。本研究中，利用CRISPR/Cas9系統構建豬基因打靶載體，通過轉染、篩選等多個技術環節構建豬基因敲除細胞模型，以期為細胞水平研究基因功能和構建基因敲除動物提供依據。

1　材料和方法

1.1　主要試劑

Cas9質粒(41815)、sgRNA質粒(41819)購自Addgene；引物購自昆明碩擎生物科技有限公司；限制性內切酶、連接酶等購自Fermentas；豬胎兒成纖維細胞由云南農業大學動物醫學院實驗室凍存；DMEM/F12、PBS、胎牛血清均購自Thermo；PCR儀購自ABI；雙穩定電泳儀購自北京六一儀器廠；細胞電轉儀購自Bio–Rad；凝膠成像系統購自Genentech；培養箱購自Thermo；超凈工作臺購自廣州瑞智凈化設備有限公司。

1.2　方法

1.2.1基因序列設計

根據CRISPR/Cas9系統GN20GG設計法則，依照GenBank中序列信息(Gene ID為396801)，在靠近起始密碼子ATG位置選擇打靶序列，設計一條sgRNA序列。合成靶序列，在正義鏈5￠端添加CACC接頭(Oligo1)，在反義鏈的5￠端添加AAAC接頭(Oligo2)，便于酶切載體連接。

1.2.2sgRNA載體構建

2條sgRNA進行退火反應。反應體系包括Oligo1 10 μL、Oligo2 10 μL、NEB Buffer3 5 μL、ddH2O 25 μL。將配制好的體系混勻、瞬離，置于沸水中加熱5 min，自然冷卻至室溫(3～4 h)。用Solution I將退火產物與經I酶切sgRNA質粒連接，反應體系為線性化sgRNA質粒0.5 μL、Solution I 5.0 μL、退火產物4.5 μL；16 ℃連接30 min，并將連接產物轉化入大腸桿菌Top10中，涂布于含卡那霉素的LB固體平板上，37 ℃過夜培養，挑取單克隆、搖菌，并送昆明碩擎生物科技有限公司測序，鑒定靶序列正確插入。

1.2.3細胞轉染與單克隆篩選

參照文獻[8]的方法，先進行豬胎兒成纖維細胞復蘇培養，匯合度達80%時進行細胞轉染。取生長狀態良好的細胞1×107個，用PBS清洗2次，重懸在600mL PBS中，將其轉入電轉杯中，加入質粒Cas9、sgRNA各50mg并吹打混勻，將電轉杯放入電轉儀中進行轉染，轉染參數為230 V、500mF。電轉染后將細胞分到15個直徑為10 cm的培養皿中培養；隔天換液，換成含G418(質量濃度為800 μg/mL)的培養基培養；隔2 d換液，篩選8～10 d后用細胞克隆環挑取單克隆細胞，轉移到48孔板培養，待48孔板中細胞長滿傳代到24孔板。

1.2.4基因敲除細胞克隆鑒定

NP40裂解細胞先56 ℃裂解1.5 h，再95 ℃裂解10 min。擴增靶序列片段，引物為–F (5￠–ATGAAGTCCACGGGCTGGGT–3￠)和–R (5￠–GTCCTGGCAGCGGAACTCA–3￠)。PCR條件為：95 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環。取3 μL PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析，PCR產物以正向引物送昆明碩擎生物科技有限公司測序。測序結果運用Vector NTI 11.5與原序列比對，采用pMD19–T Vector Cloning Kit經TA克隆、連接、轉化、提質粒后用通用引物M13測序。測序結果與原序列比對，鑒定基因敲除情況。

2　結果與分析

2.1　LDLR基因序列設計結果

設計的sgRNA序列為GCTGCAGTGGAAG AGAAATG，PAM為TGG，并合成靶序列Oligo1 (5￠–CACCgctgcagtggaagagaaatg–3￠)和Oligo2(5￠–AA ACcatttctcttccactgcagc–3￠)。

2.2　sgRNA載體構建結果

將2條sgRNA Oligo退火，形成雙鏈后連接到I酶切的sgRNA質粒上，轉化入大腸埃希菌，并挑取單克隆菌落測序，結果如圖1所示，顯示序列連接正確。

圖1　sgRNA載體測序結果

2.3　細胞轉染與單克隆篩選結果

把Cas9質粒、sgRNA質粒轉染到豬胎兒成纖維細胞，觀察到細胞長勢良好，呈典型的成纖維細胞形態，培養8～10 d，形成單克隆細胞(圖2)。

圖2　培養3 d(a)和8 d(b)的豬胎兒成纖維細胞克隆

2.4　基因敲除細胞克隆鑒定結果

經篩選、培養后共獲得30個單細胞克隆，瓊脂糖凝膠電泳檢測部分結果如圖3所示，在預期片段大小處有單一明亮條帶。測序結果顯示，23個細胞測序成功，序列比對結果顯示為7個細胞克隆在靶位點發生了突變，敲除效率為30.4%。確定的靶位點序列變化列于表1。序列變化有堿基缺失、插入。

