基于熒光素酶生物發光檢測方法的研究及其應用進展

劉 琳，胡婷婷，王夢靈，聶 耀，張惟杰，王 琛，鄒秉杰，2*，宋沁馨**，周國華

（1中國藥科大學藥物質量與安全預警教育部重點實驗室，南京 210009；2南京大學生命分析化學國家重點實驗室，南京 210093；3東部戰區總醫院臨床藥學科，南京 210002）

生物發光（bioluminescence，BL）現象是一種普遍存在于自然界中的現象，是由生物體在體內進行生物發光反應，產生可見光的現象。在大多數情況下，BL被認為是求偶、阻止捕食者和吸引獵物的一種行為[1]。它的反應底物是各種熒光素，即氧化后易于發光的小分子，是通過各種生化途徑進化而來的。這些小分子的氧化是由非同源熒光素酶進行催化的，從而產生一系列不同顏色、不同催化速率、不同細胞定位以及對三磷酸腺苷（ATP）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADH）等依賴的發光反應[2]。由于該反應具有高靈敏度、高選擇性和高信噪比等特點，已被廣泛應用于各種生物技術和生物醫學領域。一般，生物體首先通過在細胞內合成具備發光能力的物質，即熒光素。然后在細胞中特定酶的催化下，將熒光素中的化學能轉化為光能，從而產生光信號。具備發光能力的有機體在自然界中有很多。由體內熒光素和熒光素酶之間的化學反應而發生的自然發光現象，是大多數陸地發光生物的遺傳特征。還有一部分發光生物是通過其他各種途徑來獲取發光共生體，從而在海洋中產生光。例如，腔腸素是一種眾所周知的熒光素，主要來源于櫛水母、十足動物和橈足類動物等。而刺胞動物、甲殼類動物和深海魚類通過多層食物鏈來捕獲櫛水母、十足動物和橈足類動物等，使自身獲取熒光素。另外，一些不發光的弧菌通過水平基因轉移從發光的弧菌物種中獲得lux基因，從而使自己具備生物發光特性[3]。距今，大約10 000多個物種具備了在黑暗中發光的能力。

盡管BL 反應在分子水平上并未得到充分的研究，但由于其易于檢測以及結果可視化的特點，已經成為現代檢測技術的重要組成部分之一。其中，熒光素作為生物發光反應的關鍵底物，關于它的人工合成也一直在被研究和探索著。直至1905年，諾貝爾化學獎頒給了合成熒光素的研究者，從此人工合成熒光素時代拉開序幕。此后熒光染色技術被開發出來，用于特異性地標記細胞中不同的細胞器。再到2008 年，有學者從發光水母中獲得綠色熒光蛋白，再次被授予諾貝爾化學獎。在此基礎上，活體成像技術得到巨大發展。接下來在2014 年，超分辨率熒光顯微技術獲得諾貝爾化學獎，在生物發光熒光分子的作用下，通過光學顯微鏡技術可以觀測到納米級別的物體。

近年來，熒光素和熒光素酶的結構以及生物發光反應的作用不斷被研究和改進著。因此，許多檢測方法應運而生，并被廣泛應用于體內外的各項研究，包括環境監測、食品檢測、分子診斷、藥物篩選以及各種生物醫學研究。本文簡要概述了熒光素和熒光素酶發光反應的原理，以及它們在實際檢測中的各種應用。

1 生物發光系統

BL 是生物體通過化學反應產生光的能力，屬于化學發光的范疇，是自然界令人驚奇的現象之一，存在于一些特定的細菌、真菌、昆蟲、植物和海洋生物等種屬中。常見的生物發光系統一般分為以下4種，見表1。

表1 4種常見生物發光系統的介紹

1.1 螢火蟲熒光素系統

螢火蟲熒光素系統是一組重要的生物發光反應系統，也是目前研究最徹底的一種。蟲熒光素經過氧化、熱解、發射光、再生成熒光素、儲存、釋放等一系列反應，形成循環。該過程不僅實現了發光底物的生成與儲存，也在反應過程中輸出了光信號。大部分反應利用的是一種稱為D-熒光素的穩定且無毒的化合物發出黃色、橙色或者紅色的光。圖1 是螢火蟲生物發光周期的6 個階段。該系統已經在幾種甲蟲譜系中進化，包括螢火蟲、點擊甲蟲和鐵路蠕蟲。

