血小板微核糖核酸-26a-5p結合臨床指標構建川崎病相關冠狀動脈損傷的風險預測模型

周媛媛 宋思瑞 陳麗琴 李 光 肖婷婷 黃 敏

川崎?。↘awasaki disease，KD）是好發于5歲及以下兒童的中小動脈血管炎性疾病，以抗生素治療無效的反復發熱為主要臨床表現，其他臨床特征包括球結膜充血、口唇潮紅、皮疹、手足硬腫脫屑和淋巴結腫大。盡管，KD的病程具有自限性，但其易侵犯冠狀動脈（簡稱冠脈）引起冠脈瘤、冠脈狹窄，甚至冠脈閉塞；此類冠狀動脈損傷（coronary artery lesion，CAL）可持續進展，增加患兒AMI、猝死的發生風險。KD已成為發達國家兒童獲得性心臟病的首要原因。早期給予靜脈注射免疫球蛋白（intravenous immunoglobulin，IVIG）聯合阿司匹林治療可使CAL的發生率顯著降低，但仍有3%～5%的KD患兒在接受標準化治療后仍會發生CAL[1］。因此，早期識別高CAL發生風險的KD患兒對于啟動其個體化替代治療，減輕其心血管受累程度具有重要意義。臨床研究顯示，血小板數量在KD病程中呈現動態變化，且可能與CAL嚴重程度相關。血小板內微核糖核酸（microRNA，miRNA，簡稱miR）豐富、易得，是反映機體血小板數量和狀態的良好生物標志物，但目前國內外針對血小板源性miRNA與KD相關CAL的關聯性研究較少。本研究通過對上海市兒童醫院（上海交通大學醫學院附屬兒童醫院）心內科收治的70例KD患兒的血小板相關參數、血小板miRNA表達水平和其他臨床資料進行回顧性分析，旨在了解影響KD相關CAL發生的風險因素，探討血小板源性miRNA聯合其他臨床指標用于預測CAL發生風險的潛在價值。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2018年2—11月在上海市兒童醫院心內科住院治療的70例急性期KD患兒的臨床資料和血小板源性miRNA表達水平，并根據心臟彩色多普勒超聲（簡稱心臟彩超）檢查獲得的冠脈Z值，將患兒分為CAL組（14例）和非冠脈損傷組（NCAL組，56例）。KD診斷標準參照2017年美國心臟協會（American Heart Association，AHA）發布的《川崎病診斷、治療及長期管理指南：美國心臟協會對醫療專業人員的科學聲明》[2］（簡稱新《聲明》）。排除標準：①復發病例；②已接受IVIG等KD相關治療；③發病前1個月內使用過糖皮質激素或其他免疫抑制劑。本研究通過醫院倫理委員會審核、批準（審批號：2017R034-E02），所有患兒家長均同意并簽署知情同意書。

1.2 CAL診斷標準 參照2017版AHA新《聲明》，依據Z值對CAL進行分類：①無病變，始終Z值＜2.0；②僅擴張，Z值2.0～＜2.5；③小型冠脈瘤，Z值2.5～＜5.0；④中型冠脈瘤，Z值5.0～＜10.0，或內徑絕對值＜8.0 mm；⑤巨大冠脈瘤，Z值≥10.0，或內徑絕對值≥8.0 mm。按上述標準將①分類的患兒納入NCAL組，②～⑤分類的患兒納入CAL組。

1.3 方法

1.3.1 觀察指標 收集KD患兒在IVIG治療前急性期的基本信息、癥狀和體征、實驗室檢查結果、心臟彩超檢查結果?；拘畔?、癥狀和體征分別包括：身高、體重、年齡、總發熱天數，以及皮疹、球結膜充血、口唇潮紅和楊梅舌、手足硬腫和指趾端膜狀脫屑、肛周潮紅和脫屑、頸部淋巴結腫大等KD特征性表現。實驗室檢查結果包括：血小板計數、血小板壓積（PCT）、血小板體積分布寬度（PDW）、平均血小板體積（MPV）、大型血小板比例、血小板-淋巴細胞比值（PLR）、平均血小板體積-淋巴細胞比值（MPVLR），以及ESR、氨基末端腦利尿鈉肽前體（NT-proBNP）、鐵蛋白（SF）、白細胞計數（WBC）、血紅蛋白（Hb）、總膽紅素（TBil）、總蛋白、白蛋白（Alb）、ALT、AST、血鈉（Na+）等。心臟彩超檢查結果包括：左冠脈主干（LMCA）、左前降支（LAD）、左回旋支（LCX）、右冠脈（RCA）內徑及其相應Z值。

