CRISPR/Cas 基因組編輯技術在絲狀真菌次級代謝產物合成中的應用

林繼聰，鄒根，劉宏民，魏勇軍

（1 鄭州大學藥學院，鄭州大學藥物研究院，鄭州大學合成生物學實驗室，藥物關鍵制備技術教育部重點實驗室，河南鄭州 450001； 2 上海市農業科學院食用菌研究所，農業農村部南方食用菌資源利用重點實驗室，國家食用菌工程技術研究中心，上海 201403）

絲狀真菌（filamentous fungi）能夠合成抗生素、色素、酶、激素等多種產品［1］，在醫藥、化工、農業和基礎生物學研究中廣泛應用。黃曲霉（Aspergillus flavus）會分泌對人類或動物具有致病性的黃曲霉毒素［2］；產黃青霉（Penicilliumchrysogenum）、頂頭孢霉（Acremonium chrysogenum）和土曲霉（Aspergillus terreus）能合成β?內酰胺類抗生素［3?4］（青霉素和頭孢菌素）或他汀類藥物［5］（圖1）。黑曲霉（Aspergillus niger）是葡糖淀粉酶［6］和果膠酶［7］的主要生產宿主，里氏木霉（Trichoderma reesei）是纖維素酶的主要生產宿主［8］；絲狀真菌生產的酶占據工業酶市場份額的50%［9］。部分絲狀真菌的次級代謝產物在特定環境條件下產生，但難以在實驗室的生長條件下合成［10］。絲狀真菌中含有大量“沉默的”生物合成基因簇（biosynthetic gene clusters，BGC），這些合成基因簇具有合成活性天然產物的潛力［11］。

圖1 部分次級代謝產物生物合成基因簇及生物合成途徑［21?23］Fig. 1 Biosynthetic gene clusters and biosynthetic pathways of some secondary metabolites

功能基因組研究對真菌次級代謝產物的合成具有重大影響［12］?；蚪M研究需要對宿主基因組進行缺失、插入和替換等遺傳操作，以探究基因的功能及其與其他基因的相互作用。與細菌和酵母相比，絲狀真菌的遺傳背景較為復雜［13］；在進行分子水平研究時，可用的遺傳篩選標記有限。此外，絲狀真菌的同源重組效率低，生長緩慢，遺傳操作困難，阻礙了對其的工程改造［14］，限制了對其的進一步開發應用［15］。

基因組編輯技術為探究真菌生理特性、合成多種天然產物等提供了技術基礎，也是獲取高性能工業生產菌株的關鍵。目前，基因組編輯技術主要有鋅指核酸酶技術（zinc?finger nucleases，ZFN）、類轉錄激活因子效應物核酸酶（transcription activator?like effector nuclease proteins，TALEN）以及成簇的規律間隔短回文重復序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）［16］等三種。其中，CRISPR 系統最簡便，在絲狀真菌遺傳育種及基因改造方面得到廣泛應用［17?18］。本文對絲狀真菌次級代謝產物（secondary metabolites，SM）合成以及基因組編輯技術進行了綜述，并闡述了絲狀真菌CRISPR 介導的基因組編輯技術的發展及其在次級代謝產物合成等方面的應用趨勢。

1 絲狀真菌次級代謝產物

絲狀真菌次級代謝產物是藥物的重要來源之一。青霉素類、頭孢菌素類藥物、灰黃霉素［19］等均屬于絲狀真菌次級代謝產物［20］（圖1）。

彎頸霉屬（Tolypocladium）的環孢菌素被用來預防器官或組織移植產生的排斥反應［24］。短密青霉（Penicillium brevicompactum）的霉酚酸可以抑制免疫排異反應，在醫藥領域具有重要的應用價值［25］。高血脂會增加血液的黏稠度，且可能引發動脈粥樣硬化、高血壓、冠心病等嚴重疾病。土曲霉（Aspergillus terreus）和橘青霉（Penicillium citrinum）的他汀類活性天然產物是降血脂的首選［26］。洛伐他汀是一種重要的降脂藥，但與其相比，辛伐他汀的降血脂作用更強，是效果更好的降血脂藥物。在工業上，先運用土曲霉合成洛伐他汀，然后通過堿水解的方法獲得了中間產物莫納克林J，再通過化學方法合成辛伐他汀。呂雪峰團隊［27］鑒定了一個新的水解酶PcEST，該酶可以高效轉化洛伐他汀為莫納克林J。同時，研究人員利用土曲霉內源性組成型強啟動子PgpdAt過表達特異性轉錄調控因子lovE，將莫納克林J的產量提高了52.5%［28］。