圖1 螢火蟲生物發光周期的6個階段[4]

1.2 腔腸素依賴系統

海洋生態系統中存在著許多發光生物。腔腸素是一種廣泛存在于海洋生物中的化學發光單分子[5]，是許多獨立進化的海洋生物細胞內熒光素酶作用的底物。但是大多數海洋生物本身并不合成腔腸素，而是從食物中獲取。這可能就是海洋生態系統中的生物不斷趨向于發光生物進化的原因。自然界中所有依賴腔腸素的發光系統都會發出藍光，圖2 是各種腔腸素依賴性的生物發光系統，通常不需要除氧氣外的任何其他輔助因子，其發射最大值在450 ～ 500 nm之間。在某些情況下，與熒光素酶相互作用的熒光蛋白會改變生物發光的顏色。其他特性，如相對分子質量、pH 敏感性、熱穩定性和熒光素酶的催化速率在腔腸素依賴系統之間變化也很大。

圖2 各種腔腸素依賴性生物發光系統[6]

1.3 細菌生物發光系統

作為分布最廣的發光生物，發光細菌在正常生理條件下發出藍綠色光。迄今為止，已經發現了30 多種發光細菌，但只有5 種被詳細研究過。這5 種發光細菌通過相同的熒光素酶催化機制（圖3-A）產生生物發光。詳細過程如圖3-B 所示。首先，還原的黃素單核苷酸陰離子（FMNH，- R）與氧氣反應生成4α-過氧羥基-5-氫黃素單核苷酸（HFOOH*, IM-1）。隨后，HFOOH*與長鏈脂肪醛（RCHO，體內十四醛）反應得到中間體。然后，HFOOCH(OH)R 解離產生第一個單重激發態（S1態）4α- 羥基-5- 氫-FMN（HFOH*）和羧酸（RCOOH）。隨即，生物發光體HFOH*去激發為HFOH 并發射光。最后，HFOH 轉化為黃素單核苷酸（FMN）和水。該發光系統可以在沒有外部熒光素的情況下在活細胞中產生光。由于其發光水平相對較低，進一步限制了生物發光成像的許多應用[7]。

圖3 細菌生物發光反應過程[8]

1.4 真菌系統

生物發光真菌的最早記錄可以追溯到兩千年前。距今，已發現約100 多種發光真菌，分布在9個種屬中。所有報道的發光真菌都發出綠光，最大強度在520 ～ 530 nm，并且可能共享一個單一的生物發光系統。2018 年，有學者完整描述了一種在真菌中產生生物發光的生化途徑，提供了第1個來自真核生物的基因可編碼途徑。真菌利用一種簡單的化合物（α-吡喃酮）作為熒光素，在反應中被不溶性的熒光素酶氧化，只需要氧氣就能使反應發出綠光。真菌熒光素生物合成和回收的途徑如圖4 所示，咖啡酸通過咖啡豆素合酶（HispS）轉化為牛奶樹堿，并被牛奶樹堿3-羥基化酶（H3H）羥基化，產生3-羥基牛奶樹堿，即真菌熒光素。接著熒光素酶（Luz）聯合分子氧，將真菌熒光素氧化為內過氧化物，并以高能中間體的形式存在。最后，高能中間體分解為氧化熒光素（咖啡酰丙酮酸）并發射光。而氧化熒光素可通過咖啡酰丙酮酸水解酶（CPH）循環生成咖啡酸。有研究表明來自真菌生物發光系統最少3 個基因的表達就足以改造其他不發光的真核生物。Mitiouchkina 等[9]在重組真菌生物發光系統的基礎上，對煙草進行改造，將咖啡酸轉化為熒光素，轉化后的植株可在活體生長狀態下發出肉眼可見的光，即可視光。

圖4 真菌熒光素生物合成和回收的途徑[10]

