光酶催化合成進展

明陽，陳彬，黃小強

（南京大學化學化工學院，南京大學化學與生物醫藥創新研究院，配位化學國家重點實驗室，江蘇 南京 210023）

自然界中的酶是細胞產生的天然催化劑，由于酶活性口袋獨特的空間結構，它可以降低反應活化能并調控反應過程，從而可以在溫和條件下催化高度化學選擇性、區域選擇性和立體選擇性的反應［1］。得益于微生物學、分子生物學和合成生物學等相關領域的高速發展，許多具有優異催化性能的酶已經可以市場化，大大擴展了生物催化工具箱［2］。以酶催化為基石的生物制造可以顯著降低成本和能源消耗，還具有優異的反應活性和選擇性，因此酶廣泛用于食品和動物飼料、日化、制藥和生物技術研發等行業［3?5］。最近的一份統計報告顯示，2021 年全球酶市場價值約58 億美元，預計到2031 年將達102 億美元［6］。而在學術研究領域，化學家們對反應選擇性，尤其是立體選擇性的追求越來越高。酶催化由于具有綠色可持續、活性高與選擇性可進化、可調控的優點，所以其被視為一個解決傳統合成所面臨的環境、效率和立體控制等問題的潛在完美方案［7?8］。然而，相對于傳統化學催化劑，現有酶催化的反應類型相對有限，難以滿足綠色生物合成的需求。因此，如何通過擴展酶的催化功能來實現更多更廣泛的生物合成，是當下科學前沿的熱點問題［9］。

太陽能是一種環保無污染、豐富且可再生的清潔能源，因此被視為一種綠色化學合成的“理想試劑”［10］。1912 年，有機光化學的先驅人物Giacomo Ciamician 最早闡述了這一觀點［11］，在題為《未來的光化學》的文章中提到：一個新的、對環境更負責任的化學工業，可以用清潔、經濟、高效的光化學轉化取代高能合成工藝，并由此帶來巨大的生態效益。就像植物能利用陽光作為可再生能源將CO2和水轉化為有機化合物，光化學合成相較于傳統合成的優勢在于更清潔、可持續。此外，新型高效光催化劑的開發［12?13］，豐富了光催化的機理途徑［14］，進而推動了光催化水裂解制氫［15］、CO2還原生產燃料［16］、降解有機污染物［17?18］以及選擇性有機合成［19?21］等領域的發展。在過去的十余年中，可見光催化與合成化學的交叉融合已經成為了一個非常重要的研究領域。然而，光誘導所產生的高能有機中間體通常面臨著活性過高、反應性難以調控、副反應較多等問題［22?24］。因此，如何恰當地設計光催化合成體系，從而合理地避免副反應發生，提高反應的選擇性，是目前光催化有機合成的難點。

光酶催化能夠一定程度上解決可見光催化和酶催化分別面臨的問題，同時通過整合各自的優勢，實現高附加值化合物的高效、可持續綠色制造［25?28］。一方面，基于可見光催化在溫和條件下產生的活潑化學中間體，光酶催化不僅能夠利用光再生輔因子來發揮酶的天然活性，還能引發酶的非天然反應活性，獲得新酶催化功能；另一方面，利用酶催化的高選擇性和可定向進化的特性［29?30］，光酶催化能夠調控光引發的活潑反應中間體，從而為光化學領域的立體化學控制難題提供新的解決方案。自然界中被人們所揭示的天然光酶催化合成系統有四類，包括：光合系統［31?32］、光裂合酶［33］、原葉綠素酸酯氧化還原酶［34］和脂肪酸光脫羧酶［35?36］。近年來，得益于多學科技術的交叉融合，非天然的光酶催化發展迅速，在合成領域展現出了重要的應用潛力。光酶催化目前已成功用于催化碳碳、碳氮、碳氧、碳鹵成鍵等重要的生化反應，在催化活性、反應選擇性、底物譜拓展等方面表現出其獨有的優勢［8］。

本文綜述光酶催化合成領域的最新研究進展，根據光與酶的結合模式，將本文分成四部分內容討論（圖1）：光氧化還原實現輔因子再生；光催化劑?酶的協同或串聯；光激發已知酶實現新轉化；人工光酶。本文將歸納近年來典型的有關光酶催化合成的研究報道，重點分析光酶催化反應的化學機制和實現新生物轉化的策略，通過分析該領域當下面臨的瓶頸，進一步展望光酶催化未來的發展方向。

圖1 光酶催化模式圖Sub-底物；Prod-產物；Int-中間體Fig. 1 Photobiocatalytic modes diagramSub-substrate; Prod-product; Int-intermediate

1 光氧化還原實現輔因子再生

通過光氧化還原催化實現酶促反應所需輔因子的再生，是光酶結合最直觀的系統，也是最容易實現、早期報道最多的系統［37］，其意義在于替代成本高昂的天然輔因子，或簡化電子傳遞鏈從而實現更高效的反應。如圖1（a）所示，該耦合系統有5 個組成部分：底物/產物、氧化還原酶（redox enzyme）、輔因子（cofactor）/氧化還原介質（mediator）、光催化劑（photocatalyst）以及電子犧牲供體/受體。通常，該系統可以看作由協同的酶氧化還原循環和光氧化還原循環組成。以光催化循環實現輔因子的還原再生為例：首先，光催化劑被光激發，從犧牲電子供體中捕獲電子或氫原子；隨后，電子從還原態光催化劑直接或間接轉移至輔因子，實現輔因子的還原再生；最后，氧化還原酶利用再生的輔因子，將底物還原為對應產物［38］。目前常見的犧牲電子供體包括叔胺［如三乙醇胺（TEOA）、乙二胺四乙酸（EDTA）］、有機酸（如甲酸、抗壞血酸）、含硫化合物（如甲硫氨酸、聯二亞硫酸鹽）、兩性離子緩沖液［2?嗎啉乙磺酸（MES）、4?羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）］等；而光催化劑的種類更加多樣，包括各種金屬有機絡合物、有機染料（如卟啉?葉綠素、黃嘌呤、黃素）和納米材料［如量子點（QD）、氮化碳（CN）、碳點（CD）］等；目前報道過的輔因子/介質主要包括煙酰胺腺嘌呤二核苷酸/煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸NAD（P）H、黃素（flavins，如FMN/FAD）、甲基紫精（methyl viologen， MV2+）、銠絡合物等［39］（圖2）。目前已有許多綜述總結了有關研究［37?41］，因此本文僅介紹一些近期報道的典型例子。

