特殊醫學用途嬰兒配方食品中香蘭素檢測方法的研究進展

郭美娟，張蘭天，史國華，張 巖，王晨元，張湘渠，馬越超*，張 斌*

（河北省食品安全重點實驗室，國家市場監管重點實驗室（特殊食品監管技術），特殊食品安全與健康河北省工程研究中心，河北省食品檢驗研究院，河北 石家莊 050227）

香蘭素，又名香草醛或3-甲氧基-4-羥基苯甲醛，分子式為C8H8O8，是一類芳香族有機化合物，通常包括甲基香蘭素和乙基香蘭素；最早從蘭科植物香莢蘭中被發現，帶有香莢蘭香氣和濃重的奶香，外觀呈淡黃色或白色結晶[1-2]。隨著科技的進步，香莢蘭中香蘭素的提取技術取得了重大進展，出現了以鄰甲氧苯酚為原料合成的香蘭素，其與天然結構完全相同，并廣泛用于醫藥、煙草、香水日化等行業。香蘭素也逐步應用于食品領域，如乳制品、糖果、橄欖油、餅干、巧克力、蛋糕等，作為增香劑和固香劑使用，是世界范圍內產量最大的合成香料品種之一[3]。

特殊醫學用途嬰兒配方食品（以下簡稱特醫嬰配食品）是指針對患有特殊紊亂、疾病或醫療狀況等特殊醫學狀況嬰兒的營養需求而設計制成的粉狀或液態配方食品，需符合GB 25596—2010《食品安全國家標準 特殊醫學用途嬰兒配方食品通則》的要求。據報道，近年來我國特醫食品行業蓬勃發展，市場規模約60 億元。特醫嬰配食品作為部分有特殊醫學狀況嬰兒生命早期賴以生存的主要食物來源，其營養成分分析、添加劑使用安全性以及檢測方法的適用性和準確性等問題就更加重要。目前針對特醫嬰配食品營養成分檢測方法及其適用性的研究逐步開展，但針對香蘭素檢測方法的研究較少[4-8]。本文論述香蘭素的限量要求、生產工藝和可能帶入特醫嬰配食品的風險，重點分析乳品，特別是嬰幼兒配方食品和特醫嬰配食品中香蘭素的檢測方法研究，探討不同檢測方法的優勢和局限性，為香蘭素的科學檢測和深入研究提供依據。

1 香蘭素相關標準要求

世界衛生組織和聯合國糧食和農業組織允許食品中使用香蘭素，認為每日攝入量一般不超過10 mg/kg是安全的；美國允許在食品中使用香蘭素，建議包括冰激凌、飲料、糖果、焙烤食品、布丁、巧克力、口香糖等在內的食品可使用香蘭素，其使用量通常為10～100 mg/kg；歐洲一些國家在食品中使用香蘭素有很長的歷史，但未對其使用范圍和使用量作出規定[9]。我國依據GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》[10]中的規定，香蘭素可用于飲料、冰激凌、蛋糕等各類食品，用量可按生產需要適量使用，另外規定了0～6 個月嬰幼兒配方食品中不得添加香蘭素，較大嬰兒配方食品和幼兒配方食品、嬰幼兒谷類輔助食品在即食狀態下香蘭素的最大使用量分別為5 mg/100 mL、7 mg/100 g[11]。特醫嬰配食品在GB 2760—2014中的分類屬于嬰幼兒配方食品，且其食用人群包括0～6 個月嬰幼兒，因此特醫嬰配食品中不得添加香蘭素。

2 香蘭素生產工藝及特點

香蘭素的生產工藝一般有3 種，分別是天然提取、化學合成及天然原料制備，3 種生產工藝得到的香蘭素結構相同，但在生產和使用過程中優缺點不同。香蘭素天然存在于香莢蘭豆等中，由于熱帶香草蘭花主要生長在馬達加斯加、印度尼西亞等少數國家和地區，且對土壤及氣候因素的要求非常高，種植、采收、提取及生產加工過程中的工藝復雜，使得其成本高、產量低、價格貴，因此天然提取的香蘭素產量占全球產量的不足1%。以工業紙漿廢液和石油化學品等作為原材料并用化學方法合成是主要的香蘭素生產方法。該方法生產過程和技術穩定，原料充足，市場價格也較低。不足之處是產品香型較為單一，缺乏天然香蘭素的復合香氣，生產過程中也容易引發環境污染問題，不符合下游應用市場對天然原料的消費趨勢[12]。以可再生資源丁香酚、阿魏酸作為天然原料制備香蘭素，由于其可再生性，且香氣更接近天然產品而受到重視[13]。由于以丁香酚作為原材料制得的天然級香蘭素香氣誘人、食用安全性和實用價值均較高，因此受到高端食品市場的青睞[14-15]。阿魏酸廣泛存在于玉米和小麥等農作物的細胞壁上，是目前全球最為豐富的酚類化合物之一，且生產工藝簡單，具有收效高、能耗低、污染小及食用安全等優點[16]?？梢钥闯?，天然原料制備的香蘭素生產過程中所用玉米、小麥等原料可能存在香蘭素本底并帶入到終產品中。