2 熒光素酶種類

熒光素酶不是一種具有特定結構的特定分子，凡是可以催化生物發光反應的酶都可以稱為熒光素酶，可以是天然的，即來自生物體內的，也可以是在實驗室中用基因工程的方法生成。雖然從類型上來說各不相同，但本質上都是生物發光反應的催化劑，用于催化不同的發光反應。常見的幾種熒光素酶有以下4種。

2.1 蟲熒光素酶

螢火蟲熒光素酶和點擊甲蟲熒光素酶是被廣泛應用的兩大蟲熒光素酶。

螢火蟲熒光素酶：已經克隆、測序和表征了幾種螢火蟲熒光素酶，它們具有不同的動力學特性并在黃綠色光譜范圍內引起光發射。其中一些被用作生物成像和生物傳感器的分析試劑和報告基因，還有被用作細胞內pH 和有毒金屬顏色調節的指示劑[11]。

點擊甲蟲熒光素酶：第二大流行的D-熒光素依賴性熒光素酶來源于點擊甲蟲。該物種使用4 種類型的熒光素酶發光，發射光最大波長在綠色（540 nm）到橙紅色（593 nm）之間。其顏色可變性、對各種pH 的耐受性以及工程變體的可用性使點擊甲蟲熒光素酶在眾多實際應用中應用廣泛[12]。

2.2 高斯熒光素酶

高斯熒光素酶主要來自海洋橈足類——高斯氏菌，這是一類具有生物發光性質的海洋生物。該酶本質上是一種蛋白質，相對分子質量大約為20 kD，通常會從哺乳動物的細胞中分泌出來。在氧氣的作用下，該酶能將腔腸素催化氧化，然后發出光信號。它由帶有分泌信號肽的N 末端可變部分和包含10 個高度保守的Cys 殘基的C 末端催化結構域組成，存在多達5個二硫鍵。在生物醫學研究中得到了廣泛應用。

2.3 海腎熒光素酶

廣泛使用的腔腸素驅動的海腎熒光素酶是在40 多年前發現的，是來自珊瑚的中等大?。?6 kD）胞質蛋白。在生物發光反應中可產生穩定的發光信號。但就目前來說，它通過氧化產生藍色光子的機制仍不清楚[13]。綠色海腎（Green Renilla）熒光素酶是一種在細胞內產生的蛋白。在血清中等復雜樣品中，綠色海腎熒光素酶與天然的海腎熒光素酶相比具有更高的穩定性和更好的發光強度。故選擇綠色海腎熒光素酶作為報告基因進行相關檢測時比天然海腎熒光素酶能獲得更高的靈敏度。

2.4 海螢熒光素酶

海螢（Cypridina）熒光素酶的相對分子質量在62 kD 左右。同高斯熒光素酶相似，也是一種分泌型蛋白。絕大部分熒光素酶將分泌到細胞外。在此基礎上，可通過對熒光素酶的檢測從而實現對活細胞的持續監測，簡單便捷。由于熒光素酶能使反應產生高信號，所以當細胞內存在未分泌的熒光素酶時，便可以通過常規的裂解方法對細胞進行檢測。其次，海螢熒光素酶還可以和紅色螢火蟲熒光素酶組合為雙色檢測，實現多重檢測。

3 基于熒光素酶生物發光的檢測方法的開發及應用

3.1 基于蟲螢光素酶和D-熒光素的ATP生物發光法

ATP 生物發光檢測的反應底物有ATP 和D-熒光素。在底物量充足的情況下，當Mg2+和O2存在時，熒光素酶會催化D-熒光素氧化，從而產生熒光，熒光信號的強度與ATP 的含量在一定范圍內成正比，進而可以使用光度計以超高靈敏度進行量化。ATP 生物發光檢測法因其快速、簡便、靈敏度高的優勢，已被廣泛用于現場快速檢測中。目前主要應用于以下幾方面。

