CRISPR?Cas9系統在腫瘤生物學中的應用及前景

馬孟丹，尚夢宇，劉宇辰

（1 深圳大學第一附屬醫院，深圳市第二人民醫院，深圳轉化醫學研究院，廣東 深圳 518035； 2 廣東省泌尿生殖腫瘤系統生物學與合成生物學重點實驗室，廣東 深圳 518035； 3 汕頭大學醫學院，廣東 汕頭 515041； 4 深圳大學醫學部基礎醫學院，廣東 深圳 518060）

CRISPR?Cas 系統是生物體內一種RNA 引導的適應性免疫系統，利用RNA 來引導Cas 蛋白對目標基因結合并剪切。已經發現了多種天然存在的CRISPR?Cas 系統，其中2 類系統只需要引導RNA及Cas蛋白即可完成對靶點的切割，其中最早發現的Cas9 是目前最廣泛使用的Cas 效應子，此外還有可以靶向DNA 的Cas12 和靶向RNA 的Cas13。由RNA 引導的核酸酶系統的可編程性大大增加了它的功能和使用場景，通過對Cas蛋白進行修飾改造，CRISPR 系統除用于基因剪切外還可在轉錄水平、蛋白質翻譯水平進行調控，基因組成像，單/多堿基編輯以及甲基化、乙?；缺碛^遺傳水平的修飾（圖1），這些功能在疾病治療的研究與臨床應用中極具潛力。CRISPR?Cas 系統被稱為革命性的“基因剪刀”技術，為癌癥研究和治療帶來了新的曙光［1］，該系統已被研究人員用于研究癌癥發生機制、發現耐藥相關基因，并開展與細胞信號通路、細胞功能基因組學、藥物研發、預測細胞對藥物的反應，以及癌癥治療等相關工作。

圖1 CRISPR?Cas系統衍生工具的應用Fig. 1 Application of CRISPR?Cas system derivatives

為了解決現有的臨床問題，許多研究使用CRISPR 技術建立細胞、類器官和動物癌癥模型［2?3］，探索腫瘤發生發展的分子機制，篩選耐藥細胞株［4?5］以及全基因組篩選腫瘤耐藥相關基因。該技術可高特異性地篩選靶向藥物，從而提高基因治療和免疫細胞治療對癌癥患者的療效［6?12］。本文將著重介紹CRISPR?Cas9系統及其衍生工具在腫瘤生物學基礎研究和臨床應用中的研究現狀及潛力。

1 基礎研究

通過基因測序和全基因組篩選，識別癌癥患者中常見的突變基因，利用CRISPR?Cas 技術進行基因敲除、敲入、激活或抑制來模擬腫瘤基因突變，有助于我們快速、準確地建立相關的細胞或動物模型，用于研究遺傳決定因素和腫瘤發展的潛在機制。

1.1 疾病模型構建

1.1.1 細胞模型

細胞模型具有較短的實驗周期和清晰的背景，并且易于提供結果。成神經細胞瘤是一種在兒童中發病率較高的神經內分泌腫瘤，George 等［13］為了研究成神經細胞瘤的不良預后與ATRX突變的關系，利用CRISPR?Cas9 技術，通過同源基因靶向，生成具有ATRX突變的成神經細胞瘤細胞系，并利用這些細胞模型設計了可能用于治療成神經細胞瘤的創新方法。骨肉瘤是最常見的骨原發性惡性腫瘤，現有化療藥物預后較差［14］，開發新的治療策略來改善治療效果和提高患者生存率十分重要。研究人員采用CRISPR?Cas9 技術實現敲除骨肉瘤細胞系KHOS 和U?2OS 中CDK11基因表達，細胞增殖和侵襲能力顯著減弱［15］。從而證明CRISPR?Cas9 靶向敲除CDK11基因為一種骨肉瘤的潛在治療方案。根據不同的研究目的，利用CRISPR?Cas9技術在編輯腫瘤細胞模型上對腫瘤細胞采取不同的編輯策略，通過建立新的腫瘤細胞模型，闡明發病機制，探討藥物作用機制，檢驗體外治療效果。

1.1.2 類器官模型

類器官是一種利用成體干細胞或組織中衍生的、在體外培育而成、具備三維結構的微器官，可以發展成類似于完整器官體內解剖和生理的結構。類器官培養提供了研究人類發育和疾病發生過程的潛力［16］。

腦瘤是最致命和最具破壞性的癌癥之一，但由于基因異質性和缺乏模型，腦瘤的研究一直受到阻礙［17］。Bian團隊［18］建立了一種新的腦腫瘤類器官（neoCOR）模型，在該模型中，利用轉座子和CRISPR?Cas9 技術將致癌突變引入類器官，再現了腦腫瘤的發展過程。該模型的建立補充了目前腦腫瘤生物學中的基礎和臨床前研究模型。此外，為了探索乳腺癌的病因，Dekker 等［19］利用Cas9 敲除乳腺祖細胞中P53、Pten、RB1和NF1四個乳腺癌相關基因。隨后，將突變后的腫瘤類器官移植到小鼠體內，發現這些突變的乳腺類器官獲得了可以被長期培養的能力，形成雌激素受體陽性的腔內腫瘤，并對化療藥物敏感。這些具有腫瘤特征的類器官模型的開發為腫瘤生物學的進一步研究提供了一種新的途徑。