絲狀真菌次級代謝產物的合成過程復雜，相關基因通常成簇排列（圖1）。AntiSMASH等生物信息學軟件可以預測基因組中的BGC，但仍需通過敲除等基因操作研究證實相關BGC的功能［29］。天然宿主在實驗室條件下生長緩慢且遺傳工具稀缺，部分天然產物BGC難以表達；盡管可在模式宿主中異源表達天然產物BGC，但成功率較低［30］。通常，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是異源合成天然產物BGC的真菌宿主［31］。釀酒酵母的高效重組方法和多種基因組編輯技術為復雜天然產物合成途徑的異源表達提供了基礎。青蒿酸［32］、人參皂苷Rh2［33］、文多靈和長春質堿［34］等多種復雜植物天然產物已在酵母中成功合成，但長片段天然產物BGC的表達仍較為困難。開發真菌類基因組編輯系統是深入研究和表征天然產物BGC的重要途徑。

2 CRISPR/Cas基因組編輯技術

2013 年，新一代基因編輯技術CRISPR/Cas9誕生［35］，開啟了基因組編輯的新時代。CRISPR/Cas9 系統作為細菌的一種特殊防御機制，主要用來抵御入侵的病毒和質粒［36］。DiCarlo 等［37］在釀酒酵母中實現了基于CRISPR/Cas9 的基因編輯。2015 年，Liu 等［38］第一次將CRISPR/Cas9 技術應用于里氏木霉，為CRISPR/Cas9 基因組編輯系統廣泛應用于絲狀真菌的遺傳改造奠定了基礎。與ZFN 和TALEN 技術相比，CRISPR/Cas9 系統能夠誘導宿主細胞中DNA 的雙鏈斷裂（double strand break，DSB），提高了基因編輯整合的效率。

2.1 CRISPR/Cas9系統的工作原理

CRISPR/Cas9 基因組編輯系統由Cas9 核酸酶以及通過融合CRISPR RNA（crRNA）和trans?activating crRNA （tracrRNA） 形成的 sgRNA（single guide RNA）組成。與ZFN 和TALEN 相比，CRISPR 系統在基因組編輯方面更加快速、通用且精準［39］。其中，sgRNA 負責識別原間隔區相鄰基序（PAM）位點上游的20 個核苷酸序列。當sgRNA 識別出目標DNA 序列后，Cas9 將在PAM和其上游20 bp之間的位點斷裂DNA雙鏈，進而激活宿主DNA 非同源末端連接（non?homologous end joining，NHEJ） 或同源重組（homologous recombination，HR）修復過程（圖2）。

圖2 CRISPR/Cas基因組編輯系統作用機制Fig. 2 Mechanism of CRISPR/Cas genome editing systems

2.2 NHEJ和HR修復機制

Cas9 蛋白切割目標靶點產生的DSB，可以通過非同源末端連接（NHEJ）或同源重組（HR）修復。NHEJ 修復可能會隨機插入、刪除DNA 序列，精準度不高；HR 修復通過同源序列進行，精準度高，是進行精準基因編輯的關鍵［40］。NHEJ在細胞周期的G1期隨機發生，在Ku 蛋白復合物（Ku70/80）的作用下，NHEJ 修復途徑可直接使DNA 末端雙鏈斷裂進行連接。HR修復發生在DNA復制過程中，同源供體DNA 片段與其特定靶標二者缺一不可［41］，能進行精確修復。

基于HR 的原理，Liu 等［38］在絲狀真菌里氏木霉中建立了CRISPR/Cas9 系統，發現不同長度同源臂的同源重組效率均在93%以上，實現了有效的外源基因整合。Suzuki 等［42］設計了一種基于CRISPR/Cas9 的同源獨立靶向整合（HITI）策略，該方法利用NHEJ途徑，在分裂和非分裂細胞中實現靶向敲入，允許通過NHEJ修復將片段整合到基因組中。Clemmensen等［43］將環形供體、線性供體分別轉入擴展青霉（Penicillium expansum）中，發現轉入環形供體的活轉化子數量高于線性供體。這可能是由于環形供體不存在DSB，不能通過NHEJ途徑整合到染色體上，從而有利于HR修復［44］。

2.3 Cas9的表達

Cas9 蛋白是CRISPR/Cas9 基因組編輯系統的重要組成部分，具有切割目標靶點的作用［45］。CRISPR/Cas9系統是在細菌或古細菌中發現的，而真菌中不存在Cas9 蛋白［46］。因此，需根據真菌密碼子偏好性，重新設計優化Cas9基因序列。此外，需在Cas9基因兩端添加SV40等核定位信號［47］，以實現Cas9 蛋白的定向表達，完成對真菌基因組的編輯。盡管SV40 廣泛應用，但在尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）［48］和藤倉鐮刀菌（Fusarium fujikuroi）［49］等真菌中，需使用其特有的內源核定位信號序列連接Cas9蛋白。