3.1.1 微生物數量檢測 ATP 是生物的主要能量來源，普遍存在于所有活的生物體中，測量 ATP是所有微生物存在與否的實時指標[14]。大部分細胞內的ATP 含量基本上是恒定的，所以ATP 的濃度便與細胞的數量成正比。理論情況下細胞的數目越多，ATP 含量就會越高，發光信號也就越高。當細胞處于凋亡、壞死或毒性狀態時，ATP 水平會迅速下降。因此，細胞內ATP 的濃度，反映了微生物的活性和活細胞的數量。當ATP 濃度較低無法用于檢測時，可以對其進行擴增[15]后再檢測。

Ishimaru 等[16]通過比較ATP 檢測法和平板計數法，發現它們基本呈正相關。但在很多方面，ATP 生物發光檢測法是優于平板計數法的。就細胞可檢測的狀態而言，ATP法可檢測具有胞內ATP的細胞，包括可培養和不可培養的細胞以及受損的細胞；而平板計數法僅能檢測在瓊脂培養基中培養的細胞，即可培養的活細胞。在這種情況下，ATP檢測方法的對數減少可能低于平板計數方法，即ATP生物發光法比平板計數法準確度更高。

3.1.2 藥敏試驗 傳統的基于蟲熒光素酶和D-熒光素檢測ATP 并用于藥敏試驗的方法，都是檢測細胞內ATP。但有研究者認為只測定細胞內ATP，準確度有待商榷，便將細胞內ATP 與其在600 nm 處的吸收度（A600）結合起來。Heller 等[17]開發了一種藥敏試驗，通過利用生物發光法確定細菌釋放的ATP 以及測定細菌溶液的A600來表明抗生素的抗菌效果。當細菌在生長期或在抗生素存在時會被溶解從而釋放ATP，所以培養基中ATP含量增加。雖然吸收度會在生長期增加，但在細菌裂解過程中并不改變。所以用細菌達到對數生長期后的吸收度與釋放的ATP 的比值即可表明抗生素的功效。隨著研究的不斷進步，也可以通過監測給藥過程中細胞外ATP 的釋放來對耐藥菌進行篩選。Ihssen 等[18]構建了一種工程化的耐熱熒光素酶用于實時監測細菌培養物中的細胞外ATP。該方法能夠快速檢測抗生素對細菌培養物的影響。因為用β-內酰胺抗生素攻擊氨芐青霉素敏感菌株時，即使在細菌沒有生長的情況下，也表現出強烈的胞外ATP 的積累。由此可得，基于蟲熒光素酶和D-熒光素的ATP 生物發光法在藥敏試驗中發揮著重要作用，其操作簡單、結果快速的優勢使其有望在日后與傳統檢測方法并駕齊驅。

3.1.3 潔凈度檢測 食品、藥品等重點產品在生產過程中對環境的潔凈程度要求很高。只有對生產環境進行嚴格的監督和管理，才能提供潔凈的環境以及生產出安全、高質量的產品?；跓晒馑孛傅纳锇l光檢測ATP 的方法由于其簡單快速的特點已經被廣泛用于潔凈度的檢測中。Tr?an等[19]在醫院藥房的潔凈室中評估了ATP 生物發光方法對監測表面衛生的有用性。他們發現該方法的靈敏度適合用于評估清潔和消毒的效率，并優于傳統的基于微生物培養的表面潔凈度檢測方法。Buczinski 等[20]使用ATP 發光法評估奶牛場用于收集和喂養初乳設備的清潔度，給出了ATP 發光法在小牛飼養過程中的相關設備潔凈度檢測方面具有潛在應用的結論。還有一些通過結合納米探針和ATP 生物發光技術來快速檢測食品中大腸埃希菌的方法[21]。這些研究都表明，基于熒光素酶的ATP 生物發光法能很好地用于潔凈度檢測中，包括食品、環境以及一些機械設備等。