1.1.3 動物模型

動物模型可以反映腫瘤生長情況，更方便、快速地檢測潛在的腫瘤和轉移相關基因，探索腫瘤免疫逃逸、耐藥等機制，成為臨床前藥物試驗的主要工具。除了利用CRISPR?Cas 實現胚系突變外，也將構建好的質粒原位導入動物體內誘導產生原位腫瘤模型［20］。Yang等［21］通過在小鼠受精卵中共注射Cas9 mRNA 和不同sgRNA，生成了在Nanog、Sox2和Oct4基因中攜帶標簽或熒光報告結構的小鼠模型以及Mecp2條件突變小鼠。Xue等［22］在野生型小鼠體內使用流體動力注射將表達Cas9 和sgRNA 的質粒遞送到肝臟，直接靶向腫瘤抑制基因Pten和P53誘導肝腫瘤，為肝癌模型和功能基因組學的快速發展提供了新的途徑。研究已經發現了多種癌癥相關的突變基因，但由于患者之間存在個體差異，研究它們如何影響體內腫瘤的生長和擴散仍是一個挑戰。建立能夠穩定維持腫瘤細胞特性的動物模型，有利于進一步研究腫瘤生長微環境，探索基因突變機制，并在此基礎上篩選或研發靶向藥物。

1.2 腫瘤機制研究

利用CRISPR?Cas 技術可研究腫瘤發生機制，如單核苷酸突變、染色體異位事件和其他因素在腫瘤發展中的作用；此外，它還可用于腫瘤細胞中功能基因的篩選。這些基因關聯與腫瘤發生過程中發生的基因功能變化相對應，從而有助于研究疾病機制［23］。

大量研究表明，在良性腫瘤中，血管生成罕見，血管生長緩慢；相反，大多數惡性腫瘤表現出致密的血管生成和快速的血管生長［24］。因此，血管生成在腫瘤的發展和轉移過程中起著重要作用，抑制這一過程將顯著阻止腫瘤組織的發展、擴散和轉移?？寡苌莎煼ǎˋTT）已經成功地用于抑制腫瘤的異常血管生成，然而，惡性腫瘤往往表現出對ATT 的耐藥，CRISPR?Cas9 技術用于研究腫瘤血管生成的機制和耐藥的可能原因［25?26］。He 等［26］使用基于三維微載體的細胞培養和CRISPR?Cas9 進行混合遺傳篩選，揭示了血液內皮細胞（EC）對廣泛使用的AAT 貝伐單抗耐藥反應的分子修飾機制。ARID1A 突變是人類癌癥中最常見的分子畸變之一，但其致癌機制尚不清楚。Lo 等［27］在TP53?/?的人胃器官中建立了ARID1A 敲除的缺陷模型，這些工程化的ARID1A缺陷器官反映了ARID1A突變型胃癌的臨床病理特征，結合基于調控網絡的分析和高通量藥物篩選，發現了ARID1A在胃上皮癌發生中的潛在機制。

CRISPR 衍生物也在癌癥研究中發揮了重要作用。當失活的Cas9（dCas9）蛋白與轉錄激活物或抑制蛋白結構域融合后，其隨后與sgRNA 序列結合靶向基因的上游調控區域，使得轉錄調控復合體能夠有效地控制基因的表達水平，進而探索其功能。構建靶向全基因組gRNA 文庫，利用dCas9與轉錄激活蛋白的協同活性上調全基因組表達，可用于高通量、快速的功能獲取篩選。單堿基編輯器，主要包括胞嘧啶堿基編輯器（CBE）和腺嘌呤堿基編輯器（ABE），其用于產生多個DNA損傷響應基因的單核苷酸突變，導致細胞在DNA 損傷發生時發生適應性變化，以篩選和識別DNA 損傷響應［28］。

2 腫瘤治療

癌癥是一種基因組疾病，其特征是整體基因組不穩定、大量積累的點突變和腫瘤進展中的結構變化。這些基因組突變可能產生腫瘤抗原，這些抗原可能被免疫系統識別為非自身抗原，從而引發細胞免疫反應。因此，免疫系統在免疫監測中起著至關重要的作用，來自適應性免疫系統和先天免疫系統的免疫細胞滲透到腫瘤微環境（TME）中，幫助調節腫瘤的發展［29］。免疫細胞療法在治療癌癥方面表現出了優異的療效，多種免疫細胞療法在臨床試驗中得到了成功的驗證［30］。CRISPR?Cas 系統作為一種新興的基因編輯技術，用于靶向敲除腫瘤免疫檢查點分子或進行快速簡單的基因編輯，大大降低了腫瘤免疫治療的操作難度，促進了該領域研究的發展。

2.1 免疫治療

2.1.1 過繼細胞轉移療法（ACT）

ACT 用于從腫瘤患者體內分離免疫活性細胞，擴增后在體外確定它們的功能，并將其送回患者體內，直接殺死腫瘤或激發免疫反應，最終殺死腫瘤細胞［31］。最廣泛使用的ACT 技術包括嵌合抗原受體（CAR）T細胞治療和使用CRISPR?Cas9技術設計的T 細胞受體（TCR）T 細胞治療［32?33］。該技術是最成熟和廣泛應用的免疫細胞治療，在體內和體外均顯示出良好的靶向性［34］。

CAR?T 細胞療法通過識別膜表面抗原工作，對血液腫瘤非常有效［35］。放療聯合CAR?T 細胞治療可提高治療效果［32］。許多臨床試驗已經或正在進行中，以解決CAR?T 細胞在血液系統惡性腫瘤或實體瘤患者中的安全性、可行性和有效性。CAR?T 細胞治療已被證明對血液瘤有效，因為血液瘤細胞有一個獨特靶點CD19，可用來引導CAR?T 細胞發現并摧毀癌細胞［36］。Zhang 等［37］利用非病毒系統CRISPR?Cas9 對整合位點進行切割產生雙鏈斷裂（DSB），通過HDR 對其進行修復，HDR 以包含CAR 序列的外源DNA 供體為模板，該供體上有匹配整合位點上下游的序列，因此，HDR 修復斷裂DNA 的同時會將CAR 序列定點整合進T 細胞基因組。利用Cas9 同源定向修復技術精準敲除PD1，首次生成非病毒、基因特異性靶向CAR?T 細胞，并在臨床試驗表明以這種方式生成的CAR?T 細胞是安全的，在接受治療患者中未觀察到CAR?T 治療相關的神經毒性和2 級以上的細胞因子釋放綜合征。此外，這種新型CAR?T 療法在難治性復發性淋巴瘤患者中顯示出卓越的治療效果，完全緩解率為87.5%，客觀緩解率高達100%。

