FVL 突變對血友病患者臨床表現的影響

王瑜（Wang Yu），王麗娥（Wang Li’e），杜姍姍（Du Shanshan）

1.青島科技大學化工學院，青島 266042；

2.揚州市江都人民醫院藥劑科，揚州 225200；

3.青島市婦女兒童醫院生殖中心，青島 266004；

凝血因子Ⅴ萊頓(Factor ⅤLeiden,FⅤL)也稱作FⅤG1691A,該突變是第 10 號外顯子上Arg506Gln/R506Q的錯義突變,將位于第1691 位的鳥嘌呤替換為腺嘌呤,同時影響到第506 位或第534 位從精氨酸到谷氨酸的修飾,已被證明是促血栓形成的重要誘因。FⅤL 突變導致的活化蛋白C抵抗(Activated Protein C Resistance,APCR)是引起靜脈血栓栓塞癥(Venous thromboembolism,VTE)的危險因素之一,凝血酶原(Prothrombin,PT)G20210A突變、FⅧ水平升高、外源性激素的使用、抗磷脂綜合征、PS 缺乏與抗凝血酶缺乏等其他因素也可能引起APCR,FⅤL 突變則最為常見,約95%以上的APCR 由FⅤL 突變所致,FⅤL 攜帶者發生動脈血栓栓塞事件的風險是正常人群的1.21 倍,會增加血栓栓塞癥事件的住院時間和復發率。FⅤL 突變在高加索人群中的攜帶頻率為3%～15%,越來越多的證據表明這種在高加索人群中高流行率的FⅤL突變可能為調節血友病的臨床表型帶來進化上的生存優勢,但該方面的研究鮮有報道。血友病A(Hemophilia A,HA)和血友病B(Hemophilia B,HB)分別是以缺乏FⅧ和FⅨ活性為特征的X 染色體隱性連鎖出血性疾病,根據FⅧ或FⅨ活性水平可分為輕、中、重型血友病,同時可以借助關節肌肉出血,目標關節損傷等數據加以輔助明確分型。本文就FⅤL 與血友病相互作用的臨床表現文獻進行整理,并進一步分析了這種突變對血友病影響的可能作用機制,為臨床血友病患者的治療提供更多參考信息。

1 FVL 突變對血友病的患者臨床表現的影響

1.1 FⅤL 改善血友病患者臨床表型

在過去十幾年間,一些體外和體內的研究表明,遺傳性促栓基因突變對出血性疾病有潛在的有益影響。Marar TT 等[1]在抑制活化蛋白C(Activated Protein C,APC)活性的小鼠模型中發現,雜合子和純合子FⅤL 可以顯著增強FeCl3誘導的提睪肌動脈損傷模型中纖維蛋白形成和血小板活化,然而在FeCl3誘導的頸靜脈損傷模型中表現不佳,我們可以推斷FⅤL 對于出血具有一定選擇性和局限性。Acharyya S 等[2]報告了一名接受FⅧ替代療法的6 歲重型HA 男孩,盡管FⅧ凝血活性嚴重耗盡,依舊沒有出現自發性出血或關節積血癥狀,推測可能是FⅤL雜合突變將該患者的血友病臨床表型從重型轉為輕型并降低凝血因子濃縮劑的使用量。Escuriola-EttingshausenC 和Nowak-G?ttl U 等[3]小組成員針對多種促血栓形成因素對德國重型HA 兒童的臨床表型前后進行了多次研究,每次都發現臨床表型明顯受到促栓危險因素共同遺傳的影響,不僅包括FⅤL,其他如PTG20210A,MTHFRC677T也可以推遲攜帶者首次癥狀性出血發生的時間,隨著研究的進一步的深入,他們發現FⅤL 和PTG20210A攜帶者除了改善重型血友病患者的年化出血率,也會顯著降低攜帶者關節積血的發生率,然而這項研究還存在一些不足之處,例如研究對象存在的蛋白C(Protein C,PC)缺陷,FⅧ基因缺陷等沒有考慮在內。López-Jiménez JJ 等[4]通過對50 例血友病患者生物標志物的出現頻率分析處理后發現,亞甲基四氫葉酸還原酶( Methylene Tetra-Hydro-Folate Reductase,MTHFR)基因型與血友病性關節病的關聯性更強,MTHFR677TT攜帶者表現出更多的關節病癥狀,而MTHFR 1298AC 攜帶者則表現出更高的關節病積液。有趣的是,El-Din Hamdy MS等[5]針對埃及9 例重型、52 例中型和39 例輕型HA 患者的研究證實雜合子FⅤL或PTG20210A對HA攜帶者的保護,顯著緩解臨床出血表現降低關節出血和受損率,并且這些基因突變在改善血友病患者出血表型方面具有疊加效應,但并沒有觀察到發病年齡的延遲。表1 總結了FⅤL 改善血友病患者臨床表型的研究,支持了這些促栓基因突變對血友病臨床表型的保護作用的假說。