圖2 光氧化還原實現輔因子再生系統中常見的犧牲電子供體、輔因子或介質Fig. 2 Common sacrificial electron donors and cofactors/mediators in photoredox?enabled cofactor regeneration system

2018 年，Paul 和Park 等［42］報告了使用光驅動氮摻雜碳納米點（N?CDs）再生輔因子NADH 及其類似物，并用于老黃酶（old yellow enzyme，OYE）催化的不對稱碳碳雙鍵的還原反應。由N?CDs產生的光激發電子還原銠絡合物（Mox），還原態的銠絡合物Mred將基質中的輔因子NAD+還原進而將氫負提供給老黃酶中的輔基（黃素單核苷酸FMN），完成酶活化底物的立體選擇性還原。同年，Kottke 等［43］使用藍光和犧牲還原供體EDTA再生黃素腺嘌呤二核苷酸（FADH2），開發了一例光化學驅動的黃素依賴鹵代酶催化的色氨酸5?位氯化反應。該系統通過照射酶結合的黃素而不是游離黃素，避免了游離黃素之間的無效電子循環，提高了電子傳遞效率。

在光合系統中，錨定在類囊體膜上的鐵氧還蛋白將電子傳遞給NADP+還原酶（FNR），實現NADPH 的高效再生。受此啟發，整合天然酶與半導體光催化劑而構建的光?酶耦合催化系統（PECCS），在清潔能源轉化和大宗化學品合成方面具有巨大的前景。姜忠義/石家福團隊［44］將銠絡合物（［Cp*Rh（bpy）H2O］2+）通過單寧酸/聚乙烯亞胺（TA/PEI）黏合層錨定在聚合物氮化碳（PCN）上，獲得了PCN@TA/PEI?Rh 這種核殼結構的光催化劑。在可見光照射下，電子從PCN 核被激發，然后通過TA/PEI 殼轉移，最后被表面錨定的銠絡合物捕獲，用于NADH 的再生。核殼結構促進了電子轉移，將電子利用效率提高了約1.3 倍。將該NADH 再生系統與甲酸脫氫酶耦合，實現了從二氧化碳到甲酸的生產。之后，他們進一步優化了該核殼的光催化體系，以石墨碳氮化物（GCN）內核作為光敏劑，將銠氫絡合物包埋在二氧化鈦涂層（MH/TiO2）中作為氧化還原介質，用于乙醇脫氫酶（alcohol dehydrogenase，ADH）催化的乙醇生產［45］。其中MH/TiO2涂層起到兩個重要作用：①保護乙醇脫氫酶不被涂層中的GCN 核和MH 影響而失活；②允許電子從GCN轉移到NAD+，然后在ADH催化下轉移到甲醛。該光酶系統能以（1.78±0.21）μmol/（min·mgADH）的速率產生甲醇，比不含涂層的ADH?GCN 系統高了420%。

除了核殼結構，受類囊體顆粒堆疊結構的啟發，姜忠義/石家福團隊［46］還設計了堆疊管狀聚合氮化碳（st?PCN*）負載氯過氧化物酶（chloroperoxidase， CPO）的光酶耦合系統--st?PCN*@CPO?PECCS，前者既是光氧化還原再生H2O2的模塊，也是酶的載體。該結構克服了傳統光酶耦合系統中由于使用游離的酶所導致的輔因子擴散距離長、利用效率低的缺點，使整體光酶耦合催化效率顯著提高。在模擬陽光照射下，該系統可以向CPO 原位、連續和可控地供應H2O2，以完成后續的單氯二酮（MCD）轉化為二氯二酮（DCD）的氧化氯化反應，MCD 的最終轉化率可達39.5%。該系統的初始反應速率（MCD 的轉化速率）可達0.29 mmol/（L·h），是具有非堆疊結構對應PECCS的20倍以上。進一步，姜忠義/石家福團隊［47］開發了一種基于類囊體膜的膠囊結構的光?酶耦合催化系統（圖3），重點增強輔因子穿梭模塊的效率，從而提高整體光酶耦合催化的效率。在該系統中，酶和光催化劑分別固定在膜的外表面和內表面上，而NAD+/NADH輔因子被限制在膜中，并在酶和光催化劑之間快速穿梭，NAD（H）的表觀和固有穿梭數是非集成PECCS 的8～12 倍。將該系統用于丙醛還原為丙醇的反應，轉化頻率（TOF）可達（38 000±365） h-1。

圖3 類囊體膠囊啟發的光酶耦合系統及輔因子穿梭過程示意圖Fig. 3 Illustration of the thylakoid membrane?inspired capsule (TMC) and the NAD+/NADH shuttling process

2 光催化劑-酶的協同或串聯

由于光催化反應通常在室溫下進行，并且可以通過光引發的電子轉移或能量轉移［48］生成水相中穩定的中間體，這使得光與酶的協同或串聯組合成為可能。通過光催化劑?酶的協同或串聯，可以設計多種新穎的反應，同時避免分離中間產物的步驟，有利于簡化操作并提高效率［49］。但是由于光化學反應和酶催化反應的條件通常不完全相符，且兩個體系有可能互相干擾，因此開發動力學匹配、兼容耐受的光酶協同體系［50］，或是通過酶固定化等方法避免體系間的不利影響，是開發新型光催化劑?酶的協同或串聯系統的重點。根據外加光催化劑發揮的不同作用，本節分以下四部分內容展開討論。