3 特醫嬰配食品基質特點和香蘭素帶入風險

常見的特醫嬰配食品產品類別包括乳蛋白部分水解配方、無乳糖配方或低乳糖配方、乳蛋白深度水解配方、氨基酸配方、氨基酸代謝障礙配方、早產/低出生體質量嬰兒配方和嬰兒營養補充劑等，每類配方均有其自身的特點[17]，可見特醫嬰配食品是一類既復雜又特殊的食品。根據不同的產品類別，其基質有所不同，主要的配料也有所不同，如表1所示。

表1 特醫嬰配食品的主要配料Table 1 Main ingredients used in infant formulas for special medical purposes

由于特醫嬰配食品不同于普通嬰兒配方食品，需要根據不同疾病的營養需求，設計針對性的產品配方并使用特定的原輔料（如麥芽糊精、玉米糖漿、葡萄糖漿、水解蛋白、淀粉糖和淀粉、氨基酸等）。部分原輔料的生產工藝如下：淀粉的生產工藝（主要原料為玉米）：清理去雜→濕磨分離→脫水干燥→成品。麥芽糊精的生產工藝主要為酶法，生產工藝為：淀粉→調漿→第1次液化→高溫滅酶→第2次液化→滅酶脫色→過濾→離子交換→濃縮→噴霧干燥→產品[18]。玉米糖漿的生產工藝首先是要把玉米的胚芽和糠皮去除，經過浸泡→磨漿→糖化→冷卻→過濾→熬煮→成品。麥芽糊精、淀粉等特醫嬰配食品的原輔料很多來源于玉米、小麥、大豆等食品材料，可能含有微量香蘭素本底。相比于普通嬰兒配方食品的主要基質是生牛乳或乳清粉，特醫嬰配食品中經原輔料帶入的風險有所增加。另一方面，部分特醫嬰配食品生產企業存在特醫嬰配食品產品與較大嬰兒和幼兒配方產品（6 月齡以上人群嬰幼兒配方食品可以添加香蘭素）共線生產的情況，可能因更換品類生產時對生產線的清洗、清場不徹底，導致生產線殘留香蘭素帶入后續產品。

4 香蘭素的檢測方法

目前GB 5009.284—2021《食品安全國家標準 食品中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的測定》[19]的適用范圍是嬰幼兒配方食品、嬰幼兒輔助食品、糕點、糖果、乳及乳制品、飲料和小麥粉?；谔蒯t嬰配食品中無乳糖配方、深度水解配方、部分水解配方、氨基酸代謝障礙等配方設計差異較大，且原輔料和基質復雜，從嬰兒的特殊性及安全性考慮，香蘭素的檢測方法適用性和準確性顯然是至關重要的。目前，食品中香蘭素的檢測方法包括色譜法[20-25]、光譜法[26-27]和電化學法[28]等。本文對近年來所報道的乳制品、嬰幼兒配方食品和特醫嬰配食品中香蘭素檢測方法的研究進展進行綜述，并總結了這些方法的優缺點，旨在為特醫嬰配食品中香蘭素的檢測研究提供參考。

4.1 氣相色譜（gas chromatography，GC）法

GC是一種適用于有機化合物中對易于揮發而不易分解的物質進行分離與分析的色譜技術，適用于香蘭素的定性和定量分析，具有操作簡單、儀器分析時間短、干擾小、靈敏度高、樣品進樣量少等特點。

劉玉萍[29]建立嬰幼兒乳制品中香蘭素和乙基香蘭素的內標法定量分析方法，通過優化前處理方法將樣品在含有NaCl的NaOH溶液中加熱，使蛋白質變性后用乙醚萃取，從而達到快速、準確測定香蘭素的目的，加標回收率為96%～106%，相對標準偏差為0.34%～3.55%。