3.1.4 焦磷酸測序 傳統的焦磷酸測序方法，使用了4種酶。它們是用于延伸DNA 鏈的DNA 聚合酶、用于在腺苷5'磷酸硫酸鹽（APS）存在下將PPi轉化為ATP 的ATP 硫酸化酶、用于通過消耗ATP將熒光素轉化為氧化熒光素而產生可見光的熒光素酶以及用于降解ATP 和未摻入的dNTPs 的腺苷三磷酸雙磷酸酶。當添加的dNTP 與測序引物雜交的模板鏈中的堿基互補時，就會發生鏈延伸反應。隨后ATP 生成并和熒光素酶發生反應產生光信號。光信號被檢測為熱解圖中的峰值。每個峰的相對強度與摻入的核苷酸數量成正比。最后，核苷酸序列由摻入的核苷酸種類和熱解圖中的峰高確定。在以APS 為底物的熒光素酶測定中，很難檢測核苷酸摻入反應期間產生的少量PPi，因為會產生很高的背景信號。從PPi 產生ATP 的另一種方法是使用PPDK和AMP，這種改進大大降低了背景信號。使用了熒光素-熒光素酶的焦磷酸測序，在準確性、系統靈活性和整個測序過程的自動化方面與其他新測序方法相比具有較多優勢，使其在測序界榜上有名。

3.2 熒光酶-熒光素探針

熒光探針是一種小分子傳感器，可在特定刺激時暴露出明亮的熒光，是化學、生物學領域里的強大工具?；诜忾]策略，許多生物發光探針得到了很好的開發。在各種生物發光系統中，應用最廣泛的生物發光系統是螢火蟲熒光素系統。螢火蟲熒光素系統探針已成功應用于生理過程分析、環境監測、疾病診斷、篩選候選藥物，評估治療效果等方面[22]。

3.2.1 測定細胞信號 G 蛋白偶聯受體（GPCR）處G 蛋白依賴性信號級聯的激活越早，對測量信號的放大效應就越小。這在精確量化激動劑功效的情況下特別有用，并且在確定與β-arrestin 途徑相關的激動劑偏倚時至關重要。Littmann 等[23]開發了一種具有近端讀數和足夠高通量的技術，可用于檢測活細胞的信號。主要是通過分裂熒光素酶互補實驗（SLC）來評估Gαq蛋白及其效應物磷脂酶C-β3的相互作用。該方法具有近端讀數和足夠的高通量，并且可用于活細胞的檢測。Nazari等[24]將來海腎熒光素酶（RLuc）與膜蛋白V 相連，開發了一類新的基于膜蛋白V 的細胞凋亡探針，以可溶的形式在大腸埃希菌BL21(DE3)中成功表達，并對純化后的探針Rluc/AnnexinV，進行了功能檢測，最后用于檢測放線菌素D 誘導的Jurkat 細胞凋亡。結果表明，Rluc/Annexin V 可以與凋亡細胞結合，并且可以通過光度測量來檢測海腎熒光素酶的信號。該探針可能對改善當前細胞凋亡的檢測具有潛在的商業意義。以上可以看出熒光素酶在探測細胞信號中發揮著極大作用。

3.2.2 檢測核酸 核酸檢測方法以熒光定量PCR 最為常見，也是實驗室的金標準，然而熒光素酶在核酸檢測中也有一席之位。Endoh 等[25]構建了一種分子內熒光素酶互補探針，用于檢測除蛋白質-蛋白質相互作用之外的目標生物分子。它由插入肽的螢火蟲熒光素酶（PI-FLuc）組成，在內部分開的螢火蟲熒光素酶之間含有短肽。插入的短肽通過其誘導的構象變化觸發其與FLuc 互補，并隨后重新激活或滅活FLuc 的活性。將RNA 與含有ARM、Rev 或Tat 的精氨酸相結合，用于模型肽插入，并使用沒有小麥生殖細胞的蛋白質合成系統表達PI-FLuc 探針變體。當結合特定的RNA 靶標后，會顯示FLuc 活性發生變化，重新激活或失活。Joda 等[26]基于高斯熒光素酶的生物發光設計了一種莖環狀的探針，用于檢測HIV-1核酸。檢測過程中顯示出對單個和雙重錯配核酸靶標的極佳選擇性，低檢測限以及檢測人血清基質中HIV-1RNA 的能力。以及來自大腸埃希氏菌O157 的實際基因組DNA 樣本也可以利用熒光素酶進行檢測。