Cas9 蛋白的成功表達依賴于系統所用啟動子的類型和強度，選擇合適的啟動子對于建立高效的CRISPR/Cas9 系統至關重要［50］。在絲狀真菌中，主要使用構巢曲霉（Aspergillus nidulans）的trpC［51］、gpdA［52］和tef1［53］組成型啟動子表達Cas9蛋白。有研究表明Cas9 的持續表達會產生細胞毒性［54?55］，因此，里氏木霉的cbh1啟動子或構巢曲霉的xlnA啟動子等誘導型啟動子常用于Cas9 的表達。在里氏木霉中，多使用cbh1啟動子表達Cas9基因，以減少基因編輯的脫靶效應［38］。經基因組學研究后，工業青霉素生產菌產黃青霉Wisconsin 54?1255被歸屬于魯本斯青霉（Penicillium rubens）［56］。在魯本斯青霉中，xlnA啟動子用于高表達Cas9 蛋白［57］。因此，合適的啟動子是優化絲狀真菌CRISPR/Cas9系統的方案之一。

2.4 sgRNA的表達

sgRNA 的高效表達是CRISPR/Cas9 系統發揮作用的關鍵。sgRNA 轉錄后才能在絲狀真菌中發揮作用。U6snRNA 基因序列高度保守［58］，因此，RNA 聚合酶Ⅲ型U6啟動子是sgRNA 轉錄的常用啟動子之一。在嗜熱毀絲霉（Myceliophthora thermophila）中，Liu 等［59］使用U6啟動子，以cre-1等基因為靶點，單基因編輯效率高達95%，多基因共編輯效率最高為70%。除U6啟動子外，tRNA 啟動子也可以用于sgRNA 的轉錄。通過魯本斯青霉全基因組測序以及序列注釋［60］，鑒定出145個tRNA 編碼基因。格羅寧根大學的Pohl 等［57］基于序列分析選取了tRNA?Met 和tRNA?Leu 兩個啟動子，成功敲除了與色素合成有關的pks17基因。Song 等［61］報道了在黑曲霉中由內源性tRNA 啟動子驅動的gRNA 轉錄，該啟動子包括一個tRNA 基因及其上游的100 bp 序列。進一步研究表明，將表達Cas9 的質粒與線性的gRNA 共轉化后，37 個tRNA 啟動子中有36 個能夠在黑曲霉中轉錄gRNA［61］。當gRNA 和Cas9 在質粒中表達時，基因突變的效率高達97%［61］。Zheng 等［62］發現5S rRNA 在細胞中高度保守且豐富，他們以黑曲霉的5S rRNA 基因為啟動子驅動sgRNA 的轉錄。黑曲霉的一個多肽合成酶編碼基因albA的敲除效率高達96%，遠遠高于PhU6啟動子15%～23%的敲除效率［62］。

除了上述兩種啟動子，釀酒酵母的SNR52啟動子也成功應用于煙曲霉（Aspergillus fumigatus）等絲狀真菌的基因組編輯系統的構建［63］。utp25是魯本斯青霉中U3小核RNA相關蛋白，也可以作為啟動子驅動sgRNA的轉錄［57］。

2.5 CRISPR/Cas系統在絲狀真菌中的構建

2.5.1 CRISPR/Cas元件的染色體表達

脫靶效應是絲狀真菌基因編輯效率低下的原因之一，CRISPR/Cas 元件的瞬時表達可以降低脫靶現象。誘導型teton啟動子已被用于調控煙曲霉菌株中染色體Cas9 的表達［64］。通過將體外轉錄的sgRNA 傳遞到表達Cas9 的真菌菌株中，可以實現CRISPR/Cas9的瞬時表達，已被用于構建藤倉鐮刀菌［65］等絲狀真菌的基因編輯系統（圖3）。Xiang等［66］開發了一種自殺載體，該載體將Cas9元件編碼在線性修復模板上，該模板包括一個與靶位點同源的標記基因；Cas9 切割靶基因時，標記基因可以在目標靶點重組，Cas9 則會降解，該方法已用于球毛殼菌（Chaetomium globosum）的基因組編輯。

圖3 在絲狀真菌中構建的CRISPR/Cas系統Fig. 3 The CRISPR/Cas system constructed in filamentous fungi

2.5.2 自主復制質粒

在絲狀真菌中，大多數環狀質粒沒有在染色體外維持和復制的能力，構巢曲霉的AMA1 序列（autonomous replicator derived fromAspergillus nidulans，曲霉自主復制因子）為質粒在絲狀真菌染色體外進行自主復制提供了可能［67］。由于高表達的Cas9 和多拷貝的sgRNA，AMA1 質?？梢燥@著提高轉化效率；在非選擇性條件下的傳代培養可以去除轉化子中帶有AMA1 的質粒，實現篩選標記的循環使用（圖3）［68］。利用AMA1 質粒在魯本斯青霉［57］、擴展青霉［43］和米曲霉（Aspergillus oryzae）［68］等絲狀真菌中實現了高效的基因組編輯。