1.3.2 血小板miRNA測定 EDTA抗凝管收集患兒外周靜脈血1.0 m L，4℃保存；120×g，4℃離心20 min后，取上層淡黃色液體（含血小板）轉移至1.5 m L離心管中，360×g，4℃離心20 min后，棄上清液，加入1 m L 1×PBS洗滌兩次。按照mirVanaTMmiRNA Isolation試劑盒（美國賽默飛世爾科技公司）說明書的內容提取血小板miRNA，應用Qubit2.0熒光針（Invitrogen，美國賽默飛世爾科技公司）和NanoDrop分光光度計（美國賽默飛世爾科技公司）測定提取的miRNA質量濃度和純度，合格的樣本使用miScriptⅡRT試劑盒（德國凱杰生物公司）進行反轉錄，反轉錄條件為40 ng血小板miRNA，37℃孵育1 h。應用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR）檢測miRNA相對定量，反應條件：95℃熱激活15 min；94℃變性15 s，62℃退火30 s，72℃延伸15 s，40個循環；95℃滅活15 s。以miR-126-3p為標準化基因，采用2-△△CT法計算相關血小板miRNA的相對表達量。

1.4 統計學處理 應用SPSS 26.0統計學軟件。呈正態分布的計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗；呈非正態分布的計量資料以中位數（M）和第25、75百分位數（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗。計數資料以頻數（n）和百分率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。將上述單因素分析中P＜0.2的變量納入多因素logistic回歸分析，探究CAL發生的風險因素，構建風險預測模型，并繪制ROC曲線評估模型預測效能。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般資料和臨床表現 70例患兒中男48例、女22例，45例（64.3%）患兒的臨床診斷為完全型川崎?。╟omplete KD，c KD），25例（35.7%）為不完全型川崎?。╥ncomplete KD，iKD）?；純喊l病年齡為（3.1±2.5）歲，入院時發熱天數為（5.1±3.1）d，中位住院時間為5 d，發熱持續時間為（6.3±2.0）d。除發熱外，常見的臨床表現依次為口唇潮紅和楊梅舌、球結膜充血、頸部淋巴結腫大、皮疹、手足硬腫和脫屑，以及肛周潮紅和脫屑?；純汗诿}病變發生率為20.0%（14／70），CAL組中i KD占比顯著高于c KD，NCAL組c KD占比顯著高于iKD（P值均＜0.05）；但兩組間各類型KD占比的差異無統計學意義（P＞0.05）。CAL與NCAL組間的性別構成、年齡、體重、發熱持續時間和除頸部淋巴結腫大以外的特征性臨床表現占比的差異均無統計學意義（P值均＞0.05），CAL組身高顯著低于NCAL組（P＝0.010）。見表1。

表1 KD患兒的一般資料和臨床表現

2.2 血小板相關參數和其他指標的單因素分析CAL組PLR值有低于NCAL組的趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05，但＜0.2）。兩組間血小板計數、PCT、PDW、MPV、大型血小板比例、MPVLR的差異均無統計學意義（P值均＞0.2）。見表2。

表2 血小板相關參數的單因素分析

CAL組ESR值和總蛋白值有低于NCAL組的趨勢，但差異均無統計學意義（P值均＞0.05，但均＜0.2）。兩組間SF、WBC、Hb、TBil、ALT、AST、TP、Alb、Na+在的差異均無統計學意義（P值均＞0.2）。見表3。

2.3 血小板miRNA分析 對本課題組前期研究[3］報道的在KD發熱與非KD發熱患兒中差異表達的血小板miRNA進行分析，包括miR-26a-5p、miR-27a-3p、miR-15a-5p、miR-30c-5p和miR-941等，并比較NCAL與CAL組間上述血小板miRNA相對表達量的差異，結果顯示CAL組miR-26a-5p的相對表達量為3.000±0.768，顯著高于NCAL組的2.500±0.808（t＝-2.120，P＝0.038）。