表1 FVL 改善血友病患者臨床表型的研究分析和評估

1.2 FⅤL 未影響血友病患者臨床表型

目前也有病例報道FⅤL 未能發現有益HA 患者的影響。在另一項評估F ⅤL、PT G20210A、MTHFR C677T 和MTHFR A1298C 突變對中重型HA 兒童年度因子消耗影響的研究中,未能發現高患病率的FⅤL 和PT G20210A 攜帶者與非攜帶者之間的因子濃縮劑消耗量存在差異,MTHFRA1298C攜帶者的因子濃縮劑消耗量沒有減少,而與純合子MTHFR C677T 攜帶者的因子濃縮劑消耗量呈負相關[6]。這份研究的局限性在于患者數量太少以至無法進行分層,也沒有考慮直接影響出血頻率的FⅧ和FⅨ基因突變。

在血友病中,因子活性通常與臨床表型相關,但是有些重型血友病患者的出血量低于預期。已有資料顯示,即便是凝血因子和基因突變相同的血友病患者,所呈現的臨床表型也會存在很大差異[7],重型血友病患者可能經歷更重的出血事件或僅有較輕的出血傾向。此類患者因子活性水平在1%以下,平均自發性出血次數為二三十次甚至更多,現有資料顯示臨床出血嚴重程度與凝固曲線波形分析和凝血活酶生成試驗參數相關,而非與FⅧ水平有關,凝固曲線波形分析和凝血活酶生成試驗更優于FⅧ水平識別臨床重型出血者[8],另有數據證實在重型臨床出血表現的血友病患者體內可以觀察到凝血酶生成減少,與健康個體相比,在凝血酶峰高＜49%和凝血酶潛能＜72%的患者中觀察到嚴重出血表現,并且與血友病嚴重程度無關,預示著凝血酶生成與出血程度相結合可能是一種用于預防性替代療法個性化指導工具的更好選擇[9]。然而,有同樣低水平的FⅧ或FⅨ的患者每年流血次數為一兩次甚至不流血,此類統稱為非重型出血表現的血友病,對于非重型表現的血友病的分類至今仍是難點。血友病的關節出血最終可能導致關節損傷,研究發現非重型血友病患者的關節出血事件很少發生,雖然關節出血率較低,但較大比例的非重型成年血友病患者的關節核磁共振成像,19%、71%和71%患者的肘部、膝蓋和腳踝處存在軟組織變化,0%、20%和35%患者的肘部、膝蓋和腳踝處存在骨軟骨變化[10],有相關學者建議以探討非重型血友病患者的關節狀況為出發點,對非重型血友病進行分類。

相較于上文FⅤL 突變可以顯著改善血友病患者的生存率,有研究顯示生存優勢似乎并不顯著(表2),一部分原因可能是由于有些重型患者的臨床表現存在相當大的異質性,隨著研究的深入,這種表型差異的決定因素除了公認的殘留凝血因子活性水平、凝血因子濃縮物的藥代動力學參數和促血栓標記物外,還與低PC 水平,FⅧ、FⅦ基因的功能多態性有關。當前內含子22 和內含子1 倒位突變是重型HA 中的熱點突變,約占全球病例數的一半,在伊拉克[11]、美國[12]等國家均有篩查數據支持,FⅧc.5999-277G＞A 深度內含子突變則是近期的研究焦點[13],而FⅧc.353A＞G 則被發現可以延長凝血時間[14],FⅦ353Q 則已被證實會影響重型血友病患者的表型[15],因此不同基因缺陷的血友病臨床表型通常是不同的。

表2 FVL 未影響血友病患者臨床表型的研究分析和評估

Chaves DG 等[16]研究結果顯示與重型HA 患者高出血率組相比,關節和肌肉低出血率組的內源性凝血酶潛能和血漿FⅦ水平更高。目前的證據表明,這種促栓突變可能補償低FⅧ或Ⅸ水平,引起更有效的凝血酶生成,并隨后減輕臨床癥狀。另一方面,這種促栓突變與其他獲得性或遺傳性促血栓性因素的關聯可能會克服血友病患者的先天性出血傾向,從而增加血栓并發癥的風險。