AMA1 質粒丟失的難易程度取決于真菌種類。Nielsen 等［69］的研究表明一些菌株可能需要多輪的非選擇性生長才會失去所有的AMA1 質粒。使用標記基因pyrG［70］或條件致死基因Aoace2［71］等的反向選擇策略可以快速去除轉化子中的AMA1質粒。

2.5.3 核糖核蛋白復合物遞送

核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）復合物由Cas 蛋白和體外轉錄的gRNA 組成，可以遞送至絲狀真菌細胞內，實現基因組編輯（圖3）。RNP 轉化無需優化CRISPR/Cas 表達盒，減少了評估啟動子轉錄效率等構建步驟，且RNP 只是短暫存在于體內，降低了脫靶的風險［72］。然而，RNP 介導的編輯效率可能會受到sgRNA 不穩定和Cas9 轉運效率低的限制［57］。RNP 已經在里氏木霉［73］、斜臥青霉（Penicillium decumbens）［74］、波蘭青霉（Penicillium polonicum）［75］、層出鐮刀菌（Fusarium proliferatum）［76］等多種真菌中應用。

3 CRISPR/Cas 基因組編輯在絲狀真菌中的應用

CRISPR/Cas 系統已用于多種絲狀真菌的基因編輯。通過敲除天然代謝途徑中的基因或在宿主細胞中表達異源基因，有助于解析天然產物生物合成途徑、增強目標天然產物表達、削弱或消除毒性產物等，促進絲狀真菌的開發與應用。

3.1 CRISPR/Cas9介導的基因敲除

基于CRISPR/Cas9 的基因敲除是進行功能缺失研究和探究宿主次級代謝產物生物合成途徑的有效策略?；蚯贸?，可以改變菌株表型，消除工業真菌中的真菌毒素BGC 或解析特定基因/結構域的功能等。

魯本斯青霉是生產青霉素的主要工業菌種，經典菌株改良（classical strain improvement，CSI）積累的突變有助于建立以該菌為底盤菌株的天然產物生產平臺［77］。CRISPR系統可顯著提高青霉菌的遺傳改造效率。在魯本斯青霉菌的基因編輯系統中，AMA1 質粒會在無篩選壓力培養時丟失，可以實現無痕編輯。同時，在測試不同長度的供體DNA（donor DNA，dDNA）同源臂后，顯示短同源臂（60 bp）即能實現基因功能缺失。通過破壞與色素合成相關的基因，實現了魯本斯青霉的表型變化，從而表明在魯本斯青霉中建立了基于CRISPR/Cas9的基因組編輯系統。

由紅曲霉（Monascus purpureus）生產的紅曲紅被用作食品著色劑，但其產生的腎毒性霉菌毒素（橘霉素）會降低紅曲紅的產量且具有毒副作用。Liang 等［78］認為橘霉素生物合成存在冗余基因或同工酶。因此，為了避免工業真菌合成橘霉素，需要刪除整個BGC 而不是破壞單個基因。Liu等［79］設計了一種雙質粒CRISPR/Cas 系統，該系統使用環形供體質粒代替線性DNA 供體片段。雙質粒CRISPR/Cas9 系統實現了紅曲霉工業菌株中15 kb 的橘霉素BGC 的敲除，獲得了穩定的同核突變體。傳代培養10輪，在每輪發酵過程中均未檢測到橘霉素。與原始菌株紅曲紅色素值（885.30 U/mL）相比，同核突變體紅曲紅色素值（926.00 U/mL）增加了4.6%。含AMA1 的質?？梢詿o痕敲除大片段基因簇，因此，可以繼續對M. purpureus工業菌株進行迭代基因組編輯。

黑麥麥角菌（Claviceps purpurea）生產的麥角生物堿可用于治療偏頭痛、高血壓，也可以在產婦分娩后幫助子宮收縮，減少流血［80］。Yu 等［81］開發了基于體外組裝的RNP 的CRISPR/Cas9 系統，對尿苷生物合成（ura5）、菌絲形態學（rac）和麥角生物堿（easA）產生密切相關的3 個靶基因進行敲除，編輯效率達50%～100%?；隗w外組裝的RNP 可以有效地刪除麥角生物堿途徑中涉及的相關基因，有助于闡明麥角生物堿的生物合成途徑，促進對麥角菌的代謝工程改造，提高麥角生物堿合成效率。

