工程菌在腫瘤治療方面的應用進展

陳家文，黃建東，孫海濤，2

（1 南方醫科大學珠江醫院神經外科中心，國家臨床重點?？?，腦血管病診斷與治療教育部工程研究中心，廣東省普通高校腦功能修復與再生重點實驗室，廣東神經外科研究所，廣東 廣州 510280； 2 南方醫科大學珠江醫院檢驗醫學部，臨床生物樣本資源中心，南方醫科大學微生物組醫學中心，廣東 廣州 510280； 3 香港大學李嘉誠醫學院生物醫學學院，生物醫學學院，香港 999077； 4 中國科學院深圳先進技術研究院，深圳合成生物學創新研究院，中國科學院定量工程生物學重點實驗室，廣東省合成基因組學重點實驗室，廣東 深圳 518055； 5 香港大學深圳醫院臨床腫瘤科，深圳市腫瘤轉移與個體化治療重點實驗室，廣東 深圳518055； 6 粵港RNA醫學聯合實驗室，中山大學，廣東 廣州 510120）

細菌治療腫瘤有著較長的歷史，最早可以追溯到19 世紀。一名外科醫生首次用鏈球菌（Streptococcus pyogenes）來治療患有無法手術切除的肉瘤患者，并且發現部分腫瘤自發消退。在接下來的時間里，他用熱滅活的釀膿鏈球菌治療了超過1000 名的腫瘤患者并取得了較好的效果［1?3］。然而，由于結果的不穩定性，加上放射治療和化學治療的出現，細菌治療腫瘤慢慢淡出了人們的視野［4］。近年來，隨著合成生物學的蓬勃發展，人們重新考慮運用細菌來治療腫瘤，并為提高細菌療法的效果做了各種努力。用于腫瘤治療的常見細菌有沙門氏菌［5］、大腸桿菌［6］、雙歧桿菌［7］和鏈球菌［8］等，這些細菌都有靶向腫瘤和殺死腫瘤細胞的能力［9?10］。人們通過合成生物學等技術對細菌進行改造后大大增強了其在腫瘤治療上的運用，改造后的細菌可以選擇性地定植在腫瘤組織中并抑制腫瘤生長［11?13］。特別是鼠傷寒沙門氏菌研究較多，并被認為是具有較大潛力的治療方法，例如，比較常見的工程鼠傷寒沙門氏菌有VNP20009、A1?R、YB1 和SHJ2037 等。然而，單純工程菌不能消除腫瘤。人們用工程細菌作載體來表達細胞因子、細胞毒性藥物、前藥物轉化酶、調節因子、小干擾RNAs（siRNAs）和其他抗腫瘤分子來增強抗腫瘤效果［9?10，14?15］。在用于臨床治療前，工程細菌治療腫瘤還面臨著許多問題［11?13］。本文結合近年來國內外研究報道，闡述人們通過不同的策略來改造細菌，并且總結工程菌在腫瘤治療方面的一些進展。