2.1 光能量轉移實現底物異構化

2018 年，趙惠民、Hartwig 等［51］報道了基于光能量轉移和烯烴還原酶的協同催化反應［圖4（a）］。作者利用［Ir（dmppy）2（dtbbpy）］PF6或FMN 作為光催化劑，通過光誘導能量轉移促進烯烴的E/Z異構化；同時結合烯烴還原酶和煙酰胺輔因子再生系統，實現酶催化優選的E?構型烯烴的高對映選擇性還原，從而富集得到單一構型的還原產物。在此基礎上，2020 年趙惠民團隊［52］通過利用光氧化還原再生FMNH2的系統，在不使用NADPH 再生系統的情況下（以EDTA 或TEOA 為終端還原劑），也實現了活化烯烴的協同立體匯聚式還原。

圖4 光引發的能量/電子轉移生成酶優選底物En-烯胺催化；H·-氫原子轉移催化Fig. 4 Convert substrate into enzyme?preferred ones by photoinduced energy/electron transferEn-enamine catalysis; H·-hydrogen atom transfer catalysis

2.2 光電子轉移實現底物消旋化

動態動力學拆分（dynamic kinetic resolution，DKR）依賴于底物對映體間的快速相互轉化，結合立體選擇性鍵形成，可以將外消旋底物轉化為對映體純的產物［53?54］。

2018 年周少林等［55］利用可見光引發的單電子轉移（single electron transfer， SET）實現底物消旋，并協同脂肪酶催化的選擇性酰胺化，實現了一例溫和條件下的胺類化合物的動態動力學拆分［圖4（b）上］。機理上，光激發的雙環金屬化銥絡合物首先氧化硫醇，生成相應的硫自由基，通過可逆的氫原子轉移（hydrogen atom transfer，HAT）實現氨基鄰位的立體中心的快速消旋化。另外，作者使用商品化的脂肪酶Novozyme 435，能夠選擇性識別某一個構型的胺，在?；w存在的條件下，完成動態動力學酰胺化轉化。

2020 年MacMillan、Hyster 等［56］結合光?小分子胺催化的酮羰基β?C-H 鍵的消旋和酶催化的對映選擇性羰基轉化，成功實現了遠程惰性C-H 鍵的動態動力學拆分［圖4（b）下］?；贛acMillan前期有關小分子胺催化和光催化的研究［57］，作者利用激發態光催化劑單電子氧化烯胺中間體，得到相應的自由基陽離子中間體，從而使得原羰基的惰性β?C-H 鍵酸性增強；經由去質子化過程，轉變成5π 電子的自由基中間體；該5π 電子中間體為平面型中間體，在后續的氫原子轉移重構β?CH鍵過程中，完成羰基化合物β?位靜態立體中心的外消旋化。與此同時，協同利用酮還原酶（或轉氨酶）選擇性識別R-構型的羰基底物，不斷地將原料立體選擇性地還原為具有雙手性中心的醇（或胺）。作者提出的這一光?化學小分子催化劑結合的策略，構建了一類特有的外消旋化平臺，突破了傳統上對于靜態立體中心的定義，通過與其他催化羰基官能團轉化的生物催化過程聯用，有望開發更多立體匯聚式轉化。

2.3 光催化劑選擇性還原酶活化的底物

除了通過光能量/電子轉移實現底物的異構化/外消旋化，還可以利用酶活口袋對于底物的氫鍵活化作用，降低底物還原電勢，從而使光催化劑可以選擇性還原酶結合的底物，再結合酶活性口袋的立體化學控制能力，開發高選擇性的非天然生物催化反應。

2018 年，Hyster 等［58］利用光氧化還原催化劑與酶的結合實現了氧化還原酶新的催化功能［圖5（a）］。在可見光照射下，激發態的光催化劑Rose Bengal 將酶口袋中通過氫鍵結合的底物單電子還原，脫去乙酸根陰離子后生成α?羰基碳自由基中間體，接著與酶口袋中的NADPH 發生HAT，最終實現煙酰胺依賴的雙鍵還原酶催化的對映選擇性脫乙酰氧基反應。此外，以曙紅Y 為光催化劑，酮還原酶還可以催化α?溴酰胺的自由基脫鹵化反應。該策略展示了通過光氧化還原催化與生物催化的結合拓展天然酶反應性的巨大潛力。

圖5 光催化劑選擇性還原酶活化的底物以完成非天然轉化NtDBR-來自煙草的煙酰胺依賴性雙鍵還原酶DBR；RB-孟加拉玫瑰紅；MorB-來自普氏瘧原蟲的嗎啡酮還原酶；RuⅡ-Ru（bpy）；NostocER-來自點型念珠藍細菌的烯烴還原酶； YqjM?S/R-來自枯草芽孢桿菌的（S/R選擇性）烯烴還原酶；OBzF5-五氟苯甲酰氧基Fig. 5 Selected reductions of the enzyme activated substrates by photocatalysts to achieve unnatural transformationsRB-Rose Bengal; MorB-morphinone reductase from P. putida; RuⅡ-Ru(bpy); NtDBR-Double bond reductase from Nicotiana tabacum;NostocER-Ene?Reductase from N. punctiforme; YqjM?S/R-Ene?Reductase from Bacillus subtili; OBzF5-perfluorobenzoyloxy

黃素依賴性烯烴還原酶是催化烯烴不對稱還原的高選擇性酶催化劑，然而該酶的天然底物僅限于有吸電子取代基（如醛基、羧基、酯基、酮基、腈基和硝基等）的烯烴。2019 年Hyster 課題組［59］利用Ru（bpy）3Cl2在光照下選擇性單電子還原與烯烴還原酶結合的酮類底物，通過酮基自由基（ketyl radical）和FMNhq之間的HAT，實現烯烴還原酶對非天然的酮類底物的對映選擇性還原［圖5（b）］。之后在2020 年，Hyster 等［60］利用類似的策略實現了乙烯基吡啶類底物的對映選擇性還原［圖5（c）］，進一步證明了光酶協同催化對于開發天然酶新功能的重要作用。