固醇14α?去甲基化酶（Cyp51）可以催化去除固醇前體中的14α?甲基基團以轉化為麥角固醇［82］。麥角固醇參與多種真菌調控和發育過程，在真菌細胞膜的滲透性和流動性方面發揮重要作用［83］。唑類抗真菌藥通過抑制Cyp51酶削弱其前體的去甲基化、阻斷麥角固醇的合成，導致細胞內甲基化固醇的積累，從而影響/破壞真菌膜的流動性，抑制細胞增殖［84］。臨床上，曲霉屬真菌會引起侵襲性曲霉?。╥nvasive aspergillosis，IA）［85］。Pérez?Cantero等［86］構建了具有不同遺傳背景和不同唑類敏感性的cyp51A和cyp51B單敲除突變體。cyp51的單基因缺失導致伏立康唑最低抑菌濃度值低于其流行病學臨界值［86］。

赤霉酸（gibberellic acids，GA）是一類四環二萜類化合物，在植物生長調節中起著重要作用，但其生物合成基因并不成簇分布。在藤倉鐮刀菌中，GA 的生物合成主要分為牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸（geranylgeranyl diphosphate，GGPP）、GA12?醛和一系列不同GA 類似物3 個部分。GA4 和GA7的混合物與傳統使用的GA3 相比，效果更加溫和。但在GA 天然代謝途徑中，GA4 和GA7 會通過細胞色素P450 單加氧酶基因P450-3進一步轉化為GA1 與GA3。Shi 等［49］利用CRISPR/Cas9 系統重構藤倉鐮刀菌中GAs 生物合成途徑。首先破壞了P450-3基因以阻斷GA3 的合成；在P450-3缺失菌株基礎上，分別對兩個關鍵基因Cps/Ks和截短的HMGR（tHMGR） 進行過表達。與原始菌株（88.38 mg/L）相比，代謝途徑重構的菌株中GA4/GA7 混合物的產量達716.37 mg/L，提高了約7 倍。很多次級代謝產物的基因并不成簇排列，CRISPR/Cas 系統可以對代謝途徑中的基因進行敲除或過表達，重構代謝途徑和調控網絡，從而獲得目的產物并提高其產量。

Zhang 等［87］使用CRISPR/Cas9 破壞了黑曲霉中的pyrG和kusA基因后，與對照菌株的產量［（16.98±1.91） g/L］相比，突變菌株的檸檬酸產量［（33.59±3.24） g/L］提高了2.17 倍，表明抑制尿苷/嘧啶的合成可促進檸檬酸的生產?；赗NP 的CRISPR/Cas9系統已經成功應用于黑曲霉，通過該系統在工程菌株中破壞和過量表達多個琥珀酸合成相關基因，并優化溫度、pH 等條件，顯著提高了琥珀酸的產量［88］。

基于CRISPR/Cas 的基因敲除菌株已用于解析次級代謝產物途徑中的單個合成關鍵酶，并闡明其中間產物的結構與合成途徑。Brasiliamides 是由巴西青霉（Penicillium brasilianum）合成的一類含有哌嗪的生物堿，具有多種藥理活性［89］。Yuan 等［90］通過刪除組蛋白去乙?；讣せ頑rasiliamides 的合成。根據對突變體非核糖體多肽合成酶（nonribosomal peptide synthetase，NRPS）的研究，他們提出了一條新的Brasiliamides生物合成途徑，為后續Brasiliamides的大量生產提供了新思路。

3.2 CRISPR/Cas9介導的基因敲入

卡泊芬凈是首個獲得FDA批準的棘白菌素類抗真菌劑，對念珠菌屬和曲霉菌屬真菌有良好的臨床活性［91］。Glarea lozoyensis可以合成卡泊芬凈的重要前體紐莫康定B0（Pneumocandin B0）。在發酵過程中，由于脯氨酸羥化酶基因gloF的區域選擇性不高，G. lozoyensis會產生PC0等紐莫康定B0的類似物。棘白菌素B生物合成中的脯氨酸羥化酶Ap?Hty具有高區域選擇性［92］。Wei等［93］采用CRISPR/Cas9策略表達ap-htyE并成功取代gloF，突變菌株保留了合成紐莫康定B0 的能力，但消除了合成紐莫康定C0 的能力。通過替換關鍵酶，可以減少紐莫康定C0的分離步驟，具有工業應用的潛力。

來自青霉屬和曲霉屬的部分真菌已經成為真菌BGC 的異源表達宿主［94］。McLean 等［77］使用魯本斯青霉表達來自橘青霉的美伐他汀BGC（mlcA、mlcB、mlcC、mlcD、mlcE、mlcF、mlcG、mlcH、mlcR），同時表達一個細胞色素P450基因，將美伐他汀轉化為普伐他汀。在中試規模下，普伐他汀發酵產量超過6 g/L。他們使用的魯本斯青霉刪除了青霉素合成基因簇，該宿主經過多輪菌株改良，釋放了發酵條件下合成次級代謝產物的潛力。這項工作降低了異源宿主合成天然產物的優化成本，為表達其他天然產物合成基因簇提供了基礎。