1 細菌改造策略和應用進展

1.1 細菌的基因工程改造及應用

野生細菌的毒力較強是細菌治療腫瘤的挑戰之一，如何平衡細菌過強的毒性和治療效力是研究者急需解決的難題［16］。人們通過改造細菌的相關基因來減弱細菌的毒力，從而提高細菌的安全性。此外，在減弱細菌毒力的同時也可以增強其腫瘤靶向性。通過敲除與細菌代謝相關的基因可以減弱細菌的毒力，同時也能增強細菌在腫瘤組織的定植和減少對正常組織的破壞［10?11］。例如，減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009 中msbB缺失改變了脂質A 的結構，從而減少了細菌誘導的TNF?α 的分泌。其另一個purI基因的突變使細菌不能合成腺嘌呤［17?18］。在動物模型中，研究證實減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009 可以抑制多種腫瘤的生長［19?20］。此外，1999 年開展了減毒鼠傷寒沙門氏菌VNP20009 一期人類臨床研究，研究表明VNP2009 用于腫瘤患者具有較高的安全性。但是在最大劑量下只在3個患者的腫瘤組織中發現了細菌定植，且腫瘤組織沒有明顯的消退［18］。該研究說明，VNP2009 的腫瘤靶向性和療效需要進一步的提升。專性厭氧鼠傷寒沙門氏菌YB1 是在減毒鼠傷寒沙門氏菌SL7207 菌株的基礎上進一步改造而來。設計缺氧啟動子PepT 和反義需氧啟動子SodA 調控必需基因asd的表達。Asd是合成二氨基庚二酸（DAP）的關鍵酶，而DAP 是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要組成部分。缺乏DAP 會導致細菌在短時間內裂解。常氧下，asd基因不表達從而導致DAP 缺乏。因此，YB1 只能在厭氧條件（氧氣體積分數＜0.5%）下存活［16，21］。許多研究表明，YB1 優先在腫瘤組織定植，并可以抑制腫瘤的生長和轉移［16，21］。在動物模型中，盡管工程細菌治療多種腫瘤取得了一定的效果，但是利用改造后的細菌作為載體表達抗腫瘤分子可以進一步提高療效。常見的抗腫瘤分子有細胞因子、細胞毒性藥物、前藥物轉化酶、調節因子、小干擾RNAs（siRNAs）。在多種動物腫瘤模型中，工程細菌可以有效表達抗腫瘤分子并顯著抑制各種腫瘤的生長。隨著免疫治療的興起，人們利用工程細菌作為載體表達納米抗體來阻斷免疫抑制信號從而增強抗腫瘤免疫反應［22?24］。研究表明，在多種動物模型中工程菌表達納米抗體后腫瘤生長受到明顯的抑制，并且有些具有免疫記憶，從而抑制腫瘤的復發［22?24］。例如，大腸桿菌表達L?精氨酸聯合抗PDL?1治療腫瘤后，腫瘤生長受到明顯抑制，并且體內可以產生記憶性T 細胞，從而抑制腫瘤的復發。近年來，工程菌在腫瘤治療上取得了令人期待的結果，但是還不能完全抑制腫瘤的生長。此外，細菌的安全性一直是人們擔心的問題，如何平衡細菌的安全性和療效是一個難點。

1.2 細菌合成基因線路深度優化及應用進展

雖然人們通過改造野生細菌的相關基因降低了細菌的毒力，并且證明減毒后的細菌可以選擇性地定植在腫瘤組織同時抑制腫瘤的生長，但由于細菌在體內的遺傳不穩定，可能會產生無效或有害的表型。此外，潛在的抗生素耐藥性或逆轉細菌減毒表型的突變可能對患者健康形成威脅［11，25］。因此，開發更廣泛更安全的細菌治療方案是腫瘤治療的一個重要發展方向。隨著合成生物學的進一步發展，為進一步優化細菌提供了理論基礎和技術支撐。在傳統的細菌改造基礎上，許多重要基因線路被設計出來，常見的基因線路包括自殺開關、群體感應、遺傳振蕩器和門控系統等［16，26］。這些基因線路大大提高了細菌在腫瘤治療中的安全性，將會進一步推動細菌治療腫瘤進入臨床試驗［16，27］。自殺開關是在限定條件下可以誘導致死基因表達，導致細菌死亡的人工系統［16，28］。將自殺開關引入細菌中，可以保證細菌在腫瘤特異性區域增殖，而在其他區域可以表達自殺基因殺死細菌，從而有效保證細菌不逃逸［16，29］。目前，開發的幾種自殺開關已被用于基礎研究、生物技術、代謝工程和臨床診斷及細菌治療［16，30］。在腫瘤治療上，許多研究證實在引入了不同的自殺開關后，細菌在正常組織的定植明顯減少并且表現出較好的腫瘤抑制效果。群體感應和遺傳振蕩器的利用可以有效控制基因在特定宿主器官的表達。用改造后的細菌作為載體使其表達抗腫瘤分子，有可能劑量過高損傷正常組織［16，31］。因此，通過加入群體感應和遺傳振蕩器可以精準控制抗腫瘤分子的表達。研究表明，加入群體感應后的細菌可以最大程度地維持體內較低的細菌定植數量，從而減少對周圍組織的損傷及毒副作用，但是可以顯著抑制腫瘤的生長［32］。邏輯門控系統的構建可以整合兩個或兩個以上輸入信號并產生功能性的特異信號輸出。含邏輯門控系統的重構細菌可以通過使用連接特異性響應腫瘤相關信號的啟動子，實現治療基因的特異性輸出表達，可以作為診斷、預防和治療的高度選擇性工具［33］。比如，Liu 等［34］構建了邏輯與門（logical AND gate）基因線路，兩個啟動子hUPⅡ和hTERT 都在膀胱癌細胞中有高表達活性，但只有同時被激活時才能產生細胞表型的輸出。因此，該系統能夠更特異性地鑒別膀胱癌細胞。