Hyster 組［61］近期的一個相關工作描述了通過在蛋白質活性位點內生成氮自由基，進而實現不對稱氫胺化反應的例子［圖5（d）］。首先，外源光催化劑Ru（bpy）3Cl2被激發后產生長壽命三重態激發態絡合物*RuⅡ，其被酶中的輔因子FMNsq還原為RuⅠ，后者將電子轉移給與酶結合的肟酯底物，脫去苯甲酸陰離子后，生成氮中心自由基。生成的氮自由基與分子內（或另一分子）的烯烴加成，得到的前手性碳自由基中間體與還原態輔因子FMNhq發生立體選擇性的HAT過程，最終生成對映體富集的環化產物。該文報道了5?exo、6?endo、7?endo和8?endo以及分子間氫胺化產物，并通過定向進化得到了兩種對映選擇性互補的酶催化劑。

2.4 光生反應中間體參與后續酶促反應

2018 年Castagnolo 等［62］報道了將光催化硫代Michael 加成與生物催化酮還原相結合，實現1，3?巰基烷醇對映選擇性合成的光生物催化級聯反應。2019 年，何延紅、官智等報道的三聯吡啶釕和脂肪酶［63］的結合體系，實現了2，2?二取代吲哚?3?酮的直接不對稱合成［圖6（a）］［64］。首先，2?苯基吲哚被激發態的光敏劑*RuⅡ單電子氧化為自由基陽離子中間體；而經歷單電子轉移得到的RuⅠ被O2氧化回基態RuⅡ，以完成光氧化還原催化循環。在此過程中O2被還原為超氧自由基陰離子O·-2，O·-2與吲哚自由基陽離子經過加成、分子內質子轉移、脫水過程后形成亞胺酮中間體。最后，小麥胚芽脂肪酶（wheat germ lipase， WGL）的催化三聯體［Asp（or Glu）?His?Ser］質子化亞胺酮中間體；與此同時，丙酮在酶活性口袋中形成烯醇化陰離子；烯醇化陰離子進攻亞胺離子中間體以生成最終的對映體富集產物。

圖6 光生反應中間體參與后續酶促反應Fig. 6 Photogenerated intermediates take part in subsequent enzyme?catalyzed reactions

H2O2是多種過氧化物酶與過氧合酶的共底物，能夠直接參與酶催化的氧化還原反應，避免漫長復雜的電子傳遞鏈，提高反應效率［65?66］。但是高濃度的H2O2或者使用葡萄糖/葡萄糖氧化酶生成H2O時產生的副產物改變體系pH 值［13］，均可能引起生物催化劑的失活。Frank Hollmann 等［27］利用無機光催化劑金?二氧化鈦（Au?TiO2），將甲醇和氧氣轉化為CO2和H2O2，為過氧合酶rAaeUPO 原位提供H2O2，克服了該酶在高濃度H2O2存在下穩健性差的缺陷，使得酶在催化過程中保持高度活性和穩定性。通過使用該策略，rAaeUPO 將乙苯立體選擇性羥化為R?1?苯乙醇，并實現了高對映體選擇性（＞98% ee）和優異的催化轉化率（TTN＞71 000）。類似地，Hollmann 課題組［67］還開發了以水為最終犧牲電子供體的Au?TiO2?H2O2?rAaeUPO 耦合系統，實現了可見光驅動的C-H 對映選擇性氧化。進一步，張武元、Hollmann等［68］在2020年利用光引發的蒽醌?2?磺酸鈉催化過氧化氫的原位生成，與鹵素過氧化物酶（或過氧合酶）協同，實現了多種底物的鹵化和羥基化轉化［圖6（b）］。

3 光激發已知酶實現新轉化

上述光催化劑?酶的協同或串聯反應，需要外加光催化劑以完成光激發過程，與酶催化的非光過程是相對獨立的。除此之外，能夠直接被光激發的一些酶或酶?底物絡合物將在本節重點介紹。目前已經發現的4類天然光酶催化中：光合系統是地球上最重要也最早出現的光酶過程，由光系統Ⅰ和光系統Ⅱ組成，是自然界有機物生產的基礎［31?32］；光裂合酶作為一種DNA 修復酶，可以利用藍光催化光解環丁烷嘧啶二聚體（紫外線照射導致鄰近的胸腺嘧啶或胞嘧啶二聚），修復受損DNA［33］；原葉綠素酸酯氧化還原酶是一種依賴NADPH的光促酶，通過將原葉綠素還原為葉綠素a，參與葉綠素的合成［34］；以及從變異小球藻（Chlorella variabilis）中發現的FAD 依賴的脂肪酸光脫羧酶CvFAP［35?36］。前三類發現較早，酶的底物特異性也很高，難以用于開發新反應。本部分重點介紹CvFAP 的光催化新轉化以及光激發自然界中的非光酶而產生的非天然光反應。

3.1 CvFAP

2017 年， Beisson 及其同事首次報道了CvFAP，證明其可以在可見光激發下，催化一系列中長鏈（C12～C18）游離脂肪酸脫羧生成相應的烷烴或烯烴［35］，之后又對其機理進行了更詳細的研究［圖7（a）］［36］。藍光激發生成FAD*與脂肪酸陰離子發生迅速的單電子轉移過程，隨后CO2脫去，留下烷基自由基和FAD 自由基陰離子；之后從FAD 自由基陰離子到烷基自由基發生反向電子轉移（back electron transfer， BET），然后通過精氨酸給質子生成產物烷烴，并留下紅移態的FADRS。脫去的CO2大約有75%形成碳酸氫鹽，用于隨后的FAD再生和精氨酸質子化，以完成整個催化循環。

圖7 CvFAP的催化機理及其應用實例Arg-精氨酸；FAD-核黃素腺嘌呤二核苷酸；FADRS-紅移態的核黃素腺嘌呤二核苷酸；Rac-外消旋Fig. 7 Photobiocatalytic mechanism of CvFAP and the application exampleArg-Arginine; FAD-flavin adenine dinucleotide; FADRS-red?shifted oxidized flavin; Rac-racemic