1.3 FⅤL 與血友病患者血栓形成

實際上血友病患者很少發生血栓性事件,多數血栓形成病例常與手術、惡性腫瘤、凝血因子濃縮物的替代治療有關。如表3 數據顯示,1 例伴有FⅤL雜合突變輕型HA 男孩在沒有危險因素的情況下出現左枕葉陳舊性梗死[17],1 例FⅤL 突變HA 患者則是拔牙前使用重組人凝血FⅧ和氨甲環酸后發生急性心肌梗死[18],而另1 例FⅤL 突變輕型HB 患者則是接受髖關節置換術后發生VTE,后期接受高純度FⅨ濃縮劑后,手術腿發生深靜脈血栓栓塞[19]。事實并非完全如此,如1 例51 歲輕型HA 男性患者因冠狀動脈旁路手術而接受FⅧ濃縮物后,發生急性心肌梗死[20],而另一例患者在使用重組凝血因子期間,非ST 段抬高性急性冠脈綜合征演變為ST 段抬高性急性冠脈綜合征[21],而這兩例患者本身并非FⅤL 突變攜帶者。這里,我們可以推測FⅤL 突變對血友病患者是否會促血栓形成的臨床表型是受多因素影響的,對于FⅤL 對血友病患者的潛在治療意義還有待進一步研究。

表3 FVL 與血友病患者血栓形成的研究分析和評估

2 FVL 突變與血友病相關的藥理作用

FⅤL 突變是引起91.01% APCR 的主要原因[22],目前與APCR 相關改善血友病臨床表型主要有兩種機制,包括FⅤL 突變在凝血級聯激活過程中增加凝血酶生成,以及激活纖維蛋白溶解抑制物(Thrombin Activatable Fibrinolysis Inhibitor,TAFI)誘導的纖溶下調,針對這兩種機制在血友病患者中的作用過程及相關臨床表現本文將做以下具體分析(圖1)。

圖1 FVL 對凝血和纖溶過程的影響

2.1 FⅤL 突變促進凝血酶生成

APC 本身是一種強大的抗凝劑,可水解失活凝血級聯反應中的FⅤa 和FⅧa,從而抑制Ⅹ酶原復合物和凝血酶原復合物(Prothrombin complex concentrate,PCC),FⅤ作為APC 輔因子,具有促凝與抗凝功能,與蛋白S(Protein S,PS)協同調節內在Ⅹ酶復合物中的FⅧa。當前血友病的治療大多以促進血管損傷部位產生大量的凝血酶為目的,其中APC 抑制劑就是以延長PCC 的壽命,直接提高組織損傷部位的凝血酶生成而研制的。APC 裂解位點Arg506突變引起的APCR,使APC 不能有效地裂解和滅活FⅤa 和FⅧa,從而延長APC 對FⅧa 和FⅤa的裂解時間,現已證實FⅤ是輕中型HA 中促進凝血酶生成的關鍵因子,可以在FⅧ缺乏的血漿中挽救凝血酶的生成[23],促使已經形成的PT 有更多的時間發揮作用,增加凝血酶的生成。

Wilhelm AR 等[24]試驗數據表明,FⅧR336Q/R562Q 突變在HA 體內卓越的止血功效得益于FⅧR336Q/R562Q 突變產生的APCR。這為FⅤL 引起的APCR 可以抑制FⅧa 的降解,從而延長某些HA 患者有限FⅧa 的存活時間提供了數據支持,同時也為血友病患者減少出血性事件的發生提供了理論基礎。

2.2 FⅤL 突變誘導促纖溶下調

已報道的研究表明,凝血酶激活的TAFI 可能與血栓栓塞的風險增加有關[25],血漿TAFI 水平升高出現在肺血栓栓塞[26]、深靜脈血栓[27]、中風[28]和VTE[29]。雖然也有不一致的研究結果,很可能與血栓類型和TAFI 基因多態性及種族差異有關。

APC 的促纖溶作用歸因于APC 可以減弱PT激活和隨后的TAFI 激活,而FⅤL 突變可以特異性減弱APC 的促纖溶作用并增強TAFI 的激活。TAFI是FⅤL 對抗纖溶作用的主要媒介物。體外研究表明,從純合FⅤL 個體中制備的纖維蛋白凝塊對APC 的原纖溶作用具有抗性。凝血酶本身就是TAFI 最有效的激活劑,而FⅤL 突變引起的APCR可以進一步加強凝血酶的生成能力,此時大量生成的凝血酶可以增強TAFI 激活效率,導致低纖溶狀態,特異性增強血栓形成,使血友病患者出血狀況得以緩解。