4.2 液相色譜法

液相色譜法是一種流動相為液體的色譜法，通?？煞譃楦咝б合嗌V（high performance liquid chromatography，HPLC）法和超高效液相色譜（ultra high performance liquid chromatography，UPLC）法，該方法操作簡單、靈敏度高、重現性好、精密度高，可用于食品中香蘭素的檢測[30]。

王存孝[31]將樣品經乙醇提取，漩渦振蕩、高速離心和微孔濾膜過濾后，采用C18反相色譜柱，以甲醇溶液為流動相洗脫，在279 nm波長處檢測，外標法定量。結果表明，在0.1～40.0 μg/mL，香蘭素具有良好的線性關系，R2=0.999 7，方法的檢出限為0.05 μg/mL，加標回收率為96.0%～100.2%，相對標準偏差小于5%，建立了一種利用HPLC法測定乳粉中香蘭素的方法。林正鋒等[32]前處理采用叔丁基甲醚溶液提取，氫氧化鈉溶液萃取凈化，有效去除干擾物質，建立同時測定乳粉中香蘭素、乙基香蘭素、麥芽酚、乙基麥芽酚4 種香料含量的UPLC方法。籍芳等[33]建立同時測定乳粉中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的UPLC法，將樣品用水溶解后使用ProElut PXA固相萃取柱進行樣品前處理凈化，C18柱分離，UPLC儀進行色譜分析。該方法在0.5～20.0 mg/L范圍內線性關系良好，方法檢出限為0.20～0.25 mg/L，樣品的加標回收率為80.3%～102.7%，相對標準偏差為1.85%～4.11%。陶保華等[34]創新了樣品前處理方法，首先利用乙酸鋅沉淀蛋白，再以MAX-SPE固相萃取小柱凈化，去除了樣品中絕大部分的雜質，極大降低了檢測過程中基質的干擾，建立了嬰幼兒配方粉中香蘭素和乙基香蘭素的測定方法，但回收率偏低。經研究表明，沉淀蛋白的前處理方法會使待測組分被部分吸附，影響回收率，這就需要根據實際樣品的取樣量調整蛋白沉淀劑的使用量[35]。陳靜等[36]選用正己烷除脂凈化的前處理方法，建立測定乳與乳制品中香蘭素和乙基香蘭素的反相HPLC分析方法，該方法的定量限為0.2 mg/kg，檢出限均為0.06 mg/kg。賀江等[37]從適宜固相萃取小柱篩選、洗脫條件優化、提取和蛋白沉淀方案確定、色譜分析條件優化等方面著手，建立乳粉中香蘭素的UPLC檢測方法，并對方法的準確度、精密度和靈敏度等進行評價。結果表明，方法的加標回收率為80%～100%，組內相對標準偏差為0.9%～6.1%，組間相對標準偏差為7.0%，方法的最低檢出限為8.0 mg/kg。

目前國內所報道的特醫嬰配食品中香蘭素檢測研究僅見有關液相色譜法的適用性研究。吳纖愫等[38]針對特醫食品基質，通過不同種類固相萃取柱凈化效果優化前處理條件，選擇對特醫食品基質凈化效果較好的增強型脂質去除過濾柱Captive EMR-Lipid，結合HPLC儀進行檢測，并結合二極管陣列檢測器光譜圖定位，建立一種測定特醫食品中包括香蘭素、乙基香蘭素、甲基香蘭素等在內的11 種人工合成香料的檢測方法。胡思怡[39]對液相色譜條件進行優化，最終確定了用甲醇多次提取后選用固相萃取柱（500 mg/3 mL）檢測特醫食品中包括香蘭素、乙基香蘭素、甲基香蘭素在內的11 種香料的檢測方法。

4.3 色譜-質譜法

4.3.1 氣相色譜-串聯質譜（gas chromtography-tandem mass spectrometry，GC-MS/MS）法

GC-MS/MS是將GC儀和MS儀聯合使用的儀器，同時具有GC的高效分離優勢和MS的高選擇性、靈敏度和分子結構鑒定等優勢，且操作簡便、抗干擾性強、定量準確性高，已被廣泛應用于食品中營養成分分析及各種有害物質的痕量檢測[40-41]。