自發現CvFAP 以來，研究者們通過酶工程等策略，實現了更多種類的光酶轉化。Hollmann等［69］設計了一種誘餌分子接入酶的活性口袋，以實現短鏈脂肪酸的更有效脫羧，使CvFAP 的底物范圍突破長鏈脂肪酸的限制，實現H2、甲烷、烯烴等燃氣的制備。在另一項研究中，吳起等［70］根據晶體結構和分子動力學模擬，通過位點特異性突變在關鍵位點引入大位阻氨基酸，修飾底物結合通道，使其變得更窄，從而通過疏水相互作用更好地穩定其中一個構型的底物?；诖?，他們開發出了CvFAP 的突變體G462Y，能夠選擇性地催化多種S?構型的α?氨基酸和α?羥基酸的光脫羧反應［圖7（b）］，以最高達99% ee的對映選擇性獲得未反應的R?產物，即實現消旋的α?官能化羧酸底物的動力學拆分。這項工作是通過酶工程實現CvFAP 不對稱催化的第一個例子，同時作者所采用的理性設計［71］的思路可以大大減少酶工程面臨的篩選工作的困難。此外，吳起、徐鑒等還報道了將CvFAP 通過酶工程化用于光脫羧氘化［72］和反式脂肪酸的選擇性光脫羧［73］的研究，進一步拓展了CvFAP 的催化功能。2022 年，張武元課題組［74］報道了利用CvFAP 將環氧脂肪酸轉化成脂肪環氧化物的反應，使用所得脂肪環氧化物進行后續轉化，可以生產高附加值脂肪醇、醚和二醇等增值化合物。而偶合脂肪酶、過氧化物酶和光脫羧酶的三酶級聯系統，還能以甘油三酯為原料獲得脂肪環氧化物。

Scrutton 等［75］利用大腸桿菌和鹵單胞菌等底盤表達CvFAP 的突變體，利用生物質或工業廢物的脂肪酸生物制造燃料丙烷/丁烷，描繪了一幅規?；G色生產氣體燃料的生物工廠藍圖，有助于為現有化石能源供應提供經濟、可持續、安全和清潔的替代品（圖8）。而Kabisch 等［76］通過在產油酵母中異源表達CvFAP，整合了甘油轉化為脂肪酸和脂質的代謝通路和CvFAP 催化脫羧的新反應，實現了可再生資源到生物燃料的生物制造。此外，吳起、徐鑒等［77］最近還開發了一種光化學?酶多步組合策略：串聯了脂肪酶催化的甘油酯水解、CvFAP 催化的油酸脫羧、長鏈烯烴的光催化氧化裂解以及CvFAP 突變體催化的中短鏈脂肪酸的最終脫羧，實現了從三油酸甘油酯到短鏈烷烴的生物燃料制造。這些工作初步展示出光微生物細胞工廠的巨大應用前景。

圖8 整合了CvFAP突變體的光微生物細胞工廠在生產生物燃料中的應用Fig. 8 Light?driven microbial cell factories integrating CvFAP mutant for biofuel production

3.2 煙酰胺依賴酶

除了上述天然光酶外，人們陸續發現自然界存在的其他氧化還原酶也可以被光激發，從而誘導酶的混雜反應性。含有煙酰胺和黃素的酶如酮還原酶、烯烴還原酶等在自然界中普遍存在，參與生物體中非光驅動的雙電子氧化還原代謝過程［78?79］。這些酶的輔因子可以通過與非天然底物形成電子供體?受體復合物（electron donor?acceptor complex， EDA 復合物）［80?81］，接著通過可見光激發誘發SET 生成自由基物種，實現光誘導的酶的非天然反應。EDA 復合物產生于電子受體和供體之間的前線軌道（HOMO/LUMO）的電子耦合，并可吸收可見光以引發SET，隨后生成自由基離子對，通過在底物中添加離去基團以促進該過程向生成自由基的方向不可逆地進行。

2016 年，Hyster 等［82］報道了第一個使用光激發天然非光酶，實現非天然單分子反應的例子（圖9）。作者使用的酮還原酶是一類NADPH 依賴的氧化還原酶，通常催化羰基的還原，而在該案例中，鹵代內酯底物與酶口袋中的NADPH 形成EDA 復合物，并通過光激發的單電子轉移以及隨后的氫原子轉移，實現了鹵代內酯的不對稱自由基脫鹵化反應。最近，吳起、徐鑒等［83］報道了光誘導黃素依賴的環己酮單加氧酶（CHMO）的還原脫鹵混雜反應性，可以將α-鹵代?α?氟代酮對映選擇性地還原為手性α?氟代酮。通過機理實驗和模擬計算揭示了其電子轉移/質子轉移機制（ET/PT），與以往報道的天然還原酶的光誘導脫鹵反應不同，該文提出脫鹵后生成的自由基中間體不是通過HAT 生產最終產物，而是經歷ET/PT 過程分別從輔酶和溶劑中獲得電子和質子，從而生成最終產物。

圖9 光誘導醇脫氫酶實現鹵代內酯的脫鹵化LKADH-來自克菲里乳桿菌的短鏈脫氫酶；RasDH-來自雷氏菌屬的短鏈脫氫酶Fig. 9 Dehalogenation of halogenated lactones by light?induced alcohol dehydrogenaseLKADH-short?chain dehydrogenase from Lactobacillus kefiri;RasDH-short?chain dehydrogenase from Ralstonia species

2022 年，趙惠民、王斌舉等報道了光誘導的酮還原酶催化的分子間自由基共軛加成反應（圖10）［84］。作者借鑒了聚焦理性迭代位點特異性突變策略（focused rational iterative site?specific mutagenesis， FRISM）［71，85］對商品化的酮還原酶P2?D12 進行了半理性改造，篩選出具有高產率和對映選擇性的酶突變體。通過理論計算和機理研究，作者對該反應的機理和立體選擇性的起源進行了較全面的解釋：與酮還原酶結合的NADPH 和相鄰的自由基前體鄰苯二甲酰亞胺活化的酯通過π?π堆疊相互作用形成EDA 復合物，在光激發下經歷SET 過程，后續經歷N-O 鍵斷裂并脫羧產生烷基自由基。富電子的烷基自由基對有缺電子基團的α，α?二取代末端烯烴進行共軛加成，生成前手性自由基中間體，最后通過立體選擇性的HAT 步驟，實現α?羰基立體中心的構建。

