轉錄組數據分析揭示非洲豬瘟病毒感染后的宿主免疫應答機制及關鍵效應因子

陳濤，茍士學，鄭偉，金銀戈，蔣美玲，羅賢，周小青*

（1.五邑大學 生物科技與大健康學院，廣東江門 529020；2.中國科學院 廣州生物醫藥與健康研究院，廣東廣州 510530）

非洲豬瘟（African Swine Fever，ASF）是一種高傳染性出血性疾病，主要感染對象是家豬和野豬。豬感染ASF 后的臨床癥狀表現不盡相同，從死亡率100%的急性癥狀到慢性甚至無癥狀均有[1]。非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus，ASFV）是一種具有包膜的大型DNA 病毒，是非洲豬瘟病毒科非洲豬瘟病毒屬的唯一成員。ASFV 基因組信息量巨大，具有顆粒結構復雜、免疫逃逸手段多樣高效、定期重組自身基因組等特點，這些都給疫苗的研制造成了很大困難[2]。迄今為止，人們還沒有研發出可用于預防或治療非洲豬瘟的有效疫苗和抗病毒藥物，因此對ASFV 的傳染機制和致病機制進行深度探索具有十分重要的意義[3]。本研究利用生物信息學方法，對非洲豬瘟感染樣本的轉錄組數據進行分析，旨在探究與非洲豬瘟感染機制和致病機制相關的關鍵基因，為ASFV 的疫苗和藥物開發提供新的候選靶點。

1 材料與方法

1.1 數據來源

基因表達綜合（Gene Expression Omnibus，GEO）公共數據庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）收錄了全世界大部分的表達譜數據及高通量測序數據。本研究通過篩選下載了GSE132905（GPL26793）的轉錄組數據，該數據包含感染ASFV 后3 h、6 h、9 h、12 h、15 h、18 h 的6 個時間點的轉錄組數據，每個時間點有3 個重復。

1.2 主成分分析

本研究利用主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）對各時間樣本之間的情況進行分析。PCA 是一種常用的多元數據分析方法，在生物信息學領域中被廣泛應用。它可以將高維數據映射到低維空間，并保留數據的主要特征。這種方法可以用于尋找數據的主要變化模式，幫助研究人員更好地理解數據。

1.3 差異基因

針對GSE132905 數據，首先根據GPL26793 平臺提供的注釋文件，將探針ID 轉換為對應的基因ID，并根據數據集中提供的差異倍數值|log FC|＞1 作為條件篩選差異基因。

1.4 聚類分析

本研究所選擇的數據集中的所有樣本都是以不同時間點為實驗條件進行測序的，所以可以選擇采用基于時間變量的聚類分析模塊DEG-Patttern 分析方法進行差異基因的分析，該分析是使用DEGreport包中的degPatterns 函數區分差異基因的不同表達模式。

1.5 功能富集分析

為了描述感興趣基因列表的分子功能或通路，使用gprofiler2 進行功能富集分析。gprofiler2 是一個生物信息學工具包，用于對基因和蛋白質序列進行功能和富集分析，它可以幫助研究人員在大規?；虮磉_數據中尋找生物學過程、代謝途徑、信號通路等方面的富集。

1.6 PPI 互作網絡分析

為了探究關鍵基因潛在的相互作用，對各時間點的差異基因取交集，并將交集基因上傳到STRING 數據庫（https://cn.string-db.org/）構建蛋白質互作網絡（PPI）的可視化結果。

2 結果與分析

2.1 差異分析

對數據集中的各樣本進行主成分分析（PCA），結果表明感染初期的樣本較集中，感染后期的樣本聚類較集中，反映出實驗樣本具有可靠性（圖1）。根據|log FC|＞1 的條件篩選得到918 個差異基因，并以柱狀圖的形式展示各時間點的差異基因數量，發現差異基因主要集中在感染后期，說明感染的時間越長，樣本之間的差異越大，差異基因的數量越多（圖2）。

圖1 主成分分析圖

圖2 差異基因柱狀圖

2.2 聚類和富集分析

對篩選得到的差異基因，使用DEGreport包（https://rdrr.io/github/lpantano/DEGreport/man/degPatterns.html）的degPatterns 函數進行DEG-Pattern 聚類分析，聚類結果顯示聚類4 的535 個基因和聚類2 的258 個基因表達分為兩個趨勢：一種是隨著感染時間的增加，基因的表達逐漸下調；另一種是隨著時間的增加，基因的表達逐漸上調，說明該部分的基因具有研究意義（圖3、圖4）。然后利用gprofiler 包[4]中的gost 函數對聚類中的差異基因進行富集分析，富集分析結果發現聚類4 的基因主要與抗病毒反應和免疫反應等通路相關，符合在感染初期由于病毒的入侵迅速激起免疫反應，而隨著感染時間的增加，病毒會對免疫系統產生影響從而降低基因的表達。聚類2 的基因主要與免疫細胞的增殖相關，猜測是由于隨著感染時間的增加，體內病毒載量增加，生物體會促進免疫細胞的增殖（圖5、圖6）。