2.4 多因素logistic回歸分析影響CAL的風險因素 將上述單因素分析中P＜0.2的指標，即ESR、總蛋白、PLR和miR-26a-5p，以及研究[4］顯示的KD患兒冠脈病變發生的風險因素TBil共同納入多因素logistic回歸分析，結果顯示ESR、總蛋白、miR-26a-5p和TBil是影響患兒CAL發生的風險因素（P值均＜0.05）。見表4。

表4 多因素logistic回歸分析影響CAL的風險因素

2.5 預測模型構建 進一步構建CAL風險預測模型，設x1＝miR-26a-5p，x2＝ESR，x3＝總蛋白，x4＝TBil，獲得回歸方程Logit（P）＝6.160+1.690×x1-0.320×x2-0.169×x3+0.085×x4，經Hosmer-Lemeshow檢驗差異無統計學意義（P＝0.179），提示擬合方程與真實方程無偏差。以上述模型的預測概率為變量繪制ROC曲線，結果顯示，ROC的AUC為0.856（95%CI為0.703～1.000），以預測概率0.365作為截斷值時，模型的約登指數最高為0.707，預測靈敏度和特異度分別為0.727和0.980。故預測概率≥0.365時提示發生CAL，＜0.365時提示未發生CAL。見圖1。

圖1 KD相關CAL風險預測模型的ROC曲線

3 討 論

KD發病率在全球范圍呈上升態勢。據統計，2013—2017年，上海地區5歲及以下兒童的KD發病率為68.8／10萬人～107.3／10萬人，男女比例1.7∶1.0[5］。盡管，經過50余年的探索，臨床上仍存在KD誤診率、漏診率較高，IVIG治療無反應等問題，診治延誤和個體差異致使部分患兒發生冠脈擴張或動脈瘤。對高風險CAL患兒啟動早期預警，適時調整治療策略，或可降低其CAL發生率，改善預后。Harada評分和Kobayashi評分是經典的CAL風險評估方法[6-7］，但其應用于不同遺傳背景人群時，特異度和靈敏度具有較大差異，并且數量多而特異性欠佳的指標堆疊削弱了其臨床實用性。隨著各種族、各地區KD發病率的逐漸增高，越來越多的患兒將面臨KD所致的終身心血管疾病負擔，臨床上迫切需要更加穩定、易行，且具有普適性的CAL風險預測方法。

傳統觀點認為，血小板僅參與原發性止血過程，內皮損傷后膠原暴露使血小板聚集活化，形成血栓協助止血，并促進凝血過程。近期研究顯示，血小板在固有免疫和適應性免疫應答中同樣發揮了重要作用，其遷移、黏附及活化產物可作為始動環節調節免疫細胞功能，促進炎癥級聯反應。血小板異常激活已被證明與多種心血管系統疾病的發生相關，包括冠心病、心房顫動、高血壓和心力衰竭等[8-10］。眾所周知，KD急性期及恢復期持續應用阿司匹林行抗血小板治療可有效減少KD相關的近期或遠期心血管不良事件的發生。其原因為KD患兒體內存在較強的血小板異?；罨瘷C制，這種異?；罨诨純杭膊』謴推谘“逵嫈祷謴椭琳：笕钥沙掷m存在；同時，嚴重的血管內皮炎癥性損傷誘導血小板持續活化，其產物進一步介導炎癥信號放大，促進炎癥細胞黏附，誘導血栓形成和心肌纖維化，調控血管生成和再生，多途徑參與血管損傷，最終導致冠脈擴張、狹窄乃至閉塞，提示血小板異常是KD相關CAL發生的重要信號。然而，學者對血小板計數的變化與CAL發生風險相關性的研究結果存在爭議[11-12］。在本研究中，IVIG治療前血小板相關參數血小板計數、PDW、PCT、MPV、PLR和MPVLR在CAL與NCAL組患兒間的差異均無統計學意義。這可能是由于在KD急性期，血小板活化和功能異常尚處于啟動階段，其變化程度不足以通過臨床上常用的檢驗項目獲取，已知KD血小板計數明顯增多通常出現在病程的2～3周，這與本研究結果相符。由于直接檢測血小板活性的方法耗時且昂貴，而血常規中血小板相關參數出現異常的時間在KD病程中存在滯后性，因此在臨床場景下，應用臨床常見的血小板相關參數早期預警KD相關CAL發生風險的價值有限，這些指標的動態監測更適用于指導KD恢復期抗血小板藥物的使用時間和劑量。