2 工程菌治療腫瘤的機制探討

2.1 對腫瘤的直接作用

近年來，人們發現工程鼠傷寒沙門氏菌在腫瘤組織聚集后可以直接殺死腫瘤細胞［35］。凋亡和自噬是兩種不同的細胞過程，它們參與了細胞的生理和病理過程［36?37］。有研究表明，工程鼠傷寒沙門氏菌可以誘導腫瘤細胞發生凋亡和自噬來發揮抗腫瘤作用［圖1（a）］。凋亡蛋白酶3 和Bax 蛋白是細胞凋亡效應蛋白。鼠傷寒沙門氏菌VNP20009可以增加凋亡蛋白酶3 的活性和Bax 蛋白的表達，從而誘導胰腺導管腺癌細胞發生凋亡［19］。除了凋亡，工程鼠傷寒沙門氏菌也可以誘導腫瘤細胞發生自噬--一種調節細胞質中長壽蛋白質和不需要的細胞器降解的細胞過程［36，38］。Lee 等［38］的研究表明，在小鼠黑色素瘤模型中，工程鼠傷寒沙門氏菌可以通過下調AKT/mTOR 信號通路誘導腫瘤細胞發生自噬，并且具有時間和劑量依賴性。然而，也有研究認為工程鼠傷寒沙門氏菌誘導的腫瘤細胞自噬是一種保護機制，可以保護腫瘤細胞免受傷害。Liu 等［20］研究表明，阻斷自噬途徑之后，鼠傷寒沙門氏菌A1?R和VNP20009可以通過增強腫瘤細胞凋亡來殺死腫瘤細胞。因此，自噬抑制劑和工程鼠傷寒沙門氏菌聯合運用可能取得較好的治療效果。除了工程鼠傷寒沙門氏菌外，其他細菌也可以誘導腫瘤細胞發生凋亡。Bax和BCl?xL是凋亡的重要蛋白，并在腫瘤的進展和侵襲中具有關鍵作用。此外，PI3K/AKT 信號通路可以影響多種細胞過程，包括抑制細胞凋亡、促進細胞生長和增殖。因此，通過抑制PI3K/AKT 信號通路可能誘導腫瘤細胞發生凋亡。體外研究發現，尼氏大腸桿菌可以通過上調PTEN和Bax蛋白和下調AKT1和Bcl?xL 蛋白誘導細胞發生凋亡，從而抑制結腸腺癌生長［39］。另外，酪酸梭狀芽孢桿菌通過基質金屬蛋白酶8（MMP?8）觸發中性粒細胞釋放TNF相關凋亡誘導配體，從而誘導腫瘤細胞凋亡［40］。

圖1 工程菌治療腫瘤的機制Fig. 1 The mechanisms of genetically engineered bacteria an anti?tumor agent