2.3 FⅤL 突變降低炎癥表達

基質金屬蛋白酶(Matrix Metalloproteinases,MMPs)是一族鋅依賴性內肽酶,能夠降解細胞外基質的各種蛋白質組分,已知MMPs 在保持黏膜完整性和調節多種病理過程如炎癥、癌癥和纖維化等方面具有重要作用,另有報告表明MMPs 可以加速顳下頜關節組織退化,并可能介導顳下頜關節疾病的疼痛。顳下頜關節退化和終末期疾病會導致持續性疼痛和嚴重的頜骨功能障礙[30]。如基質溶解素MMP3 是參與軟骨退化的主要酶,現已發現該基因的多態性、年齡、白細胞介素1β 和腫瘤壞死因子與增加骨關節炎患者的MMP3 表達顯著有關[31]。MMP12 被發現在類風濕性關節炎患者的滑膜組織中強表達,近期報告則顯示MMP12 在牙周病、顳下頜關節功能障礙、正畸牙齒移動和口腔鱗狀細胞癌組織中高表達[32]。

纖溶系統包括纖溶酶、纖溶酶原及各自的激活劑,除了本身的纖溶特性外,還可以通過蛋白水解酶降解細胞外基質并調節生長因子和MMPs 的激活。FⅤL突變特異性減弱APC 的促纖溶作用,降低對MMPs 的激活,這對于緩和血友病性關節病的炎癥,緩解關節退化是有輔助作用的。

2.4 FⅧ對FⅤL 的影響

FⅤ可作為APC 的輔因子參與抑制FⅤa 和FⅧa的活性,因而可以說APC 是在PS 輔助下通過直接滅活FⅤa、FⅧa 和間接滅活依賴FⅤ輔因子的FⅧa 這三條途徑發揮抗凝作用。FⅤ一旦被激活為FⅤa,充當FXa 的輔因子參與PCC 的形成,會進一步激活凝血途徑。FⅤL 突變使FⅤa 無法被APC 水解滅活為FⅤ,增加患者體內FⅤa 水平,另一層面上限制了間接滅活依賴FⅤ輔因子的FⅧa 這條抗凝途徑,導致血友病患者體內FⅧa 失活受到限制。FX 是凝血級聯反應的關鍵交匯點,FXa 生成至纖維蛋白形成屬于內源、外源凝血途徑的共同通路,無論是FⅤa 還是FⅧa,最終目的都是為了激活FXa 促進生成凝血酶。FⅤL 突變直接或間接增加患者體內FⅤa 和FⅧa,一定程度上輔助促進凝血酶的生成。

3 問題與展望

分析文獻可以看到,雖然FⅤL 突變的促VTE形成危險因素基本得到大多數學者認可,但在特定生理病理情況下可提供一定的優勢,比如血友病。我們總結發現FⅤL 突變對某些血友病患者是有利于疾病發展的,包括FⅤL 突變通過使FⅤa 不易被APC 裂解,引起APCR,增加凝血酶生成和減輕纖溶活性；FⅤL 突變可以延遲血友病患者首次癥狀性出血時間,降低關節出血、受損事件的發生率,減少凝血因子濃縮劑用量,改善血友病患者臨床表現。雖然在部分研究中并沒有顯示出攜帶FⅤL 突變的血友病有止血效果,但是可以通過凝血因子濃縮物消耗量,出血發作時間的延遲和關節病情況等數據輔助參考。此外,我們也有理由推測,這種促栓突變與其他獲得性或遺傳性親血栓因素的關聯可能克服先天性出血傾向,為血友病患者帶來生存良助。

需要強調的是,此類文獻數據存在一定局限性。例如實驗數據的差異,小鼠品系、環境因素和個體差異等都可能會影響某些止血參數,更不能完全模擬FⅤL 攜帶的血友病患者。成人試驗混雜因素則包括性別、年齡、經濟和地理位置等,對于納入的患者數量有限,以及研究設計中關于患者的選擇和促栓因素分析的差異,也可以解釋各研究結果的差異。此外,由于遺傳性促栓危險因素不能解釋所有臨床表型的病例,不排除還有其他因素影響。對血友病的典型基因同質組進行多中心、大規模研究將有助于闡明遺傳性血栓形成在這類患者的臨床表型調節中的作用。

當前,對血友病患者采取預防治療是防止出血和致殘的最佳方案,特別是在病情初期,但血友病性關節病極為常見,甚至在預防初期、血友病攜帶者和輕型血友病患者中也有關節畸變的報道,即便是維持各凝血因子水平超持續在1%以上也并不能完全防止關節出血。因此,及早發現、及早預防、及早治療顯得格外重要。就現有資料而言,軟骨炎癥、軟骨損傷和骨骼形成因素等少數候選者可能成為識別血友病患者早期關節損傷發生和進展的特定生物標記物。今后對血友病患者的治療趨勢可能包括避免外傷的預防治療、FⅧ制劑的替代治療、補充鈣劑的營養治療和適宜強度的康復治療,以及對各類生物標記物的常規監測。

貢獻聲明王瑜負責文獻檢索、數據收集與分析、撰寫文章和修改文章；王麗娥負責指導研究和審閱文章；杜姍姍負責指導研究和審閱文章

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突