CAR?T 對實體瘤的作用低于血液惡性腫瘤，Larson 等［38］通過CRISPR 全基因組篩選發現，在GBM 中，γ?干擾素受體（IFN?γR）信號通路是CAR?T 細胞充分黏附所必需的，該基因的缺失將導致腫瘤細胞對CAR?T 細胞的殺傷更具耐藥性，為CAR?T 治療實體瘤提供新的方法。目前，自體CAR?T 治療已取得了臨床和商業上的成功。開發更多靶點是使患者受益，擴大其應用價值的重要策略之一。此外，通用CAR?T 治療是CAR?T 未來的一個重要方向，這些領先的技術更多地轉化為產品，將為患者提供更廣泛的治療選擇［39］。

同樣，TCR?T 療法在黑色素瘤和滑膜肉瘤的臨床試驗中取得了重大突破，在治療其他晚期實體瘤方面也取得了初步療效［40］。Stadtmauer 等［41］使用CRISPR?Cas9 敲除了T 細胞中的3 個基因，分別是：T 細胞受體α（TCRα）基因和T 細胞受體β（TCRβ）基因，這兩個基因編碼內源性TCR 鏈；PDCD1，一個基因編碼細胞死亡蛋白1（PD?1）的基因。并插入了一種癌癥特異性TCR轉基因NYESO-1。因此，修飾后的T 細胞被命名為NYCE（NY?ESO?1transduced CRISPR 3X edited cells）。最終，經過4 輪編輯后，T 細胞被注射回病人體內并保持長達9個月的修飾。結果表明這種方法免疫原性較低，并證明了CRISPR 基因編輯在癌癥免疫治療方面應用的可行性。我們相信，將TCR 轉移和基因組編輯技術相結合，有望開發出更有效、更安全的癌癥免疫療法。

2.1.2 抗腫瘤抗體的導向治療

抗腫瘤抗體的導向治療是以抗腫瘤抗體為載體，結合具有細胞毒作用的物質，通過載體與腫瘤相關抗原的免疫蛋白結合，提高腫瘤內藥物濃度的一種治療方法。免疫檢查點分子是調節免疫反應激活與抑制之間平衡的關鍵因子。癌細胞通常通過上調免疫檢查點分子來逃避免疫監視，因此，阻斷這一過程可以顯著增強抗腫瘤免疫反應。PD?1 和細胞毒性T 淋巴細胞相關蛋白4（CTLA?4）是眾所周知的免疫檢查點，可以顯著抑制T細胞的活性，從而使腫瘤細胞容易逃離機體的免疫機制，這導致T 細胞治療效果不佳［42］。通過使用CRISPR?Cas9基因編輯技術敲除參與免疫負調節的基因，也可以實現抗腫瘤免疫應答。例如，使用靶向基因編輯技術敲除免疫檢查點是提高CAR?T治療實體腫瘤療效的一種很有前途的策略［42］。此外，Lu 等［43］在CRISPR?Cas9 基因編輯T 細胞治療晚期非小細胞肺癌患者的首個人類Ⅰ期臨床試驗中證明了這種靶向免疫治療在臨床上是可行的。同樣，Si 等［44］對造血祖細胞激酶1（HPK1）在調節T細胞功能障礙中的作用及其相關機制進行綜合研究中發現，在多種血液和實體瘤小鼠模型中，以嵌合介導的HPK1降解為靶點的基因缺失、藥物抑制或蛋白水解增強了CAR?T 細胞為基礎的免疫治療的療效。HPK1 是改善免疫治療的一個有吸引力的藥物靶點。CRISPR?Cas9 技術制備的CD?19 HPK1KOCAR?T 細胞已用于臨床試驗，這是世界上第二次通過基因編輯技術改善T細胞功能的臨床探索的一部分。

2.2 靶向致癌病毒感染

CRISPR?Cas9系統在細菌適應性免疫中具有抗病毒作用，因此其在防御和清除受感染病毒方面具有巨大潛力，使用可特異性識別病毒基因組的Cas9?sgRNA，直接靶向致癌病毒基因或維持病毒復制所需的基因，導致病毒基因組發生突變并抑制致癌病毒基因表達，從而誘導癌細胞死亡。人乳頭瘤病毒（HPV）是宮頸癌發生的主要原因，HPV 致癌基因尤其是E7 是預防和治療的關鍵靶點，研究人員使用由非病毒載體PBAE546 和靶向HPV16 E7 的CRISPR?Cas9 重組質粒組成的納米顆粒（NP），治療HPV 感染和相關宮頸惡性腫瘤。結果表明NP 在裸鼠中顯著抑制源自宮頸癌細胞系的異種移植瘤的生長，并顯著逆轉HPV16 轉基因小鼠的宮頸上皮惡性表型［45］。

除HPV 外，慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染則是肝細胞癌（HCC）最常見的危險因素。HBV表面抗原（HBsAg）高表達水平與肝癌發生和HBV 相關HCC 發展高度相關。研究人員設計了靶向HBV 基因組開放閱讀框preS1/preS2/S 的特異性單導RNA（sgRNAs），并使用CRISPR?Cas9 系統建立HBsAg 敲除HCC 細胞系。結果表明敲除HCC細胞系中的HBsAg 降低了HBsAg 的表達，并顯著減弱了HCC的體外增殖和體內致瘤性［46］。然而，盡管這一策略可有效控制和清除致癌病毒，但除了CRISPR?Cas9基因編輯技術的遞送載體限制外，病毒靶點的高度變異性也對這些治療方法提出了挑戰。