圖10 光誘導酮還原酶催化的對映選擇性分子間自由基共軛加成反應Fig. 10 Enantioselective intermolecular radical conjugate addition by light?induced ketoreductase

3.3 黃素依賴的烯烴還原酶

2019 年，Hyster 課題組［86?87］報道了一例光激發烯烴還原酶實現的分子內自由基環化反應，構建出對映體富集的五元、六元、七元和八元內酰胺［圖11（a）］。機理研究表明，通過光激發底物與酶活性位點內的還原態黃素輔因子FMNhq之間形成的EDA 復合物，發生電子轉移，底物脫去離去基團氯離子后生成碳自由基，對分子內的烯烴基團進行exo?加成或endo?加成，得到β?或γ?前手性立體中心，再通過FMNsq對后者進行氫原子轉移，得到最終的環化產物。立體化學控制是由酶口袋對于自由基加成方向以及后續HAT 步驟的限制實現的。這個案例有力證明了利用可見光激發口袋內的底物?輔因子絡合物，能開發出基態無法進行的自由基化學，實現天然酶的新催化活性。2022 年，Hyster 等［87］利用類似的策略實現了自由基分子內環化及烯丙基化反應。

圖11 光誘導烯烴還原酶實現的非天然轉化OPR1-12?氧代二甲酸還原酶；OYE1 F298G-老黃酶1的F298G突變體Fig. 11 Light?induced ene?reductase catalyzed unnatural transformationsOPR1-12?oxophytodienoate reductase; OYE1 F298G-mutants F298G of OYE1

2019年，Hyster課題組報道了一例光激發黃素依賴的烯烴還原酶催化的氧化還原中性的不對稱自由基環化反應［圖11（b）］［88］。與之前的例子不同在于，這個例子中沒有使用NADPH 輔因子再生系統，而是用了還原性的三（羥甲基）甲基甘氨酸緩沖體系（tricine buffer）。在光照下，tricine 將一個電子轉移給FMN，生成FMNsq，基態的FMNsq將底物單電子還原，脫去離去基團氯離子后生成前手性的三級烷基自由基，后續的前手性自由基對苯環的加成過程受酶口袋環境的調控。然后進一步單電子轉移和去質子化，完成重新芳構化得到最終的環化產物。

2020 年，Hyster 等［89］報道了一例機理與以往通過EDA 復合物介導的光酶反應不同的案例［圖11（c）］。作者使用紫外光直接激發烯烴還原酶口袋內的還原態FMNhq，使其能夠還原天然生物催化中低反應性的酰胺取代的烯烴，再經過質子化和酶控制的HAT 過程，實現非天然的α，β?不飽和酰胺的對映選擇性還原。該策略通過直接激發酶分子中的輔因子，拓寬了天然酶促烯烴還原反應的底物范圍。

2020 年，趙惠民等［90］報道了第一例光誘導酶催化的非天然兩分子交叉偶聯反應［圖12（a）］。從烯烴與α?鹵代羰基化合物出發，通過可見光誘導的烯烴還原酶催化的自由基氫烷基化途徑進行分子間偶聯，實現γ?手性羰基化合物的構建。在優化條件下，老黃酶OYE1可以以優異的產率和對映異構體選擇性合成多種含有γ?立體中心的羰基化合物。在不加烯烴底物的情況下能夠觀測到大量脫鹵副產物，這表明FMNhq和α?鹵代羰基化合物在酶口袋內形成的EDA 絡合物，在光激發條件下足以引發單電子轉移的過程。2021 年，Hyster 課題組［91］報道了一例相似的分子間氫烷基化反應。作者通過瞬態吸收光譜等機理實驗，提出該反應中烯烴還原酶、酶口袋中的FMNhq、鹵代酰胺以及另一底物α?甲基苯乙烯生成的四元復合物，是可見光激發的物種。其中α?甲基苯乙烯的存在可以提高FMNhq電子轉移到氯代酰胺底物的量子產率。隨后，Hyster課題組利用煙酰胺依賴型環己烯酮還原酶（NCR）的變體，報道了一例基于基態單電子轉移機制完成的烯烴氫烷基化反應［92］。

圖12 光激發烯烴還原酶實現的分子間烯烴氫烷基化反應（a）和Csp3-Csp3親電交叉偶聯反應（b）Fig. 12 Photoactivated ene?reductases enabled intermolecular reductive coupling couplings for alkene hydroalkylations (a) and Csp3-Csp3 bond formations (b)

2022 年，Hyster 課題組［93］報道了一例光酶催化的鹵代烷烴和硝基烷烴的不對稱Csp3-Csp3親電交叉偶聯反應［圖12（b）］。α?鹵代羰基化合物和烯烴還原酶口袋中的FMNhq形成EDA 復合物，在光激發后優先于硝基烷烴被化學選擇性地單電子還原，進一步脫鹵形成烷基自由基。關鍵的C-C鍵形成步驟是硝基烷烴去質子化原位生成的碳負中心捕獲缺電子的α?羰基碳自由基，然后經過亞硝酸根離子脫去步驟，形成前手性碳自由基中間體，最后經過酶控制的HAT 實現立體中心的構建。作者篩選出兩種烯烴還原酶CsER 和GluER?T36A，分別催化S?對映體和R-對映體富集產物的生成。值得注意的是，與之前常用的偏中性的緩沖體系不同，該反應的緩沖液pH調到了9.0，有利于硝基烷烴的去質子化。