圖3 DEG-Pattern 聚類2 結果圖

圖4 DEG-Pattern 聚類4 結果圖

圖5 DEG-Pattern 聚類2 富集分析圖

圖6 DEG-Pattern 聚類4 富集分析圖

2.3 關鍵基因篩選

對各時間點的差異基因取交集，共獲得12 個關鍵基因，表明這些基因參與病毒入侵的全程，對于病毒入侵機制的研究具有一定的意義。用柱狀圖對這些基因在各時間的表達進行展示，發現基因的表達與聚類的結果一致。UBE2L6、ISG15、ISG20、HERC6基因的表達在感染初期逐漸升高，隨后保持不變；APOL3、IL1RN、DOX58、IFIT1、IFIT2、RSAD2、RHPN2、CXCL10 基因的表達在感染的初期高表達，隨著感染時間的增加表達逐漸降低，猜測這部分基因可能在感染初期產生反應，基因的表達快速升高，隨著感染時間的增加，病毒對免疫系統產生影響，導致基因的表達下調（圖7）。

圖7 關鍵基因在各實驗組的表達圖

2.4 關鍵基因鑒定

利用STRING 蛋白互作網絡在線數據庫（https://cn.string-db.org/）分析篩選得到的12 個關鍵基因潛在的相互作用。蛋白質互作網絡圖（圖8）結果表明，在12 個關鍵基因中有9 個關鍵基因存在相互作用，這9個基因分別是IFIT1、IFIT2、ISG15、ISG20、CXCL10、DDX58、HERC6、UBE2L6、IRG6（RSAD2）。查閱NCBI 數據庫發現，這9 個基因的表達主要與細胞的抗病毒作用和先天免疫反應及免疫細胞的增殖相關：IFIT1、IFIT2 是編碼干擾素誘導的四肽重復蛋白；ISG15、ISG20 是干擾素刺激基因，與免疫系統的信號通路相關；HERC6、UBE2L6 是泛素酶，與免疫蛋白的合成相關；CXCL10 是編碼趨化因子，與NK細胞、T 細胞的遷移相關；DDX58 可編碼RNA 受體RIG-I，與先天免疫系統和干擾素的產生相關；IRG6（RSAD2）可編碼抗病毒蛋白，能夠在細胞抗病毒反應和先天免疫中發揮作用。

圖8 關鍵基因蛋白互作網絡分析圖

3 討論

綜合當前的研究發現，干擾素相關基因在宿主抵抗病毒時發揮著至關重要的作用[3,5]。HEIDEGGER 等[6]揭示了DDX58 編碼的RNA 受體RIG-I 蛋白能夠誘導促炎性細胞因子和IFN-I 產生；PICHLMAIR 等[7]發現IFIT 家族蛋白能夠調節轉錄起始、細胞增殖與細胞遷移等多種生命活動；BOGUNOVIC 等[8]發現干擾素刺激基因ISG15、ISG20 能夠刺激T 淋巴細胞與NK 細胞釋放IFN-γ，在抵抗病毒、細菌等先天免疫和適應性免疫中發揮重要作用；FREITAS 等[9]發現病毒在復制的過程需要泛素結合酶E2 等多種酶的參與；GAO 等[10]證實UBE2L6 可能被干擾素上調，從而產生抗病毒作用。

本研究對公用數據庫的數據進行挖掘，首先對數據進行主成分分析，發現感染后不同時間的樣本聚類明顯，反映了轉錄組數據的可靠性。使用差異分析和DEG-Pattern 聚類分析相結合，共篩選出918 差異基因，對這些差異基因進行聚類分析，發現第一部分差異基因在剛感染時表達量增加，隨著感染時間的增加表達量呈現逐漸減少的趨勢，第二部分差異基因在感染后表達量呈現逐漸增加的趨勢。對這兩部分的差異基因進行富集分析，結果表明第一部分的差異基因主要與細胞的抗病毒反應及免疫反應等通路有關，第二部分的差異基因主要與免疫細胞的增殖通路有關。對不同時間點的差異基因取交集，得到了12 個關鍵基因。將這些基因上傳到STRING 蛋白互作網絡在線數據庫進行分析，蛋白互作網絡分析結果顯示有9個基因存在相互作用，并通過檢索NCBI 數據庫發現這9 個基因大多數都參與干擾素的生成、泛素酶的合成、先天免疫反應、抗病毒機制、病毒的復制、免疫細胞的增殖等。這些基因的異常表達很可能是由于非洲豬瘟病毒的入侵對其產生了干預。筆者篩選出來的多個表達異常的基因，如DDX58、IFIT1、IFIT2、ISG15、ISG20 和UBE2L6 等，已經在非洲豬瘟相關文獻有過類似報道[9]，說明這些基因是研究非洲豬瘟感染機制和致病機制的潛在靶點基因。

綜上所述，通過生物信息學分析和蛋白互作數據庫篩選，可鑒定出有助于揭示ASFV 潛在感染機制和致病機制的關鍵基因，為ASFV 的疫苗和藥物開發提供新的候選靶點。雖然本研究得到的關鍵基因需要進一步通過實驗進行驗證，但基于數據庫進行的生物信息學的數據挖掘還是提供了可靠的方法，縮小了對于關鍵基因的篩選范圍，節省了大量的資源成本和人力成本。