2.2 激活宿主的免疫系統

腫瘤治療的難點之一是腫瘤組織中的免疫抑制微環境。骨髓來源的抑制細胞和調節性T細胞的浸潤可以導致免疫抑制微環境，從而促進腫瘤的生長［10，13］。除了誘導腫瘤細胞發生凋亡或者自噬外，細菌可以通過調節宿主的先天性和適應性免疫反應，從而提高宿主的抗腫瘤免疫反應［10?11，13，35］［圖1（b）和（c）］。Toll 受體（TLR）是膜結合型受體，在先天性和后天性免疫反應中發揮重要作用，特別是在抗病原體感染的炎癥反應中［41］。聚集在腫瘤部位的工程鼠傷寒沙門氏菌主要被細胞膜上的Toll 受體（TLR）識別。Toll 受體（TLR）主要識別革蘭氏陰性桿菌的各種模式識別受體，包括TLR4 受體識別LPS、TLR5 受體識別鞭毛蛋白、TLR 受體識別非甲基化的CpGDNA。細菌的各種模式識別受體被Toll受體識別后可以激活宿主的抗腫瘤免疫系統［11］。有研究表明，IL?1β具有明顯的抗腫瘤活性，鼠傷寒沙門氏菌ΔppGpp的LPS 與巨噬細胞上TLR4 識別后可以直接促進IL?1β 的分泌。另外，腫瘤細胞死亡后釋放的ATP可以激活巨噬細胞的炎性小體，促進巨噬細胞分泌IL?1β［42?43］。此外，LPS 也可以和腫瘤細胞膜上的CD14、TLR4 結合增加腫瘤壞死因子TNF?α 的分泌，從而破壞腫瘤血管［41］。鞭毛蛋白（細菌鞭毛的結構蛋白）亞基，可以被TLR5 受體特異性識別［44］。在腫瘤疫苗模型中，鞭毛蛋白與TLR5結合后可以增強腫瘤特異性CD8+T細胞的免疫反應［45］。鞭毛蛋白也可以通過激活TLR5 受體直接抑制乳腺癌細胞的增殖和生長［45］。YB1 是一種專性厭氧傷寒沙門氏菌，其可以在腫瘤缺氧區域聚集和抑制腫瘤生長［21，46］。此外，YB1 也可以抑制腫瘤的轉移。在感染早期YB1可以促進NK細胞分泌INF?γ，反過來分泌的INF?γ 可以使NK 細胞聚集和活化，從而殺死轉移的腫瘤細胞。該研究表明，NK 細胞的自反饋環在抑制轉移瘤方面發揮了重要作用［46?47］。許多研究表明，李斯特菌和大腸桿菌也可以通過調節宿主的抗腫瘤反應來抑制腫瘤的生長。Chandra 等［47?48］研究發現，李斯特菌（attenuatedListeria monocytogenes）可以感染骨髓衍生的免疫抑制細胞，而后將細菌運送到腫瘤微環境中。同時，它可以使MDSC 轉變為具有免疫刺激表型而分泌IL?12，繼而提高CD8+T 細胞和NK 細胞的抗腫瘤反應，從而抑制乳腺癌的生長和轉移。

雖然工程菌本身可以通過許多機制來抑制腫瘤的生長，但是其療效還需要進一步的提升。與傳統抗腫瘤治療方法相比，工程菌在腫瘤治療上有許多優勢，比如腫瘤靶向性和滲透入腫瘤組織深部的能力。隨著合成生物學的發展，人們可以采用許多新的策略進一步改造工程菌來提升其抗腫瘤的能力。

3 工程菌治療腫瘤新策略：遞送抗腫瘤分子

雖然工程菌在腫瘤治療上具有較好的療效，但是單純工程菌不能完全抑制腫瘤的生長。為了提高腫瘤治療的療效，工程菌可以作為載體來表達各種抗腫瘤分子，比如細胞因子、細胞毒性劑、免疫調節劑、腫瘤相關抗原或抗體、前藥物酶、siRNA和其他分子。工程菌表達抗腫瘤分子具有許多優點：一方面，細菌可以靶向到腫瘤組織且可以滲透到腫瘤組織內部，并且工程菌本身具有抗腫瘤和激活免疫系統的能力；另一方面，細菌可以在腫瘤組織中增殖而持續表達抗腫瘤分子，從而使其保持在較高水平［10?11，35，49］。

3.1 細胞因子

細胞因子可以通過促進免疫細胞的激活、增殖和遷移來殺死腫瘤細胞［10］。白細胞介素?2（IL?2）是由活化的CD4+T 細胞產生，其不僅可以促進淋巴細胞增殖，還可以增強細胞毒性T 淋巴細胞（CTL）和天然殺傷（NK）細胞的細胞毒性功能［50］。研究表明不同工程菌表達IL?2 后，可以顯著抑制腫瘤的生長和轉移［51?55］。Brent 等［51?52］研究表明，工程鼠傷寒沙門氏菌表達IL?2 可以誘導局部和全身的NK 細胞增殖，從而抑制骨肉瘤的轉移。在小鼠黑色素瘤模型中，工程鼠傷寒沙門氏菌表達IL?2 可以抑制黑色素瘤的生長，且可以減少黑色素瘤組織中的血管生成和顯著增加腫瘤組織壞死［54］。CCL21，被稱為6C 激活因子或次級淋巴組織趨化因子，是小分泌蛋白趨化因子家族的一個成員，其控制著淋巴細胞、樹突狀細胞、T 細胞和NK 細胞的遷移，其激活后可以增強細胞介導的免疫反應［56］。研究發現，工程鼠傷寒沙門氏菌表達CCL21 可以增加炎癥細胞的浸潤，從而抑制黑色素瘤的生長和轉移并且具有較好的安全性［56］。IL?18 最初被描述為一種IFN?γ 誘導因子，不僅能夠促進T 細胞和NK 細胞分泌細胞因子，而且還能誘導T 細胞和NK 細胞增殖和細胞溶解活性。靜脈注射工程鼠傷寒沙門氏菌表達IL?18 后，結腸癌生長和轉移明顯受到抑制。與腫瘤組織中T 細胞、NK 細胞和粒細胞的大量浸潤以及腫瘤組織中幾種細胞因子的增加有關［57］。此外，IL?12 是一種多功能的細胞因子，在各種小鼠腫瘤模型中具有強大的抗腫瘤活性。有研究表明，產芽孢梭狀芽孢桿菌（Clostridium sporogenes）在腫瘤組織缺氧區域聚集表達IL?12，可以明顯抑制乳腺癌的生長［53］。