鄭小嚴[42]利用香蘭素在pH值小于7的環境中以分子形式存在的特性，以環己烷和乙酸乙酯等比例混合作為溶劑提取香蘭素，再經過凝膠色譜凈化，最后用GC-三重四極桿質譜檢測，外標法定量，加標回收率為85%～105%，相對標準偏差≤6.77%，定量限為0.10 mg/kg，從而建立了配方乳粉中香蘭素和乙基香蘭素的凝膠滲透色譜-GC-三重四極桿質譜測定方法。鄭璇等[43]優化萃取柱、吸附溫度和時間、解吸附溫度和時間等實驗條件，方法的檢測限為0.5 mg/kg，樣品加標回收率為90.0%～100.0%，相對標準偏差為1.9%～4.1%，建立了自動頂空固相微萃取-GC-MS測定乳粉中香蘭素和乙基香蘭素的方法。周靜等[44]將樣品經飽和氯化鈉水溶液溶解后加入同位素內標，經乙腈超聲提取后離心取上清液，加入正己烷去除脂類。采用VF-WAXms色譜柱分離，利用MS在全掃描和選擇離子掃描同步掃描模式下，對香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素及其同位素內標物進行檢測，內標法定量，建立了同時測定嬰幼兒配方乳粉中4 種香料的同位素稀釋-GC-MS檢測方法。該方法在0.05～5.00 mg/L范圍內線性關系良好，相對標準偏差≤5.0%，平均回收率為85.7%～98.3%，定量限為0.03 mg/kg。章建輝等[45]以乙醚為提取劑，100 μL 0.01 mol/L NaOH為接受相，二氯甲烷為反萃取劑，選擇離子監測模式，外標法定量。結果表明，0.2～10.0 mg/mL線性范圍時，線性良好（R2=0.999 5），相對標準偏差為2.83%～6.83%，檢出限為0.004 mg/kg，加標回收率為82.0%～98.0%，從而建立了液-液萃取-接受相固化-反萃取技術聯用GC-MS檢測乳粉中香蘭素的方法。高海燕[46]通過多反應監測模式和GC-MS對牛乳中香蘭素進行測定，線性范圍為0.1～4.0 mg/L時，線性良好（R2=0.999 8），相對標準偏差為3.3%，加標回收率為79.1%～86.2%，方法定量限為0.02 mg/kg。

4.3.2 液相色譜-串聯質譜（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法

LC-MC/MS法是由具有高效分離能力的LC和具有高準確分析能力的MS結合，具有操作簡單、靈敏度高和準確度高等優點，因此被用于實現解析化合物分子結構或樣品的定性和定量分析[47-49]。

韓超等[50]采用LC-MC/MS建立了同時測定嬰幼兒配方乳粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素4 種香料的分析方法，線性關系良好（R2＞0.999 3），香蘭素的定量限為10.0 μg/kg，甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的定量限為5.0 μg/kg，平均回收率為85.2%～107.4%，相對標準偏差≤5.7%。肖鋒等[11]將樣品經Tris溶液和乙腈振蕩提取，離心后提取液用正己烷脫脂過濾后上機測定，外標法定量，在5.0～200.0 μg/L范圍內線性良好，測定低限為50 μg/kg，加標回收率為89.5%～115.0%，相對標準偏差小于15.6%，建立了HPLC-MS法檢測嬰幼兒配方乳粉中香蘭素、甲基香蘭素和乙基香蘭素的方法。馬啟明等[51]將樣品以水溶解、經乙腈提取后，鹽析分層，離心后用增強型基質去除固相吸附劑凈化上清液，采用大氣壓化學電離源和電噴霧離子源的復合源以正離子掃描方式進行采集。方法在2.0～200.0 μg/L范圍內呈良好線性關系（R2＞0.999 1），檢出限和定量限分別為10.0～20.0 μg/kg和35.0～60.0 μg/kg，加標回收率為77.0%～94.1%，相對標準偏差為2.76%～4.77%，從而建立了乳粉中香蘭素、甲基香蘭素、乙基香蘭素和香豆素的UPLC-四極桿/飛行時間質譜測定方法。詹勝群等[52]通過對前處理條件、色譜和質譜條件進行優化建立UPLC-MS/MS法快速篩查嬰幼兒配方乳粉中香蘭素的檢測方法，該方法具有限值低、分析時間短、前處理簡單且無基質效應等優點。

4.4 光譜法

香蘭素檢測的光譜方法主要包括紅外光譜法、紫外分光光度法、表面增強拉曼光譜法、熒光探針法等。

紅外光譜技術是一種快速、無損、環保的分析技術，常與化學計量學結合，用于食品成分的定量檢測與品質評價中。陳達等[53]采用長光程傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，FTIR）以頂空采樣的方式，對摻雜香蘭素的乳粉體系中的揮發性氣體進行高靈敏檢測，運用多尺度建模方法，該方法結合了離散小波變換和偏最小二乘法，充分利用氣體紅外光譜中的時/頻多尺度信息，建立了長光程紅外光譜檢測方法。鄒建[54]利用氣體FTIR技術并通過標準加入法，分析香蘭素的紅外特征吸收峰，經線性擬合對香蘭素在1 587、1 515 cm-1處特征吸收峰的R2均在0.950以上。Zhao Xin等[55]基于近紅外光譜和偏最小二乘判別分析建立分類模型，通過視覺預測圖能清楚地顯示香蘭素富集像素的位置，從而用來檢測嬰兒配方乳粉中的香蘭素。