3（2H）?呋喃酮是一些活性天然產物的重要組成部分［95］。Setosusin 是一種真菌類二萜，具有獨特的螺?稠合3（2H）?呋喃酮結構。Wei 等［96］在真菌杜氏曲霉（Aspergillus duricaulis）中鑒定了與Setosusin 相關的BGC，通過在米曲霉中異源重組相關酶基因，闡明了其生物合成途徑。Katayama等［68，97］在半AMA1 載體上提供了可誘導的反選擇標記Aoace2，實現了米曲霉的無標記整合。

內消旋半乳糖二酸是一種六元酸，可以作為護膚品成分使用，也可以用于生產聚合物，它可通過果膠的主要成分D?半乳糖醛酸氧化生成。黑曲霉生產的果膠酶效率高，適合于轉化富含果膠的生物質。Kuivanen 等［98］使用CRISPR/Cas9 與體外合成sgRNA 刪除了內消旋半乳糖二酸相關的基因，中斷內消旋半乳糖二酸代謝，構建了D?半乳糖醛酸分解代謝與異源糖醛酸脫氫酶表達相結合的工程化黑曲霉菌株，最終可以通過D?半乳糖醛酸合成內消旋半乳糖二酸。Dong 等［99］利用CRISPR/Cas9 介導的多拷貝敲入表達策略，在黑曲霉中高效表達了來自嗜熱毀絲霉的高活性海藻糖酶（MthT），最終，工程黑曲霉催化海藻糖水解，酶滴度可達1698.83 U/mL。

除青霉屬和曲霉屬之外，多種其他真菌也被開發為異源天然產物生產平臺。麥角酸（LA）和二氫麥角酸（DHLA）是許多藥物的先導化合物，可用于治療癡呆、偏頭痛、高催乳素血癥和其他疾?。?00?101］。但它們通常是麥角生物堿和二氫麥角生物堿合成途徑中的中間代謝產物，難以獲取。褐色綠僵菌（Metarhizium brunneum）可以天然合成多種LA 酰胺，最終合成麥角酸α?羥乙胺（LAH）以及少量的麥角新堿［102］。Davis 等［103］通過RNP 策略在褐色綠僵菌中沉默麥角生物堿途徑，并異源表達外源基因，合成了麥角酸和二氫麥角酸，且麥角酸（86.9%）和二氫麥角酸（72.8%）的相對產量遠高于已有的工程煙曲霉菌株（分別為2.6%和2.0%）。

表1 總結了絲狀真菌中CRISPR/Cas 基因組編輯系統的應用情況。

表1 絲狀真菌中CRISPR/Cas基因組編輯系統的應用Table 1 Application of CRISPR/Cas genome editing system in filamentous fungi

3.3 CRISPRa和CRISPRi系統

CRISPRa 通過核酸內切酶失活的Cas9（nuclease?dead mutants of Cas9，dCas9）連接轉錄激活子，實現基因組特定位點的轉錄［110］。CRISPRi 通過dCas9 與轉錄抑制子連接，在gRNA引導下，結合到靶基因位點，抑制轉錄起始，沉默靶基因的表達［111］。Roux 等［112］在構巢曲霉中構建了首個CRISPRa 系統，通過激活micA基因，提高了微呋喃酮的產量，并通過多基因CRISPRa 鑒定出新代謝產物脫氫微呋喃酮。絲狀真菌有能力合成多種高價值次級代謝產物，但大多數BGC 是沉默的。CRISPRa 與次級代謝產物BGC 的表達激活有助于獲取活性天然產物。Li 等［113］使用CRISPRi 對黑曲霉中的表觀遺傳效應進行了研究。通過dCas9 作用于內源性組蛋白乙?；窯cnE 和組蛋白去乙?；窰osA 和RpdA，抑制了BGC 的轉錄，但未發現表型的變化和新代謝產物的產生。

3.4 基于CRISPR/Cas的高通量篩選

與ZFN和TALEN相比，CRISPR/Cas系統可以用于高通量正向遺傳篩選［114］。sgRNA 是CRISPR/Cas系統的關鍵元件，傳統的構建sgRNA文庫方法是基于已知的全基因組序列設計并合成上萬個sgRNA，但昂貴的成本以及未知的真菌全基因組阻礙了基于CRISPR/Cas9的全基因組篩選應用。Li等［115］開發了酶切/結合農桿菌介導的轉化方法（restriction/ligation coupled with Agrobacterium?mediated transformation，RELATe），在人類真菌病原體新型隱球菌（Cryptococcus neoformans）中創建的sgRNA 文庫可以靶向基因組中超過98%的蛋白質編碼基因。新型隱球菌可以穿透血腦屏障，在免疫功能低下的人群中會引發中樞神經系統（central nervous system，CNS）感染。通過高通量功能篩選確定了142 個與發病機制相關的潛在基因。研究人員選擇SFP1和WDR1兩個基因進行了敲除，結果表明SFP1和WDR1是新型隱球菌滲透血腦屏障的必需基因。新開發的RELATe方法降低了高通量篩選的成本，與CRISPR/Cas 系統結合可以用于闡明真菌功能基因。