3.2 細胞毒性劑和調節劑

除了細胞因子，工程鼠傷寒沙門氏菌也可以表達細胞毒性劑和調節劑來直接殺死腫瘤細胞或抑制腫瘤血管的生成。TNF 相關的細胞凋亡誘導配體（TRAIL）可以激活凋亡信號通路誘導腫瘤細胞凋亡［19］。工程鼠傷寒沙門氏菌表達TRAIL 可以誘導腫瘤細胞發生凋亡，從而抑制黑色素瘤和乳腺癌的生長，而對正常組織沒有明顯的毒性［58?59］。另外，內皮素是膠原蛋白的C端片段，具有抗血管生成活性。在小鼠腫瘤模型中，工程鼠傷寒沙門氏菌表達內皮素后，腫瘤血管生成明顯減少并可以誘導腫瘤細胞凋亡［60?61］。另一項研究表明內皮素可以減少腫瘤內微血管的密度，減少VEGF生成和腫瘤內CD8+T 細胞的浸潤，從而抑制腫瘤的生長［62］。細胞溶酶A（ClyA，一種34 kDa 的重整后溶血蛋白）可引起哺乳動物細胞膜的孔隙形成，從而導致細胞凋亡［6，62］。此外，FasL 是一種屬于腫瘤壞死因子蛋白家族的膜蛋白，與受體（Fas）結合后可以在Fas 敏感細胞中啟動凋亡信號。在小鼠腫瘤模型中，工程鼠傷寒沙門氏菌表達FasL 后與其受體（Fas）結合可以明顯抑制原位瘤和轉移瘤的生長，且對正常組織沒有明顯的毒性［63］。

3.3 抗腫瘤蛋白

許多蛋白可以影響腫瘤的生長，細菌表達這些蛋白可以明顯抑制腫瘤的生長。天青蛋白（azurin?like protein， Laz）是一種抗腫瘤蛋白，它是由腦膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）產生的。在腦部腫瘤中，Laz 可以與腫瘤抑制蛋白P53 相互作用，從而誘導腫瘤細胞凋亡［64］。Mansour 等［64］研究表明，鼠傷寒沙門氏菌VNP?20009 表達LAZ 蛋白可以誘導膠質母細胞發生凋亡。膠質瘤組織中MMP?2和MMP?9的水平升高可以促進腫瘤的侵襲、血管生成和轉移。金屬蛋白酶的組織抑制劑（TIMP）是MMP 的一個同源抑制劑家族，通過抑制MMP 來控制細胞外基質的降解［65］。在小鼠膠質瘤模型中，鼠傷寒沙門氏菌SHJ2037 表達TIMP?2 后抑制MMP?2 的表達從而抑制膠質瘤的生長［65］。此外，Tum?5 是一種抗血管生成蛋白。它可以降低mTOR 激酶的磷酸化和真核生物起始4E 阻止內皮細胞蛋白的合成，從而抑制新生血管的形成。有研究表明，大腸桿菌（Escherichia coliNissle 1917）表達Tum?5 可以通過抑制腫瘤組織內新生血管來發揮抗腫瘤作用，從而抑制黑色素瘤的生長［66］。p53是一種腫瘤抑制蛋白，它與腫瘤的發生、發展密切相關。在此基礎上，He Lian 等［67］用大腸桿菌（Escherichia coliNissle 1917）表達p53 和Tum?5 融合蛋白，結果發現肝細胞癌的生長明顯受到抑制且沒有明顯的副作用。