3.2.3 檢測蛋白 Ozawa 等[27]基于蛋白質剪接過程設計了與螢火蟲熒光素酶互補的片段，開發了一種檢測哺乳動物細胞中蛋白質-蛋白質相互作用的新方法。在這種方法中，蛋白質之間相互作用會觸發DnaE 內含肽的折疊，發生蛋白質剪接，從而使連接的熒光素酶的外泌蛋白恢復其酶活性。這為研究蛋白質的磷酸化和整合膜蛋白之間的相互作用提供了一種簡便的方法。

3.2.4 細胞成像 生物發光成像（BLI）是新開發的非侵入性的可視化的方法，其特點為靈敏度高，分辨率和選擇性高，背景信號低以及不需要外部光激發[28]?；谖灮鹣x熒光素-熒光素酶系統的BLI已被廣泛用于腫瘤特異性酶的活性評估，包括與疾病相關的生物活性小分子和金屬離子的檢測以及疾病的診斷和治療，也包括藥物轉運的研究，生理病理過程中[29]免疫反應的研究以及對藥物效力和組織分布的評估。

3.3 熒光素酶報告基因系統

第1個報告基因系統是在20世紀80年代初期開發的，其最初目的是為了測量酶的活性（作為啟動子驅動的轉錄活性的替代指標）以及分析特定啟動子的活性（即，在與報告基因相連的特定啟動子的調控下的基因表達）。該系統可以高度敏感地可視化特定啟動子的活性。通常，有兩類報告系統：用于細胞跟蹤的組成型表達報告構系統，以及用于表征特定的組織，腫瘤或信號通路的內源信號分子和轉錄因子的誘導型報告系統?；跓晒馑孛傅膱蟾婊蛳到y是生物醫學研究中的重要工具。在熒光素酶中，黃素依賴酶的使用最常見。

3.3.1 研究基因表達 Goodman 等[30]早在1999年就利用螢火蟲熒光素酶作為報告基因，研究變形鏈球菌中的基因表達。在變形鏈球菌中測試了螢火蟲熒光素酶作為報告基因的效用。在內源性啟動子的控制下，熒光素酶編碼序列被強烈表達，而無啟動子的版本與背景是無法區分的。熒光素酶在研究基因表達的方向上，一直在不斷發展。在2019 年的時候，Shan 等[31]建立了DGKθ 內源性啟動子熒光素酶報告基因HepG2 細胞系，用于研究DGKθ 基因的轉錄調控。2020 年時開發出檢測Sox9轉錄因子的熒光素酶報告基因[32]，能定量檢測活細胞中的Sox9-SUMOylation水平。

3.3.2 藥物的篩選 熒光素酶報告基因具有高敏感性、特異性靶點、高通量的特點，能夠進行先導化合物的篩選，使小分子有機化合物替代生物大分子作為藥物成為可能，包括糖皮質激素、增值抑制劑、抗瘧藥物等的篩選。在新型冠狀病毒大流行中，熒光素酶作為報告基因也貢獻出自己的一份力量，在高通量篩選血清學檢測方法和藥物開發中發揮著關鍵作用[33]。

3.3.3 蛋白研究 近年來，隨著分子生物學與基因組學的發展，出現了很多新型的基于不同水平的蛋白質的研究方法，其中熒光素酶報告基因也在這一方面逐漸發揮作用。Naylor 等[34]使用Tol2轉座子系統生成了一個轉基因斑馬魚系，該系使用fabp10a 肝臟特異性啟動子過度表達與受體相關蛋白的D3 域融合的納米熒光素酶分子。使用光度計，通過測量胚胎培養基中的發光強度來量化NL-D3 斑馬魚幼蟲中的蛋白尿，以此進行腎功能的評估。

3.3.4 檢測熱原 Wang 等[35]用含有熒光素酶基因的NF-κB-RE 質粒去轉染HL60 細胞，開發了一種新型熒光素酶報告基因檢測熱原的方法。通過用熱原刺激，獲得與熱原濃度呈劑量依賴性的信號。由于其檢測速度快、靈敏度高、操作方式方便、熱原譜檢測范圍廣等優點，有望成為檢測熱原的一種補充方法。