有效的高通量篩選策略可以從突變體庫中分離所需的突變體，進而使用CRISPR/Cas 系統對其進行遺傳改造。Luu 等［116］在里氏木霉中開發了一種基于液滴微流控技術的綠色熒光蛋白表達的新方法。他們將轉化綠色熒光蛋白的里氏木霉原生質體封裝并在液滴中孵育24 小時，通過高通量篩選液滴，最終收集到一個轉化文庫，標記基因轉化率達96%以上。與傳統轉化相比，該方法使原生質體再生時間大大縮短，再生頻率提高了8 倍，篩選速度可達每分鐘8000 液滴。該方法提高了篩選效率，有望應用于其他絲狀真菌轉化子的篩選，加快遺傳轉化速度。

3.5 絲狀真菌CRISPR/Cas9 系統面臨的問題及可能的解決方案

3.5.1 脫靶效應

在基因編輯過程中，sgRNA 引導Cas9 至與靶位點相似核苷酸序列結合，會造成潛在的脫靶效應。為了減少脫靶的出現，需要設計序列特異性較高的sgRNA。近年來，已經有多個用于預測脫靶位點并為sgRNA 進行評估的網站，如E?CRISP［117］、CHOPCHOP［118］、Cas?OFFinder［119］等。此外，研究人員開發了多種方法提高Cas9 切割的特異性，如構建Cas9?sgRNA 核糖核蛋白復合物進入細胞［120］、使用Cas12a 替換Cas9［121］等。設計適宜的sgRNA 是限制脫靶效應的關鍵因素。sgRNA 鄰近原型間隔區相鄰基序（PAM）的10～12 bp 決定了Cas9 切割特異性［122］。如果基因組含有與靶點sgRNA 相似性過高的序列，會導致Cas9 在非靶向基因位點的非預期DNA切割［123］。因此，設計獨特適宜的sgRNA，能夠降低Cas9脫靶切割的可能性。新發現的Cas12b［124］、Cas13［125］、Cas14［126］等核酸酶的應用有望在解決脫靶效應等問題中發揮作用。

3.5.2 轉化效率低

絲狀真菌較厚的細胞壁是外源基因片段進入細胞的主要障礙。破除細胞壁后的原生質體可以有效吸收外源DNA，但是原生質體的低再生率降低了絲狀真菌的轉化效率。Han 等［127］引入并優化了一種微流體細胞膜變形方法，這個方法使用快速的細胞機械變形來產生瞬時膜孔，不但能將sgRNA 和Cas9 傳遞至難以轉染的淋巴瘤細胞和胚胎干細胞中，還能保持較高的細胞活力。絲狀真菌是多核微生物，在菌絲和孢子中含有數量不定的細胞核［128］。即使其中一個細胞核的基因被破壞，其余細胞核的基因仍能保持完好，這也是轉化菌株假陽性高的原因之一。中國科學院分子植物科學卓越創新中心周志華課題組［73］在多核孢子真菌米曲霉中開發了基于RNP的CRISPR系統，通過加入化學試劑肌醇或苯菌靈，增加了單核原生質體的形成，無需進行后期的孢子分離步驟，提高了單核菌株的形成率，最高轉化效率達86.67%。通過加入Triton X?100、吐溫?80等表面活性劑，可以促進RNP復合物進入細胞，提高轉化效率。周志華團隊［73］在里氏木霉原生質體轉化中加入Triton X?100，菌落形成單位（colony forming units，CFU）較之前增加3.33倍。

3.6 絲狀真菌中的CRISPR/Cas12a基因組編輯

使用Cas9 進行基因編輯會受到其5'?NGG?3'PAM 序列的限制［129］，位點特異性不高。因此，引入依賴于其他PAM 序列的RNA 引導的核酸酶能夠更精確靶向基因組位點。毛螺菌科細菌的Cas12a（也被稱為Cpf1）采用由5'?TTTN?3'組成的PAM 序列（圖2）［129］。Abdulrachman 等［121］在棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）TBRC 277 中開發了基于AMA1的CRISPR/Cas12a表達載體，并建立了三種不同的靶向pyrG基因的引導crRNA，證明了Cas12a 能夠誘導位點特異性雙鏈斷裂。Huang等［109］在真菌病原體稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae）中建立了基于Cas12a核糖核蛋白的基因組編輯系統。BUF1編碼真菌黑色素生物合成所需的三羥基萘還原酶，研究人員設計了兩種靶向BUF1位點的gRNA，并與Cas12a 蛋白復合為RNP 轉化原生質體，BUF1位點的編輯率達到77%。Cas12a提高了基因編輯精度，將在絲狀真菌沉默基因簇挖掘和次級代謝產物研究中發揮作用。