圖3　基因敲除豬胎兒成纖維細胞克隆的PCR鑒定電泳結果

表1　基因敲除豬胎兒成纖維細胞克隆基因測序結果

WT示野生型的靶位點序列。紅色堿基為sgRNA靶位點序列；藍色堿基為PAM結合位點序列?！啊鳌笔緣A基缺失；“+”示堿基插入。

3　結論與討論

在CRISPR/Cas9系統中，sgRNA引導Cas9核酸酶在基因的靶位點形成雙鏈或是單鏈的切口，從而激活細胞的DNA修復機制，包括非同源重組的末端鏈接修復和精確的同源重組機制，而非同源重組的末端鏈接修復中會發生隨機的堿基插入或缺失[9–10]。本研究中，在基因第一外顯子上設計1條sgRNA，構建敲除打靶載體，細胞轉染、篩選獲得細胞克隆，鑒定了7個細胞克隆在基因靶位點發生堿基插入或缺失，表明sgRNA編輯了基因。利用CRISPR/ Cas9系統在多個物種上進行基因敲除研究多有報道，如綿羊肌肉衛星細胞基因的靶向敲除[11]，構建基因敲除的小鼠[12]，敲除HEK293FT細胞系的基因[13]，敲除豬胎兒成纖維細胞系的基因[14]等，本研究結果與這些研究的類似。

本研究中，敲除效率為30.4%，這與趙為民等[15]的CRISPR/Cas9系統介導大鼠L6細胞基因編輯研究中的敲除效率類似。朱曉晗等[16]的CRISPR/Cas9技術構建巴馬小型豬基因敲除細胞系的效率是45.5%；徐長江等[17]的利用CRISPR/ Cas9系統構建基因敲除的豬回腸上皮細胞系的效率為15.5%；趙麗華等[18]基于CRISPR/ Cas9系統制備豬基因敲除細胞系效率為45.21%?？梢?，敲除效率有待進一步提高。

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Generation of-knockout pig cells using by CRISPR/Cas9 technology

HAN Diangang1,2，HU Juan3，DONG Jun2，ZHOU Sijia3，CHEN Chaolin3，ZHANG Jiaxiang3，XIN Jige3*

(1.College of Animal Science and Technology, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201, China; 2.Technology Center of Kunming Customs, Kunming, Yunnan 650200, China; 3.College of Veterinary Medicine, Yunnan Agricultural University, Kunming, Yunnan 650201, China)

The objective of this study was to disrupt the low density lipoprotein receptor gene() of pig cells using the CRISPR/Cas9 system. Specific guide RNA(sgRNA) sequences were designed based on thesequence from the NCBI database(Gene ID 396801). A CRISPR/Cas9 target vector was constructed and porcine embryonic fibroblasts colonies were generated through electrotransfection and G418 screening. Genotype identification was performed on the cell colonies. PCR products were cloned into a T vector and subjected to sequence alignment. The efficiency of gene knockout was analyzed statistically. The sgRNA was designed to target the first exon of thefollowing the GN20GG rule. DNA sequence assays confirmed the correct construction of the target vector, which was subsequently introduced into porcine fetal fibroblasts using electroporation. In total, 30 monoclonal cells were isolated, with successful sequencing of 23 colonies. Among these, seven cell colonies exhibited gene modifications, resulting in a fragment knockout efficiency of 30.4%.

pig;gene; gene knockout; CRISPR/Cas9 system

S828.9；Q78

A

1007–1032(2023)04–0468–04

10.13331/j.cnki.jhau.2023.04.014

2022–06–07

2023–08–11

國家自然科學基金項目(31960658、31360532)；云南省科技計劃項目(2013FB041)

韓佃剛(1980—)，男，山東濰坊人，博士，高級獸醫師，主要從事檢驗檢疫研究，1227394912@qq.com；*通信作者，信吉閣，博士，教授，主要從事獸醫公共衛生學研究，1104263681@qq.com

韓佃剛，胡娟，董俊，周思佳，陳朝林，張家翔，信吉閣．利用CRISPR/Cas9技術構建豬基因敲除細胞[J]．湖南農業大學學報(自然科學版)，2023，49(4)：468–471．

HAN D G，HU J，DONG J，ZHOU S J，CHEN C L，ZHANG J X，XIN J G．Generation of-knockout pig cells using by CRISPR/Cas9 technology[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences)，2023，49(4)：468–471．

http://xb.hunau.edu.cn

責任編輯：鄒慧玲

英文編輯：柳正