4 人工光酶

人工光敏基團和/或人工催化基團可以與蛋白骨架結合，以賦予酶蛋白全新的反應性；反過來，酶骨架可以穩定在水相中的人工輔因子，并可能為反應提供受限環境或氫鍵作用，從而促進反應發生或實現選擇性，這是人工光酶的優勢。人工光酶的構建目前主要有兩種策略：①通過將光敏基團與（非天然）氨基酸共價連接構建，利用光敏基團促進反應底物的直接SET過程；②在蛋白質骨架內，通過密碼子擴增技術引入非天然光敏基團，并通過光引發的電子或能量轉移來促進反應的發生。

4.1 共價交聯酶和光催化劑

2015 年，Lewis 等［94］通過疊氮化物?炔環加成的點擊化學策略，將9?甲磺基?10?甲基吖啶（9?mesityl?10?methylacridinium， Acr+?Mes）光敏基團共價連接到脯氨酰寡肽酶（POP）內的非天然氨基酸殘基上，構建了一種人工光酶，用于硫茴香醚的氧化生成亞砜［圖13（a）］。為了更好地引入人工輔因子，研究者在該酶的活性口袋內引入4?疊氮基?L?苯丙氨酸，同時將附近4 個氨基酸殘基突變為丙氨酸，從而開發一個可以容納大空間位阻的人工輔因子的口袋。機理研究表明，該反應通過酶活性位點內硫醚底物的電子攫取開始，蛋白骨架延長了吖啶輔因子的熒光壽命。然而對照實驗結果顯示，雖然光敏劑成功修飾到生物催化劑上，但與單獨的Acr+?Mes 相比，人工光酶催化的產率并無提高，甚至有的更低。后來他們又將RuⅡ多吡啶絡合物引入POP 蛋白骨架，通過修飾吡啶上的取代基以及篩選不同的引入位點，得到了能夠催化二烯酮的分子內還原環化，以及肉桂?；溥蚝??甲氧基苯乙烯之間的［2+2］光環加成反應的人工光酶［圖13（b）］［95］。該酶相比于游離的Ru（bpy）有更高的產率和反應速率，但是無法控制反應的立體化學選擇性。

圖13 通過點擊化學將吖啶類光敏劑（a）、三聯吡啶釕（b）引入蛋白POP?Z-引入非天然4?疊氮基?L?苯丙氨酸脯氨酰寡肽酶Fig. 13 Introduction of acridine photosensitizer (a) and tris(2,2'?bipyridyl) rutheniumⅡ (b) into protein by clicking chemistryPOP?Z-p?azido?L?phenylalanine (Z) incorporated prolyl oligopeptidase (POP)

2018 年，Cheruzel 等［96］通過蛋白表面的半胱氨酸殘基與碘代乙酰胺衍生物的共價交聯反應，構建了一種P450 BM3 和釕（Ⅱ）光催化劑的雜合體。通過可見光激發引發單電子轉移，提供P450催化所必需的還原當量，從而實現了光引發的P450 催化的天然反應--C-H 鍵羥基化。2020年，Brustad 等［97］通過碘代乙酰胺手柄將2 種Acr+?Mes 輔因子與3 類穩定且具有大空腔的蛋白質骨架中的半胱氨酸結合，開發出12 種人工光酶，用于硫茴香醚的氧化（圖14）。作者發現這些人工光酶的催化性能取決于多種因素，包括Mes?Acr+光敏輔因子、蛋白質骨架、輔因子固定的位置以及不同底物等，但由于是在酶表面的凹槽處引入的非天然光敏基團，因此亞砜產物并沒有任何立體選擇性，同時反應效率與未結合的Mes?Acr+相比并沒有顯著優勢。

圖14 通過半胱氨酸殘基與碘代乙酰胺衍生物共價交聯引入光敏劑構建不同人工光酶Fig. 14 Construction of different artificial photoenzymes by introducing photosensitizers through covalent cross?linking of cysteine residues with iodoacetamide derivatives

2022 年，Schlau?Cohen 等［98］通過將商品化的紅藻光合作用捕光蛋白R?藻紅蛋白（R?phycoerythrin， R?PE）與多個［Ru（bpy）3］2+光催化劑通過酰胺鍵連接，形成新的生物雜化光催化劑，能夠利用630 nm 的紅光，催化硫醇與烯烴的偶聯以及半胱氨酸的脫硫反應等（圖15）。光譜學等機理研究表明，該雜化光催化劑中，紅光的能量也能夠從RPE 蛋白有效轉移至光催化劑，以增強化學反應性，提高產率。此外，該生物雜化催化劑雖然是一種均相催化劑，卻能夠通過超濾管離心過濾實現重復利用。該策略為開發獨特的生物雜化光催化劑提供了新的思路。之后，Hyster、Schlau?Cohen 等［99］共價連接了烯烴還原酶與經典的有機染料光催化劑，獲得了能夠被低能長波長可見光激發的新人工光酶，能夠有效催化分子內的自由基環化反應。

圖15 通過光合吸光蛋白與光催化劑結合構建吸收低能光的光酶RPE-R?藻紅蛋白，PDB 1EYXFig. 15 Construction of low energy absorption photoenzyme via the combination of photosynthetic light?harvesting protein and photocatalystRPE-R?phycoerythrin, PDB 1EYX

4.2 通過基因密碼子擴增技術插入非天然光敏氨基酸+共價交聯催化活性基團

王江云及其合作者［100］使用基因密碼子擴增技術將非天然氨基酸插入熒光蛋白（photosensitizer protein， PSP），得到具有二苯甲酮核心骨架的光敏基團［101?102］，進一步在蛋白表面特定位置，通過半胱氨酸與碘代乙酰胺衍生物共價交聯的方式，引入小分子鎳絡合物，構筑了一類新穎的人工光酶。2018 年，基于光引發的單電子還原和三聯吡啶鎳絡合物，實現了光驅動的二氧化碳還原反應［圖16（a）］［103］。2020 年王江云、鐘芳銳、劉曉紅和吳鈺周等［104］將二苯甲酮光敏基團與PSP 蛋白表面修飾的二聯吡啶鎳絡合物相結合，基于紫外光引發的能量轉移過程和過渡金屬催化的交叉偶聯，實現了人工光酶催化的鹵代芳烴脫鹵羥化反應以及C-N 鍵構建反應［圖16（b）］。研究發現，通過精確調控光敏基團與催化基團之間的空間距離，有望提高雙催化的協同作用。