2.3 基因治療

在體外改造T 細胞療法之外，使用CRISPR 基因編輯直接靶向驅動癌癥的變異基因是一個吸引人但非常困難的挑戰。理論上，通過CRISPR 基因編輯直接糾正驅動癌癥的基因變異，或者殺死產生特定基因變異的癌細胞，可以達到抑制腫瘤生長的效果。然而，這一策略需要克服多重障礙，包括完成腫瘤特異性療法遞送，以及需要達到高效率的基因編輯。

目前的臨床前研究已經發現一些腫瘤特異性基因編輯的策略?；蚓€路是合成生物學中的重要部分，由各種調控元件（包括特異性的啟動子、增強子、邏輯門等元件）和被調控的基因組合而成的遺傳裝置，通過構建基因線路使細胞在特定情況下調節信號通路。目前常用的CRISPR 控制系統包括光學基因開關進行信號轉導調節轉基因活性［47］、基于蛋白質的信號傳感器［48］以及RNA 信號傳感器--核糖開關，由RNA 順式調節模塊組成，通過感測細胞內特定的小信號分子來操縱目標基因的表達。已經通過整合適體進行了廣泛的工程化，適體通過配體與適體結合時產生的變化觸發“開”或“關”信號。受核糖開關和反義RNA 調節裝置的啟發，在sgRNA 中引入核糖開關模塊，它的5'端也包含一個反義RNA 區域。整合核糖開關特性的sgRNA允許整個CRISPR系統獲得感知相關配體的能力，以調節CRISPR 系統的“開?關”。

Liu 等［49］創建了基于CRISPR?Cas9 的信號傳導體，以響應外部或內部感興趣的信號，調節內源性基因的轉錄。在缺乏特異性信號的情況下，原sgRNA 的引導區與設計的反義莖配對，不能與目標DNA 結合，一個特定的外源小分子或者內源蛋白質信號可以結合到適體，誘導構象改變，允許sgRNA 的間隔序列去結合對應的DNA 序列而影響另一個信號的轉錄。這些裝置可以用來構造所有基本類型的布爾邏輯門，在哺乳動物細胞中執行邏輯信號操作，而不需要多層的遺傳線路；還可以通過構建連接不同信號通路的合成鏈接來重新連接細胞信號。此外，這種方法可以通過控制同時的雙向（ON?OFF）基因轉錄來重定向致癌信號轉導，從而實現癌細胞命運的重編程。

Liu 等［50］將人端粒酶逆轉錄酶（hTERT）啟動子和人uroplakinⅡ基因的膀胱特異性啟動子（hUPⅡ）結合（圖2），該基因線路需要兩個啟動子，當且僅當兩個啟動子同時作用時，目的基因才能進行表達，為定向治療癌細胞提供了高效且具有針對性的方案。經過進一步優化，UPⅡ和TERT 啟動子被它們各自的轉錄因子結合元件所取代（圖3）。C?Myc 和Get1 僅在膀胱癌細胞中同時有較高水平的表達。在sgRNA1 和sgRNA2 的初始表達后，它們可以進一步結合各自轉錄起始點的上游，通過正反饋機制分別擴增c?Myc 和Get1 的轉錄信號，從而擴增其下游基因的轉錄，與傳統的基因線路相比，微基因線路顯示出更高的癌癥識別和干預能力，可用于一體化AAV 載體的體內癌癥基因治療［51］。

圖2 與門遺傳電路的設計與構建［50］（a）hUPⅡ和hTERT 啟動子是線路的輸入端。hUPⅡ啟動子驅動Cas9 mRNA 的轉錄，hTERT 啟動子連接靶向LacI 的sgRNA 的轉錄。輸出基因由LacI控制的CMV 啟動子驅動。效應子只有在Cas9蛋白和sgRNA 同時存在時才能表達。（b）～（e）是合成線路（SC?1，SC?2，SC?3和SC?4）的示意圖。輸出基因分別為hRluc、hBAX、p21和E-cadherinFig. 2 Design and construction of the AND gate genetic circuits[50](a) The hUPⅡ and hTERT promoters are the inputs to the circuit. The hUPⅡ promoter drives the transcription of Cas9 mRNA and the hTERT promoter is linked to the transcription of sgRNA targeting LacI. The output gene is driven by a LacI?controlled CMV promoter. The effector can be expressed only when both Cas9 protein and sgRNA are presented. (b)～(e) are schematic representations of the synthetic circuits (SC?1, SC?2, SC?3 and SC?4). The output genes were hRluc, hBAX, p21 and E-cadherin.

圖3 與門微型基因線路的設計與構建［51］UPⅡ啟動子驅動了Cas9 mRNA的轉錄，而TERT啟動子被用來促進以LacI為目標的sgRNA的轉錄。輸出的Renilla熒光素酶基因由LacI控制的CMV啟動子調節。僅在UPⅡ啟動子和TERT啟動子都被激活時，熒光素酶基因才被表達。在迷你基因線路的設計中，UPⅡ和hTERT啟動子被各自的轉錄因子結合元件所取代，c?Myc和Get1僅在膀胱癌細胞中同時有較高的表達水平。sgRNA1和sgRNA2初始表達后，進一步結合自身轉錄起始位點上游，通過正反饋機制擴增c?Myc和Get1的轉錄信號，分別擴增其下游基因的轉錄，此外，LacI基因被sgRNA2敲除，熒光素酶報告基因被轉錄激活。而在正常膀胱上皮細胞中，熒光素酶不能有效轉錄，并被背景水平表達的微量LacI進一步沉默Fig. 3 Design and construction of the AND gate minigene circuits[51]The UPⅡ promoter drove the transcription of Cas9 mRNA, while the hTERT promoter was used to promote the transcription of sgRNA targeting LacI. The output Renilla luciferase gene was regulated by a LacI?controlled CMV promoter. The luciferase was expressed only when both UPⅡpromoter and TERT promoter were both activated. In the design of the minigene circuit, the UPⅡ and hTERT promoters were replaced by their respective transcription factor binding elements. Both c?Myc and Get1, only in bladder cancer cells, had a relative high expression level at the same time. After initial expression of sgRNA1 and sgRNA2, they could further bind upstream of their own transcription initiation sites and then amplify the transcription signals of c?Myc and Get1 through the positive feedback mechanism to amplify their corresponding downstream genes transcription,respectively. Furthermore, the LacI gene was knocked out by sgRNA2, and luciferase reporter gene was activated by transcription. In normal bladder epithelial cells, luciferase could not be effectively transcribed and was further silenced by trace amounts of LacI expressed at the background level