馮彩婷等[56]采用紫外-可見分光光度法，發現吸光度在最大吸收波長435.0 nm處與香蘭素含量呈正比，相對標準偏差為0.34%，加標回收率能達到98%以上，從而建立了紫外分光光度法測定乳粉中香蘭素的方法。

紅外光譜和拉曼光譜都屬于分子振動光譜，可以反映分子的特征結構。表面增強拉曼光譜技術是在拉曼光譜技術的基礎上，采用金、銀等貴重金屬來增強拉曼散射。該方法具有快速、無損、前處理簡單等特點，多用于食品的快速定性檢測。王石等[57]用飽和醋酸鉛去除蛋白質，二氯甲烷進行萃取，pH 9的氫氧化鈉溶液對提取液進行純化，以粒徑約58 nm的金膠溶液作為增強試劑。在上機待測液中加入1 mg/100 mL硝酸溶液200 μL、1 mg/100 mL硝酸鉀溶液50 μL，在1 149、1 497、1 575 cm-1處定性，在30～300 μg/mL質量濃度范圍內進行定量計算，R2=0.991 3，檢出限為10 μg/mL，回收率為80.5%～86.9%，相對標準偏差＜8.6%，從而建立了較大嬰幼兒配方乳粉中香蘭素的表面增強拉曼光譜檢測方法。

以具有優異熒光性能的金屬有機骨架（metalorganic frameworks，MOFs）制備成的高靈敏度和高選擇性的熒光探針被用于快速檢測食品中的香蘭素。Wang Jing等[58]利用鉬酸銨輔助形狀控制合成Co(Ⅱ)基納米MOFs熒光探針，在440 nm波長處的紫外光激發下對香蘭素敏感度高，并且在水溶液中可被香蘭素選擇性猝滅，從而對香蘭素進行檢測。

4.5 方法比較與分析

根據上述分析可以看出，GC/LC檢測方法的操作簡單，但檢出限相對較高，這種情況容易造成含量較低時出現誤判。隨著聯用技術的不斷成熟，實現了MS與色譜之間功能和優勢的互補，從而將MS的高選擇性、高靈敏度、能夠提供相對分子質量、結構信息等優點與色譜的高分離能力結合起來，結果的準確度大幅提升。但是，聯用技術應用時多數樣品需要凈化處理，繁瑣的前處理過程一定程度上也會影響結果的準確性。紅外光譜法、拉曼光譜法等光譜檢測方法的樣品前處理簡單，在現場快速、無損檢測中具有廣泛的應用前景，但靈敏度相對較低，多用于定性[59]。具體分析見表2。

表2 香蘭素檢驗方法匯總Table 2 Common methods to detect vanillin and their figures of merit

目前，乳品中香蘭素的檢測方法較為常見的是色譜法，特別是針對嬰幼兒配方食品和特醫嬰兒食品，色譜法的應用更為廣泛。上述檢驗方法的適用范圍和優缺點各不相同，在對香蘭素進行分析檢測時，需要針對不同的基質，選取合適的提取方法和凈化方法，從而建立合適的檢測方法，才能保證測定的準確性。

雖然食品中香蘭素的檢測方法較多，但高精準、基質適用性強的檢測特醫嬰配食品的方法研究非常少，本文希望通過總結乳品，特別是嬰幼兒配方食品和特醫嬰配食品中各香蘭素檢測方法的優缺點，為進一步開展特醫嬰兒食品中香蘭素的檢測和研究提供一定的技術支持。

5 結 語

本文論述香蘭素在食品行業中的應用現狀、國內外的使用限量要求、生產工藝特點以及在特醫嬰兒食品中可能帶入的風險，重點匯總分析乳品中，特別是嬰幼兒配方食品和特醫嬰配食品中香蘭素檢測方法的研究進展，包括GC、LC、GC-MS/MS、LC-MS/MS、光譜法等多種方法，探討不同檢測方法各自的優勢和局限性，為特醫嬰配食品中香蘭素的科學檢測和深入研究提供依據。