miRNA是一種長約22 nt的短鏈非編碼RNA，廣泛分布于各種體液、細胞及細胞外囊泡中，參與轉錄后水平的基因表達調控。自2013年，Shimizu等[13］率先應用小RNA測序技術報道了KD急性期和恢復期全血中存在異常miRNA表達變化后；已有多項研究[14-20］結果顯示，KD患兒體內多種表達失調的miRNA參與了免疫細胞異常、炎癥細胞黏附和炎癥因子釋放等環節，且在血管內皮細胞凋亡、內皮-間充質轉化、血管平滑肌去分化、細胞外基質降解等血管壁成分失調過程中發揮作用，與CAL的發生密切相關。miRNA以其普遍易得、非侵入性的優勢，在腫瘤疾病、神經系統疾病、心血管系統疾病等多個領域的早期篩查診斷和疾病監測中展現出了潛在價值。血小板中同樣有著豐富的miRNA表達，但其在KD相關CAL中的作用機制和應用價值尚不明確，目前關注較多的為血小板來源的miR-223。有研究[19，21］顯示，KD急性期血小板可分泌miR-223，通過某種跨細胞轉移方式進入血管內皮細胞或血管平滑肌細胞（vascular smooth muscle cell，VSMC），發揮促進凋亡或緩解去分化等作用。本課題組的前期研究[3］發現并證實，血小板來源的miR-27a-3p、miR-30c-5p、miR-941、miR-15a-5p和miR-26a-5p等在KD發熱組與非KD發熱組間的差異有統計學意義。本研究基于Z值將患兒分為CAL和NCAL組，并對上述KD特異性miRNAs相對表達量進行回顧性分析，首次發現了血小板來源miR-26a-5p在CAL與NCAL組間表達的差異，其聯合ESR、總蛋白和TBil預測CAL具有較高的效能（AUC＝0.856，95%CI為0.703～1.000）。有研究[22-23］顯示，miR-26a-5p參與了血管重塑、心肌纖維化、心肌梗死等過程。miR-26a是VSMC生物學功能的關鍵調節因子，可能通過下調VSMC內SMAD信號轉導調控TGF-β通路，促進細胞周期改變和遷移，并抑制凋亡和分化[24］，而冠脈內持續去分化狀態的VSMC呈同心圓排列可引起管壁增厚和管腔狹窄，與KD相關CAL的發生有關。miR-26a還可通過直接靶向和調節軸索過度生長因子B受體（NgBR）表達進而改變內皮一氧化氮合酶（eNOS）活性，在血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）介導的血管生成中起重要作用[25］。KD患兒血小板miR-26a-5p或可通過上述通路參與CAL的發生。未來需進一步探索血小板miR-26a-5p的靶基因，尋找與KD相關CAL表型的上下游關系，或可發現CAL高風險人群早期預防的作用靶點。

對于KD并發CAL的風險因素的分析顯示，男性、年齡、NT-proBNP、白蛋白、IVIG應用時間，以及低鈉血癥、貧血和肝酶水平異常等均是CAL發生的風險因素[6，26-27］。但本研究并未觀察到CAL與NCAL組間上述部分指標的顯著性差異，樣本量的限制可能是最主要的原因。同時，上述指標與CAL并非特異性相關，易受患兒長期營養狀態、基礎疾病和睡眠等因素的影響，理論上并不是預測CAL的優選指標。血小板異常作為CAL發生的重要病理生理基礎，血小板相關參數的變化與CAL發生具有直接相關性，能更加精準地反映和預測患兒冠脈局部發生病變的進程與風險，故血小板來源miR-26a-5p彌補了現有血小板相關參數預測CAL的滯后性，有利于將CAL診治關口前移。

綜上所述，血小板miR-26a-5p、ESR、總蛋白和TBil是KD相關CAL發生的風險因素，聯合miR-26a-5p與上述3種臨床指標構建的CAL風險預測模型具有良好的預測效能。然而，本研究是基于單中心的回顧性研究，在資料采集過程中難免產生偏倚，隨訪信息缺乏可能導致部分遲發CAL患者的樣本遺漏，并且小樣本量限制了模型的預測價值，可能掩蓋了某些重要因素的真實差異；同時，KD相關的CAL病例在臨床相對少見，且一段時間內新型冠狀病毒感染的大流行影響了本研究樣本的收集。故相關預測模型的優化和效能的驗證仍有待在后續多中心、大樣本量的臨床研究中進一步開展。