圖16 具有二苯甲酮光敏基團的人工光酶催化二氧化碳的還原（a）；鹵代芳烴的脫鹵羥化反應（b）Fig. 16 Artificial photoenzymes with benzophenone photosensitive groups catalyze the reduction of carbon dioxide (a) and the dehalogenation and hydroxylation of aryl halides (b)

4.3 通過基因密碼子擴增技術插入非天然光敏氨基酸催化立體化學控制的能量轉移反應

2022年，吳鈺周、鐘芳銳和陳希等［105］報道了一類新穎的人工光酶，能夠在紫外光引發下，催化立體選擇性的三線態能量轉移反應［圖17（a）］。作者通過遺傳密碼子擴增技術，在多藥耐藥性調節蛋白LmrR［106］骨架中插入二苯甲酮類光敏基團，構建的人工光酶能夠通過三線態能量轉移機制，催化吲哚衍生物的對映選擇性分子內［2+2］環加成去芳構化反應。通過4 次計算機輔助的理性誘變，作者將該酶的結構進行了優化，最終得到了一種高效的人工光酶突變體，有著顯著的底物通用性和優異的對映體選擇性。

圖17 人工光酶實現對映選擇性的能量轉移反應Fig. 17 Enantioselective energy transfer reactions realized by artificial photoenzymes

同一時間，Green 等［107］報道了相似策略構建的人工光酶，通過三線態能量轉移促進對映選擇性［2+2］環加成反應［圖17（b）］。作者利用遺傳密碼子擴展技術將含有二苯甲酮光敏基團的非天然氨基酸引入計算機從頭設計的一種DA 酶［108］疏水口袋中的173號位，得到能夠催化三線態能量轉移的人工光酶母本。定向進化改造后得到的人工光酶突變體，可實現最高達99%的轉化率和99%的對映異構體過量值。

這兩項研究利用遺傳密碼子擴增技術，將三線態能量轉移機制與蛋白質相結合，并通過高通量篩選的酶工程，開發出具有更高反應活性和選擇性的人工光酶變體，為開發新一代具有類似于天然酶的效率和特異性的可進化光酶催化劑建立了框架。

5 展 望

盡管光酶催化剛剛興起，但是該策略已經在合成科學領域展現出巨大的應用前景。表1總結了目前報道的光酶催化反應的主要案例。光催化能夠產生高活性的中間體，而生物催化在控制立體選擇性方面具有獨特的優勢，光酶催化很好地綜合了兩者的優勢，能夠完成眾多非天然化學轉化。光與酶的協同體現在多個方面：光催化可以實現生物催化中輔因子的循環，達到節約成本或者更高效的電子傳遞等目的；具有光活性的輔因子的利用以及輔因子?底物EDA 復合物形成的策略，進一步拓寬了生物催化的化學轉化邊界，也實現了部分傳統化學催化劑無法完成的不對稱轉化；酶可以通過定向進化來進行工程化改造，內部的氫鍵網絡及其他相互作用力可以穩定活潑的開殼中間體、控制反應的立體化學過程；為了探索更廣闊的應用前景，人工光酶逐漸出現，并進一步突破了現有酶的應用范圍，使得人們可以根據反應需求設計新的生物催化劑。

過去的幾十年，我們見證了現代可見光催化合成的蓬勃發展和應用，以及蛋白質工程和合成生物學新技術的不斷涌現。因此，光與酶的結合方興未艾，具有巨大的機遇，同時也面臨著眾多挑戰：

（1）當前可被可見光激發的酶的種類比較少，多局限于黃素和煙酰胺依賴的氧化還原酶，這也導致了光酶催化的非天然轉化面臨機理途徑較單一（多是基于EDA復合物引發的凈還原體系）、依賴于活潑的自由基前體等問題。因此，急需創制可被可見光激發的新生物催化劑，比如具有多種價態變化的金屬酶與人工光酶等，進而開發更多的光酶協同機理路徑，實現更多更廣的非天然底物到高附加值光學純手性產品的合成。

（2）人工光酶用于催化非天然的不對稱轉化剛剛開始，亟待創制更多種類豐富、催化性能強大、構建方法簡潔高效、光量子效率更高的新型人工光酶。除了自上而下的酶工程，從頭設計全新的人工光酶，通過在蛋白質內產生全新的催化中心和/或光敏中心，可以為人工光酶的創制提供更快更有效的解決方案，從而為新的不對稱光酶催化轉化提供更多機會。

（3）不同于經典酶，光酶通常面臨氧氣不耐受的問題，即氧氣的存在可能會猝滅光誘導的反應中間體或產生使蛋白質失活的活性氧物種。此外光酶催化的非天然新反應，往往還存在著立體選擇性不高、活性差等問題，而傳統的酶進化方法只對蛋白局部優化，面臨活性和穩定性不可兼得等問題。因此，綜合利用機器學習和高通量自動化生物制造平臺，建立光酶的多目標協同的、高效標準化的定向進化平臺，進而實現其功能全面提升，是光酶催化合成領域待研究的方向之一。

（4）目前的光生物催化體系多數僅限于實驗室規模研究，更多有價值的新反應無法實現工業化生產。這是由于光的穿透性差以及光酶催化劑用量較大等問題，阻礙了光酶催化合成的放大。未來可用的解決方案包括引入內部照明或者連續流光反應裝置進行生產、進一步改造蛋白提高光酶的TOF、固定化光酶、發展高效光微生物細胞工廠等。

通過交叉整合生物合成與化學合成，我們相信人們會發現更多有趣、有用的新光酶催化轉化，并且開發出用于規?；镏圃斓墓饷复呋に嚺c光微生物細胞工廠，逐步推進“綠色光生物制造”時代的到來。