目前，用于基因治療的CRISPR 技術大多基于產生DSB，誘導細胞DNA 修復途徑，從而導致靶位點序列的改變。而大多數疾病都是由點突變引起的。因此，有必要開發針對特定點突變位點的工具。目前，現有的單堿基編輯技術包括CBE 和ABE［52?55］，先導編輯可以通過編輯sgRNA 為pegRNA 并在DSB 引入模板來進行精確的基因編輯，包括長片段的替換、插入和刪除［56?57］，在遺傳疾病的研究和治療方面的應用非常廣泛［58］。

CRISPR?Cas9將有助于腫瘤細胞中新致癌基因的發現及驗證其在腫瘤發生和轉移中的關鍵作用，從而為腫瘤的治療提供新的靶點，為腫瘤基因治療提供了新思路?？偟膩碚f，基因治療仍處于臨床前探索階段，其安全性、持久性和有效性的衡量標準有待進一步加強和完善。目前的監管模式需要大量的研究來確定其安全性和有效性，這不適用于處理在單個患者或極少數患者中發現的突變。理想方法是創造一種單一的組合物，可以治療更多的患者群體。在不久的將來，在轉向個性化療法中，細胞和基因治療領域的創新將面臨獨特的挑戰。對核酸遞送、免疫系統調節和人類基因組的精確操縱也將達到前所未有的控制水平。與此同時，這種技術激發了全新的研究領域，如合成生物學、細胞重編程和高通量功能基因組學，這些領域無疑將繼續重塑生物醫學研究的面貌。

3 腫瘤疫苗

與靶向免疫檢查點的腫瘤免疫治療不同，腫瘤疫苗利用抗原?抗體反應［59］，主要分為預防性和治療性疫苗。預防性疫苗通過預防和殺死某些病毒或細菌感染來預防癌癥，而治療性疫苗通過癌細胞抗原激活機體的特定免疫功能來控制或殺死腫瘤細胞。細胞癌變后產生的腫瘤抗原可作為適應性免疫應答的靶點，這是制備腫瘤疫苗的基礎；此外，測序突變基因和獲得新抗原有助于制備個體化癌癥疫苗［60?61］。個體化癌癥疫苗Neo Vax 在黑色素瘤患者的臨床試驗中表現出了優異的效果，并產生了持久的免疫反應［62］。與免疫檢查點抑制劑或其他癌癥療法一起，這些個性化癌癥疫苗可能具有較高的臨床療效［63］。Ravindranathan 等［64］利用CRISPR?Cas9 技術篩選影響乳腺癌細胞免疫原性的細胞因子，增強自體腫瘤疫苗的有效性。Guo 等［65］發現STEAP1 在人鼠前列腺癌中均高表達，據此構建了一種融合蛋白疫苗，在體內抑制腫瘤生長，改善腫瘤微環境。當使用CRISPR?Cas9敲除抗原靶點時，對前列腺癌的免疫反應被大大抑制。

除此之外，利用CRISPR 改造免疫系統自身產生抗體的B細胞，以便在感染的情況下按要求大量表達針對這些難治性病毒的抗體。研究人員成功對人類和小鼠B細胞進行基因修飾來表達靶向致癌病毒，如呼吸道合胞病毒（RSV）、艾滋病毒（HIV）、流感病毒和Epstein?Barr 病毒（EBV），將編碼抗體的DNA 插入到原代人B 細胞的抗體編碼基因上產生的小切口中，使得新抗體蛋白的表達受到這些細胞自身啟動子的調節，從而允許這些細胞能夠像正常特異性免疫B細胞那樣在經受病毒抗原觸發后產生新抗體蛋白，Moffett等［66］證實這些經過基因改造的B 細胞在小鼠感染模型中阻止RSV 感染。將CRISPR 技術應用于腫瘤疫苗的開發，是一種全新的嘗試，同時，也為腫瘤疫苗的探索提供了更加廣闊的發展空間。

4 文庫篩選作用靶點

CRISPR 技術還可以加速癌癥治療靶點基因的發現，使用靶向基因組中不同基因的引導RNA 文庫，可以系統性地敲除細胞系或類器官中的任何基因，然后觀察基因敲除對癌細胞生長或藥物反應的影響，系統地研究癌癥的發生、發展和代謝依賴性，以確定潛在的治療途徑［67?68］。將特定抗癌藥物的藥敏與細胞系全基因組CRISPR 功能缺失篩查結合起來，研究支持藥物敏感性的細胞通路，這些蛋白?蛋白網絡的識別有助于藥物的開發［69?70］。根據腫瘤細胞的耐藥機制，已經發現了多種藥物組合［4，71?72］，如在轉移性前列腺癌（PC）中存在有害的共濟失調性毛細血管擴張突變（ataxia telangiectasia?mutated，ATM）缺陷時，PARP 抑制對該亞群具有抗腫瘤活性，但只有部分ATM 缺陷對PC 有反應。Neeb 等［72］利用CRISPR?Cas9 修飾體外細胞系模型來破壞ATM功能，并用于藥物敏感性和功能分析，然后在患者衍生模型中進行驗證，發現聚腺苷二磷酸核糖聚合酶PARP和ATR聯合抑制對上述模型具有良好的抗腫瘤活性。