3.4 熒光素酶生物傳感器

生物傳感器是利用電子組件（換能器）和生物組件來研究生物體的設備。它們通常用于檢查生物結構，是有前途的、值得選擇性的檢測設備，具備作為即時檢測工具的巨大潛力。其與分子探針聯用使人們能夠在分子水平上研究生命系統中的生物學和病理學過程，從而將化學和生物學與醫學聯系起來。熒光素酶作為一種生物傳感器，逐漸用于各方各面，并發揮著不可或缺的作用。

3.4.1 評估蛋白酶活性 Zhou等[36]研究了4種基于熒光素酶的生物傳感器，其中包含被HAV 3Cpro或點狀DnaE內含肽切割的NEMO序列（PVLKAQ↓ADIYKA），以監測人胚腎細胞（HEK）中HAV 3Cpro的活性。數據表明，開發的熒光素酶生物傳感器可快速、靈敏和有效的評估HAV 3Cpro的活性。

3.4.2 檢測金屬離子 將生物發光用于重金屬檢測的生物傳感器并不常見。多數通過發光用于重金屬檢測的生物傳感器都是發射熒光的，并且依賴于發光的強度進行測量；少數是比率型的，需要依賴于光譜變化來產生信號。但螢火蟲熒光素酶可以與汞和砷等金屬離子偶聯形成響應性啟動子[37]，并在生物傳感器上作為光發射器。其發光光譜對重金屬陽離子（例如鋅和汞）和pH 非常敏感。結果表明該生物傳感器可檢測出對低至0.1 mmol/L的重金屬，這表明了螢火蟲熒光素酶生物傳感器作為細胞內金屬檢測的潛在適用性。

3.4.3 作為示蹤劑 de la Fuente等[38]描述了一種來自橈足類動物Metridia lucens的新型熒光素酶（MlLuc），并開發了一種新型生物發光的重組親和體（MlLuc-aff），MlLuc-aff能夠作為示蹤劑準確檢測乳腺腫瘤細胞中表達的HER2受體，有助于乳腺癌患者的早期診斷和治療效果的評估。White等[39]開發了一種納米熒光素酶生物傳感器，用于研究內源性趨化因子的分泌以及和受體的結合，以便更好了解它們之間的功能和相互作用。利用CRISPR/Cas9 基因組編輯納米熒光素酶片段HiBiT，用來標記趨化因子CXCL12。隨后通過輸出的光信號來定量監測CXCL12 的分泌。由于納米熒光素酶互補的空間限制，可以監測標記的CXCL12與趨化因子受體或膜糖胺聚糖的結合。這些活細胞檢測方法結合了納米熒光素酶的敏感性和CRISPR/Cas9 基因組編輯功能，可實時、定量和監測低水平的天然分泌蛋白。

4 總結和展望

不同的發光反應在現代檢測技術中占據了不同位置，沒有任何一種生物發光系統能完全適用于所有檢測和應用。在生物成像中，生物發光和基于熒光的方法的應用重疊，前者主要用于需要高動態范圍、背景低或深層組織成像的實驗。在細菌生物學的毒性測定和研究中，通常選擇細菌生物發光系統。而藥物篩選又通常采用 D-熒光素依賴性或腔腸素依賴性系統。并且在為特定應用選擇熒光素-熒光素酶時，必須考慮熱穩定性、最佳pH、蛋白質大小、細胞或細胞外位置、聚集特性、發射波長、強度等因素?；跓晒馑孛傅牟煌瑱z測方法之間的比較見表2。

表2 基于熒光素酶的不同檢測方法的比較

目前，基于熒光素酶生物發光的檢測工具在合成生物學中的潛力只有很少一部分被挖掘出來。就發光生物體的普遍分布、發光反應在實際應用中的重要性以及其在有機化學、代謝組學和遺傳學中使用的范圍來看，生物發光可探索的領域還有很多。與此同時，隨著每年對生物發光的光物理學、遺傳學和生態學的研究，新的發光生物和光通信系統以及新的檢測方法也變得更有可能。