3.4 酶蛋白類

在給予原藥時，細菌表達的酶蛋白可將無毒性的原藥轉化為有活性的毒性藥物，從而降低全身毒性。胞苷脫氨酶主要存在于腸桿菌科和假單胞菌科，其具有脫氨基的功能［68］。工程鼠傷寒沙門氏菌表達胞苷脫氨酶，使無毒的5?氟胞嘧啶（5?FC）轉變為5?氟尿嘧啶（5?FU），其可以明顯抑制腫瘤的生長而不損傷其他正常組織［69?70］。工程鼠傷寒沙門氏菌在腫瘤部位聚集后表達羧基肽酶G2 后可以抑制黑色素瘤的生長［71］。表達嘌呤核苷磷酸化酶（ePNP）工程鼠傷寒沙門氏菌可以將6?甲基嘌呤?2'?脫氧核苷（MePdR）轉化為6?甲基嘌呤，從而抑制小鼠體內黑色素瘤的生長［72］。梭狀芽孢桿菌（Clostridium sporogenes）表達大腸桿菌來源的硝基還原酶（NTR），其提高了新型DNA交聯劑PR?104 的抗腫瘤活性，從而抑制宮頸癌的生長［73］。

3.5 siRNA

siRNA（RNAI）是由長19～30 個核苷酸組成的雙鏈RNA。它可以介導序列特異性基因的沉默，從而為腫瘤治療提供一種新的策略。然而，siRNAs 帶負電荷，具有膜不滲透性、在系統循環中高度不穩定等缺點。所以如何有效地傳遞小干擾RNAs（siRNAs）靶向到腫瘤組織是一個巨大的挑戰［10，74?75］。在體外和體內證實，工程菌傳遞siRNA可以特異性下調相關因子的表達［76?77］。程序性細胞死亡蛋白1（PD?1）是一種重要的免疫檢查點分子，其可以通過抑制效應T細胞的功能和誘導T 細胞耗竭，使腫瘤細胞逃脫宿主的免疫殺傷［78］。工程鼠傷寒沙門氏菌表達靶向抑制PD?1 的siRNA與吡莫嗪聯合運用可以顯著抑制小鼠體內黑色素瘤的生長。該研究表明，其可以誘導腫瘤細胞凋亡和增加腫瘤組織中CD4+T 細胞和CD8+T 細胞的數量［79］。缺氧誘導因子?1（HIF?1α）是一種關鍵的轉錄因子，可以激活幾乎所有參與糖酵解的酶的表達。有研究證實，在惡性腫瘤中，缺氧誘導因子?1（HIF?1α）表達上調可以促進腫瘤的生長和轉移［80］。在體內外卵巢癌細胞中下調HIF?1α 后，卵巢癌細胞對化療顯著敏感［77］。同樣地，在前列腺癌中腫瘤細胞由有氧糖酵解轉變為線粒體氧化磷酸化，從而顯著增強前列腺癌細胞對順鉑的敏感性［76］。Bcl?2 是一種抗凋亡蛋白，可顯著延長細胞對凋亡經典刺激的生存。值得注意的是，Bcl?2蛋白常常在腫瘤細胞中過度表達，其有利于腫瘤細胞生存和治療抵抗［81?83］。工程鼠傷寒沙門氏菌表達siRNA靶向抑制Bcl?2后，Bcl?2蛋白水平明顯下降且小鼠黑色素瘤生長明顯變慢［83］。另外，STAT3在多種人類腫瘤中持續激活，在促進腫瘤細胞增殖和生存方面起著重要作用。靶向抑制STAT3表達后也表現出明顯的抗腫瘤療效［84］。內多酰胺2，3?二氧酶1（IDO）是一種色氨酸分解代謝酶，其可以抑制適應性免疫反應，包括激活調節性T 細胞（Treg）、抑制效應性T 細胞的活性，甚至可以誘導免疫細胞凋亡［85］。抑制IDO 的表達后，可以使腫瘤組織中多形核中性粒細胞浸潤增加，從而增強抗腫瘤免疫反應［86］。