Ouyang 等［73］利用CRISPR 敲除（GeCKO）文庫篩選了卵巢癌細胞系中與順鉑耐藥相關的新基因。研究中篩選了6個候選基因，包括一個先前驗證的基因SULF1和5 個新基因ZNF587B、TADA1、SEMA4G、POTEC和USP17L20。經驗證，發現兩個基因（ZNF587B和SULF1）與順鉑耐藥有關，其中ZNF587B可能是預測順鉑耐藥的一種新的生物標志物。

二甲雙胍是目前治療多種癌癥的強有力的候選抗腫瘤藥物，然而，其抗腫瘤效果在不同的癌癥或亞人群中存在差異，這可能是由于腫瘤的異質性。為了探究哪些肝細胞癌（HCC）患者亞群可以從二甲雙胍治療中獲益，Feng 等［74］通過全基因組CRISPR?Cas9 敲除篩選，發現DOCK1 水平可以決定二甲雙胍的抗腫瘤作用，DOCK1 是二甲雙胍在HCC 中的一個合成致死靶點。機制上，二甲雙胍促進DOCK1 磷酸化，DOCK1 磷酸化激活RAC1 促進細胞生存，導致二甲雙胍耐藥。DOCK1選擇性抑制劑TBOPP可增強二甲雙胍在肝癌細胞株和患者源性肝癌類器官中的體外抗腫瘤活性，以及在體內異種移植肝癌細胞和具有免疫能力的小鼠肝癌模型中的抗腫瘤活性，二甲雙胍可以改善DOCK1低水平HCC患者的總生存率，但對DOCK1 高表達的患者沒有改善作用。二甲雙胍的療效取決于DOCK1 水平，二甲雙胍聯合DOCK1 抑制可能為二甲雙胍耐藥提供一種有前途的個體化治療策略。

為了鑒定調控小鼠乳腺上皮細胞密度依賴性增殖的基因，研究人員建立了一種基于熒光泛素細胞周期標志物的熒光激活細胞分選方法，該方法以不同的熒光團標記細胞周期的不同階段。接著，Fomicheva 等［75］在4000 萬個上皮細胞中進行了CRISPR?Cas9 全基因組敲除篩選，并通過選擇那些在低密度下正常增殖但在高密度下繼續分裂的細胞，首次發現了TRAF3與癌癥的發生發展相關，TRAF3的缺失會激活增殖信號通路，進而推動細胞的分裂。

轉移是造成癌癥治療困難的主要因素之一，與癌癥預后不良有關。在最近的一項研究中，通過CRISPR 激活（CRISPRa）對編碼細胞表面蛋白的基因進行篩選，以識別增強癌細胞轉移能力的細胞表面分子，Van Der Weyden 等［76］發現，LRRN4CL基因的過度表達增加了小鼠和人類黑色素瘤細胞向肺部轉移的能力。他們還測試了結腸癌、乳腺癌和膀胱癌的細胞模型，并證實了在所有轉移至肺部的細胞中LRRN4CL的高表達。這是第一次發現LRRN4CL與癌癥有關。此外，研究結果表明，降低LRRN4CL的表達有助于防止轉移到肺部，從而使其成為潛在的藥物靶點。

利用CRISPR?Cas9 文庫對遺傳背景相同的一系列抑癌基因敲除細胞系進行全基因組功能篩選，發現并驗證對于抑癌基因缺失的細胞，雖然CRISPR 系統無法靶向該基因本身，但是抑制DNA 修復、核苷酸代謝相關基因，或旁系同源基因，或其他抑癌基因等能夠發揮抑制細胞生長的作用，這些基因可以作為臨床治療的潛在靶點［77］。CRISPR 技術可以篩選改善免疫細胞功能的靶點，從而改善免疫治療［10，78］。通過CRISPR在體內篩選，建立表觀遺傳轉錄網絡，篩選增強免疫治療的新靶點［79］。張鋒團隊［80］對人類黑色素瘤細胞逃避細胞毒性T 細胞殺傷的基因進行了全基因組規模的CRISPR 激活篩選，以此尋找癌細胞對細胞毒性T 細胞產生耐藥性的關鍵驅動因子。研究人員篩選鑒定了4 個候選基因：CD274（PD?L1）、MCL1、JUNB和B3GNT2，這些基因在上調后，可以使人類黑色素瘤細胞逃避T 細胞的殺傷，系統的功能獲得性篩查可以闡明耐藥途徑，并確定癌癥免疫治療的潛在靶點。CRISPR?Cas9 高通量篩選文庫在哺乳動物細胞中的應用無疑會為腫瘤等相關疾病機制的研究提供極大的幫助，可以預見，隨著相關基礎研究的深入，CRISPR?Cas9 系統將在腫瘤個體化治療方面得到更廣闊的發展與應用。

5 譜系追蹤

癌癥的一大特征是它的異質性，癌細胞不斷積累基因變異，導致產生具有不同特征的細胞克隆，追蹤癌細胞的譜系變化，理解腫瘤內部的異質性并且追蹤新克隆的產生和演化可以更全面地了解腫瘤發生?；贑as9 的單細胞RNA 測序細胞譜系追蹤的技術為大規模、高精度研究腫瘤進展提供了可行的方案，Cas9 切割特定的基因組位點，造成的穩定的插入/缺失等位基因突變可以被后代細胞繼承，隨著細胞分裂，它們在其他部位積累更多Cas9誘導的插入缺失突變（indel），從而進一步區分連續的細胞分支。在譜系追蹤實驗結束時，通過測序從單個細胞中收集indel 等位基因并與細胞狀態的單細胞表達譜配對。然后利用回溯性追蹤的計算方法重建系統發育樹，對測序得到的indel進行亞克隆細胞關系建模［81］。