破壞NHEJ 修復是提高基因組精準編輯效率的有效策略。美國堪薩斯州立大學Huang 等［109］在稻瘟病菌中發現CRISPR/Cas誘導的DNA雙鏈斷裂存在多種修復途徑。在絲狀真菌中，DNA 雙鏈斷裂修復主要由NHEJ 和HR 兩種途徑，但仍存在微同源介導的末端連接（microhomology?mediated end?joining，MMEJ）［130］和單鏈退火（single strand annealing，SSA）［131］兩條修復途徑。研究人員通過PCR、Sanger測序和納米孔長讀值測序技術的組合，發現在進行CRISPR/Cas12a 介導的基因編輯后，Ku80 缺失菌株中發生了較野生菌株中更大片段的DNA缺失，這是MMEJ介導的DNA突變的特征。MMEJ 等修復途徑可能會產生不可預測的基因組變異，從而引發CRISPR/Cas 系統的安全性問題。

3.7 基于CRISPR的絲狀真菌堿基編輯系統

堿基編輯（base editing，BE）分為胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor，CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor，ABE）（圖2）。CRISPR 介導的堿基編輯可以在靶基因組位點上轉換堿基，具有無需雙鏈斷裂、無需供體DNA 以及同源定向修復等優點。第三代堿基編輯器（third?generation base editor，BE3）是最常用的堿基編輯器系統，由dCas9 或Cas9?D10A 切口酶（D10A nickase，nCas9）與大鼠胞苷脫氨酶（rat cytidine deaminase，rAPOBEC1）和尿嘧啶糖基化酶抑制劑（uracil glycosylase inhibitor，UGI）組成，可以實現胞嘧啶（C）轉化為胸腺嘧啶（T）或腺嘌呤（A）轉化為鳥嘌呤（G）［132］。華南理工大學Huang等［133］在黑曲霉中應用了胞嘧啶堿基編輯器，通過單堿基編輯誘導無義突變，滅活了尿苷相關基因pyrG和色素相關基因fwnA，效率為47.36%～100%；對于非表型基因prtT的單堿基編輯效率達60%。該系統為研究黑曲霉以及其他絲狀真菌提供了便捷的工具。天津工業生物技術研究所田朝光團隊［134］在嗜熱毀絲霉中構建了進化型載脂蛋白B mRNA 編輯酶催化亞基1（APOBEC1）胞嘧啶堿基編輯器4max（Mtevo?BE4max）、噬菌體Mu Gam 蛋白胞嘧啶堿基編輯器4max（MtGAM?BE4max）、進化型CDA1脫氨酶胞嘧啶堿基編輯器（Mtevo?CDA1）等三個新的胞嘧啶堿基編輯器，并成功編輯了amdS、cre-1和Mtclr-2三個靶基因。研究人員深入研究了Mtclr-2的功能，發現其與分生孢子的產生、菌絲生長和菌落形態的維持存在密切關系。Mtevo?CDA1 的堿基編輯效率可達92.6%。由于堿基編輯不需要雙鏈斷裂和供體片段，可以彌補CRISPR/Cas9 的不足。但在水稻中應用BE3 后，顯示其誘導了大量的全基因組脫靶突變［135］。未來，仍需對堿基編輯系統組成元件和可靠性進行優化和驗證［136?137］。

4 總結與展望

自CRISPR/Cas 基因組編輯系統應用于絲狀真菌以來，研究人員對Cas9 核酸酶、sgRNA 的表達以及CRISPR/Cas 系統的遞送方式不斷優化，在模式或非模式絲狀真菌中建立了多個CRISPR/Cas 系統。CRISPR/Cas9系統是目前應用最廣泛的基因組編輯系統，但也存在Cas9核酸酶毒性、脫靶效應、轉化率低等問題。Cas12a、Cas12b、Cas13、Cas14等核酸酶的應用有望解決這些問題。

本文聚焦于絲狀真菌天然產物在醫藥領域的開發與應用。紐莫康定B0 和他汀類藥物等活性天然產物在野生菌株中存在生物合成途徑基因表達強度不高、副產物代謝途徑影響等問題。通過CRISPR/Cas 進行基因缺失或異源表達，可以探索代謝產物的BGC、改造次級代謝產物生物合成基因、促進絲狀真菌細胞工廠的構建。CRISPR/Cas技術可以進行多基因共編輯，調控副產物合成途徑中的多種酶基因，增強目標產物的積累并減少毒性物質的產生。CRISPR/Cas 技術還可以通過選擇功能元件、重構底盤細胞、優化代謝途徑等一系列策略實現絲狀真菌次級代謝產物的高產，從而加速絲狀真菌功能基因組學和次級代謝產物的研究和工業應用。