3.6 其 他

此外，近年來，PD?1 單克隆抗體和其他免疫檢查點抑制劑的臨床試驗表現出明顯的療效。然而，有一大群腫瘤患者不能對這些免疫治療產生反應并且有多重毒性反應［87?88］。因此，如何使PD?1單克隆抗體和其他免疫檢查點抑制劑靶向到腫瘤組織是一個亟需解決的問題。工程菌因其獨特的優勢成為了一個理想的工具。2020 年，來自哥倫比亞大學的團隊以尼氏大腸桿菌作為一個天然平臺，設計了一個系統使尼氏大腸桿菌可以穩定表達并釋放PD?1 和CTLA?4 納米抗體。研究結果表明，與單純運用單克隆抗體相比，注射表達PD?1和CTLA?4 的尼氏大腸桿菌后可以顯著抑制腫瘤生長。此外，該研究進一步發現小鼠體內活化的T細胞和記憶T 細胞數量明顯增加［22］。該團隊以尼氏大腸桿菌作為一個天然平臺，使其可以穩定表達和釋放CD47 納米抗體。CD47 是一種抗吞噬受體，在許多腫瘤中高度表達。研究發現，阻斷CD47 后在腫瘤微環境中浸潤性T 細胞的激活顯著增加，從而抑制腫瘤的生長和轉移［89］。STING 激活后可以增加IFN?1 的分泌，從而增強抗腫瘤免疫反應。Lora 等［23］工程化尼氏大腸桿菌靶向STING 后激活吞噬性APCs 細胞，研究發現抗腫瘤免疫反應得到顯著增強。在腫瘤中，L?精氨酸是抗腫瘤T細胞反應的重要因素，人為補充L?精氨酸可以增加腫瘤組織內L?精氨酸的水平。但人為補充所需劑量太大，操作上不太現實。為了使L?精氨酸在腫瘤組織中維持較高水平，有研究者瘤內注射能將氨氣合成L?精氨酸的工程尼氏大腸桿菌，發現腫瘤組織中L?精氨酸維持在較高水平。進一步發現注射工程尼氏大腸桿菌后，腫瘤組織內浸潤的T 細胞明顯增多并且具有長期抗腫瘤免疫效應［24］。

4 總結和展望

近幾十年來，工程菌治療腫瘤取得了巨大進展。工程菌在腫瘤治療方面具有許多優點。腫瘤靶向性可以使細菌在腫瘤部位聚集，而在正常組織中聚集較少，并且隨著時間的推移可以被免疫系統清除，從而減輕系統毒性。與化療和放療相比，細菌具有運動性。因此，細菌可以滲透入腫瘤組織深部，從而殺死深部的腫瘤細胞。與單一細菌治療相比，細菌作為載體遞送各種抗腫瘤劑可以協同提高抗腫瘤的療效。一方面，細菌可以靶向聚集在腫瘤組織直接殺死腫瘤細胞，或者抑制腫瘤血管的生成和激活免疫系統的能力；另一方面，細菌可以在腫瘤組織中增殖，從而持續表達抗腫瘤劑［9?11，35］。最新的一些研究也表明，工程菌和免疫治療（包括PD?1 抑制劑和CTLA?4 檢查點抑制劑）聯合運用也取得了令人期待的結果。

盡管基因改造的細菌在腫瘤治療方面有許多優點，但是一些臨床研究并未取得令人滿意的結果，基因改造的細菌在運用于臨床前還有許多問題需要解決。首先，安全性是細菌治療腫瘤的先決條件。如果毒性沒有充分減弱，經系統注射的細菌可能會在血液中增殖，釋放細菌毒素，甚至會引起嚴重的感染性休克。通過對細菌的相關基因進行改造，可以使細菌的毒力得到不同程度的降低，從而增強其安全性。然而，毒性過度減低，也會使細菌治療腫瘤的療效大大減低。其次，在減弱細菌毒力的同時，還要增強細菌靶向到腫瘤組織的能力，以減少對其他正常組織的影響。如何平衡細菌毒力和抗腫瘤能力是一個難點，需要設計更精巧的基因線路來對細菌進行改造。最后，細菌的遺傳不穩定性也是一個潛在的問題，因為突變可能會產生無效或有害的表型。隨著合成生物學的發展，這些問題都將解決。在不久的將來，細菌治療將會是一種具有巨大潛力的腫瘤治療的方法。遞送抗腫瘤分子基因工程菌總結于表1。

表1 遞送抗腫瘤分子基因工程菌Table 1 Anti?tumor therapeutic agents delivered by engineered attenuated bacterium