Christopher課題組［82］開發了一個基于CRISPR?Cas9 的“譜系回溯記錄器”macsGESTALT，使用CRISPR?Cas9來誘變合成引入的DNA序列，作為細胞條形碼，然后將這些工程化的癌細胞注射到小鼠體內并使其轉移。當癌癥在宿主小鼠中發展和擴散時，細胞條形碼被CRISPR?Cas9 隨機“編輯”。因此，這種條碼編輯模式用于重建癌細胞的系統發育樹，可以動態追蹤體內癌細胞轉移過程，且成功鑒定出與癌細胞轉移相關的基因。研究者將macsGESTALT 應用于小鼠轉移性胰腺癌模型，通過分析38 萬個CRISPR 靶向部位信息來追蹤2.8萬個癌細胞的體內擴散情況，鑒定出一類具有上皮?間質轉化（epithelial?mesenchymal transition，EMT）特征的過渡態細胞。處于晚期混合EMT 狀態的癌細胞具有更強的轉移能力，在胰腺癌和肺癌患者中，這些晚期混合EMT 狀態的基因特征預示著較低的生存率。

基于CRISPR?Cas9 的譜系示蹤技術與scRNA?seq 結合，可以顯著提高追蹤的分辨率。Yang 團隊［83］使用基于CRISPR 的譜系追蹤方法，為每個細胞嵌入可遺傳和可進化的DNA 條形碼。他們對小鼠進行改造，當它們的肺細胞暴露于一種特制的病毒時，會激活Kras基因中的致癌突變，并使細胞中的腫瘤抑制基因Trp53失活，同時激活譜系追蹤，每次細胞分裂時條形碼都會被輕微修改。當研究人員最終收獲原始細胞的后代時，就可比較細胞的條形碼來重建每個細胞的“家譜”，就像相關物種的進化樹一樣。利用Cas9 編輯產生的indels 構建的譜系發育樹并結合單細胞測序獲得的轉錄組信息，文章揭示了癌細胞可塑性和腫瘤的平行進化路徑，確定了腫瘤轉移的亞克隆起源、空間位置和細胞狀態，發現稀有的腫瘤亞克隆通過采用獨特的適應度相關轉錄程序來驅動腫瘤擴張。除此之外，敲除肺腺癌中常見的抑癌因子LKB1和APC會引起腫瘤進化路徑的改變，使用RNA測序測量了細胞中的基因表達，以表征每個細胞的狀態。有了這些信息，研究人員就可以“拼湊”這種類型的肺癌如何變得具有侵襲性和轉移性。

CRISPR?Cas9系統產生的細胞條形碼與單細胞測序技術結合的譜系追蹤技術將會發展成為一種可綜合理解生物體各種組織和器官發育的平臺，從而加深我們對單細胞生長形成成年動物過程的理解，如果應用于疾病模型，它將為疾病如何出現發展提供新的見解。在癌癥之外，該方法也為系統發育的基礎研究提供了前所未有的分辨率和規模，大大增強了我們對于系統發生過程的理解。

6 技術挑戰

6.1 脫靶效應

CRISPR技術自誕生以來，一直存在兩大障礙阻礙其臨床應用，即高脫靶效應和低遞送效率。此前，已經開發出了多種Cas蛋白變體，包括：Cas9系統的dCas9［84］、SuperFi?Cas9［85］Cas9切口酶（nCas9）［86］、xCas9［87］，Cas12系統的Cas12f1［88］、hyperCas12a［89］，Cas13系統的hfCas13d［90］、Cas13X［91］等。研究人員已經在改進Cas 酶和引導RNA 設計方面取得了長足進步，大幅度提高了核酸酶的特異性，結合預測靶向結果的設計工具和對基因表達的時空調控為提高靶向效率提供了全面應對的策略［87，92?94］。CRISPR 單堿基編輯器也會導致許多不必要的和潛在危險的脫靶效應［95］?？梢圆扇∫韵虏呗越档兔摪行剩貉芯棵摪行獧C制，開發并合理利用預測脫靶效應的有效工具［85，96］；開發新的基因編輯系統［97］；利用高質量參考基因組設計靶標；靶向性強的基因編輯工具遞送系統［97］。

6.2 遞送效率

由于人類對Cas蛋白具有廣泛的免疫性，優化Cas 系統遞送策略變得更具挑戰性。CRISPR 系統以DNA 形式進行的遞送會長期表達，這可能導致脫靶效應和免疫反應的增加；由于mRNA 的穩定性較差，在傳遞過程中需要一種特殊的機制來保護其不被胞外核酸酶降解。為了最大限度地減少CRISPR?Cas 系統的脫靶效應，最有效的傳遞方法是直接引入Cas 蛋白及其特異性sgRNA，而不是在細胞內表達Cas9 蛋白和sgRNA 的pDNA 或mRNA［98?99］?；赗NP 的給藥方法顯示了細胞毒性和基因組重排效率之間的良好平衡［100］。解決這個問題的策略包括：利用較小的CRISPR 系統減輕遞送壓力，使用無細胞毒性的遞送載體，以及對特定細胞的定向運輸。例如可以在體內控制藥效和器官選擇性脂質iPhos［101］。張峰團隊［102］利用天然存在于人類的類似逆轉錄病毒的蛋白質PEG10，開發了一種新的RNA 遞送平臺，名為SEND，該蛋白經過工程改造后能與mRNA 結合，形成一個模塊化的遞送平臺，用于包裝和傳遞RNA。使用SEND，CRISPR?Cas9 系統成功地以mRNA 的形式傳遞到人類和小鼠細胞中，并編輯特定的基因。與其他載體相比，免疫反應低，安全性高。

分子量更小的遞送系統也被不斷發現，腺相關病毒（AAV）是目前極具潛力的臨床應用的基因治療載體，但其裝載量較小，無法容納多種傳統的CRISPR?Cas系統，需要使用雙AAV 進行遞送降低效率。Zhan 等［103］開發了CRISPReader，能夠閱讀基因簇的開放閱讀框架，而不需要傳統的調控元件或其他輔助因子。利用這一策略，通過從表達盒中去除啟動子類元件來構建一個一體化的AAV?CRISPR?Cas9 系統，以解決現有的AAV 包裝尺寸問題。以穩定的方式控制無啟動子基因表達的技術，緊湊的AAV?CRISPR?Cas 在轉錄激活、DNA 切割和基因編輯方面比編碼兩個獨立Cas9 元件的雙AAV 載體更有效。Zhan 等［104］將各種lncRNA 功能基元集成到僅70～80 kDa 的CRISPR?dCasΦ 系統中crRNA 的不同部分，開發了CRISPR信號導體2.0 版本。該系統可以通過招募細胞內源性轉錄因子直接調控靶基因的表達，有效地感知經典合成系統無法檢測到的各種蛋白質信號，解決了背景泄露和信號響應不靈敏的問題，并實現了多達6個輸入信號的邏輯門的構建，可用于特異性靶向癌細胞。最后通過重組內源性信號網絡進一步證明了該系統在體內癌癥基因治療中的有效性和生物安全性。

6.3 DNA損傷

CRISPR 系統可以激活p53，從而導致DNA 損傷［105?106］。在一項對小鼠和人類細胞的全面系統研究中，Kosicki等［107］發現，CRISPR?Cas9系統導致了廣泛的突變和基因重排，如大量細胞中DNA 的插入和缺失，這些變化可導致重要基因的開啟或關閉，從而導致致病后果。Xu 等［108］發現Cas9 蛋白及其各種突變可以直接與DNA 修復途徑中的關鍵因子KU86 結合，干擾DNA?PK 復合體的形成；這可以抑制非同源端連接（NHEJ）修復途徑介導的DNA 損傷修復，導致DNA 損傷和基因組不穩定。因此，在CRISPR?Cas9 系統臨床應用之前，還需要進一步的研究和特異性測試。此外，使用Cas 變體，如誘導單鏈斷裂（SSB）而不是DSB 的Cas9n 產生堿基編輯和先導編輯的發展，是CRISPR技術安全治療應用的一項關鍵創新。

6.4 細胞毒性

之前的研究表明，CRISPR?Cas9基因編輯可以導致p53激活，進而導致DNA 損傷，因此，基因編輯成功的細胞中p53有可能存在缺陷。這增加了患癌癥的風險，并可能在接受過這些基因編輯細胞治療的個體中引發癌癥［105?106］。隨后發現，CRISPR?Cas9編輯小鼠的受精卵中出現了頻繁和大量的堿基缺失［109?110］。Wagner 等［111］在研究中發現幾乎所有健康的人類受試者都擁有能對Cas蛋白產生反應的T 細胞，這可能是由于對Cas9 蛋白已有的免疫記憶，因為鏈球菌感染在人類中很常見，來自其他細菌的Cas 分子也會產生類似的免疫反應。此外，Cas9 特異性T 細胞可能會主動清除Cas9 修飾的細胞，導致治療失?。?12］。這些免疫細胞在基因治療過程中可能會產生不良的免疫反應，從而影響CRISPR 技術的安全性和有效性。這些研究表明，人體的免疫反應可以破壞基因治療，并對接受治療的患者的健康構成威脅。Leibowitz［113］報道了在CRISPR?Cas9 基因編輯過程中引入的DSB 可能導致染色體碎片化，這是一種具有高度破壞性的基因組重排形式，可能導致致癌融合蛋白的出現或特定基因表達的失調。對此，我們可以通過從一種從未感染過人類的細菌中尋找一種新的或者通過人工重新設計Cas蛋白酶，來避免免疫排斥反應。CRISPR?Cas 系統引發的一系列問題的發現，說明我們對其機制認識還不夠，需要對該技術的安全性評價保持謹慎。

7 總結及展望

在過去的十年里，CRISPR 技術從最初的基因敲除到模塊化工具的飛躍發展，如今在疾病治療和研究中發揮著重要作用，包括轉錄調控［114?115］、表觀遺傳修飾［116?117］、染色質成像［118?119］和堿基編輯［120］，關鍵的挑戰是將新技術應用于臨床治療。相信隨著安全有效的基因編輯工具的發展以及更完善的基因傳遞系統，未來CRISPR 技術將在疾病治療中得到更廣泛的應用。DNA 測序的發展及其大規模應用使人們認識到患者人群與普通人群之間的遺傳變異；此外，它加深了我們對遺傳變異（例如DNA突變）與疾病易感性、疾病發展和治療反應之間相關性的理解［70］。這些進步刺激了個性化或精準醫療的發展。CRISPR?Cas9系統也適用于大規模篩選，并已在各種環境中使用。在疾病模型構建、藥物開發、藥物靶點篩選、臨床前研究等方面均取得了良好的效果。CRISPR 基因編輯系統還可以作為自我調節開關，可以幫助科學家開發用于研究的基因工程細胞的新方法［121］。更小的Cas 蛋白的開發和應用，可以簡化基因傳遞過程，可以開發為基因調控和治療的多種基因工程工具［122］。

CRISPR?Cas9技術作為一種功能強大的編輯工具，具有巨大的治療潛力，已經在臨床中得到應用。接下來CRISPR 系統需要解決的關鍵挑戰包括：編輯準確性（即目標位點的特異性）和精度（即產生確切的所需編輯結果）；提高多基因調控效率；體外基因編輯的更廣泛的應用；體內基因編輯的安全性和遞送效率等。相信隨著安全措施的完善和個性化治療的發展，該技術在疾病治療中的大規模應用將很快成為可能。盡管臨床應用的路上仍具有一些挑戰，我們依然有理由認為基因編輯療法將預示著癌癥領域一個新的時代的到來。