Vero 細胞生長過程中葡萄糖消耗量與細胞數量關系的研究

簡偉，劉永連，張瑞，郭林，肖海峰，李國順

（北京民海生物科技有限公司/北京市新型聯合疫苗工程技術研究中心，北京 102600）

貼壁細胞培養的放大方式包括從方瓶或平皿放大至轉瓶、多層方瓶或細胞工廠，這些培養方式均為低密度細胞培養，放大能力只能依靠增加培養單元的數量來提高[1-2]。因此，無論是貼壁培養工藝還是懸浮培養工藝，生物反應器工藝是大規模培養細胞和病毒最適合的選擇[3]。固定床生物反應器片狀載體工藝在病毒性疫苗領域已得到廣泛應用，具有剪切力低、換液快、可大規模連續灌流培養等優勢[4]。但由于不能實時取樣難以對細胞進行消化計數，從而難以準確檢測細胞密度、判斷細胞生長速度，對于需嚴格按病毒感染復數（MOI）接毒的病毒培養工藝也造成一定的困擾[5]。本實驗建立了一種簡單快捷應用于固定床生物反應器（片狀載體）的細胞計數方法，為片狀載體細胞培養工藝的細胞計數提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞

Vero 細胞142 代，由北京民海生物科技有限公司研發中心保存。

1.2 試劑及耗材

Gibco OptiPRO SFM 培養基、基因重組胰酶，美國Thermo Fisher Scientific 公司；Cedex Bio 配套葡萄糖檢測試劑盒，瑞士Hoffmann-La Roche 公司；片狀載體，上海楚鯤生物科技有限公司。

75 cm2細胞培養瓶（T75）、225 cm2細胞培養瓶（T225）、2 層細胞工廠（CF2）、10 層細胞工廠（CF10），丹麥Corning 公司。

1.3 設備

MCO-20AIC 型二氧化碳培養箱，日本Panasonic公司；CKX53 型倒置顯微鏡，日本OLYMPUS 公司；IC1000 型細胞計數儀，上海睿鈺生物科技有限公司；Cedex Bio 型生化分析儀，瑞士Hoffmann-La Roche 公司；Cellipower 09-5L 型生物反應器，上海戈洛思生物科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 細胞復蘇和傳代

（1）復蘇。取1 支Vero 細胞（代次142），在（39±1）℃水浴快速化凍后接入T75 細胞培養瓶中，緩慢補加細胞培養液至30 mL，置于37.0 ℃、5% CO2的培養箱內培養3 d。

（2）傳代。將1 個T75 按照1 ∶6 的傳代比例，傳2 個T225，置于37.0 ℃、5% CO2的培養箱內培養3 d，此時的細胞代次為144。取1 個144 代的T225按照1 ∶6 的傳代比例，傳6 個T225，置于37.0 ℃、5% CO2的培養箱內培養3 d，此時的細胞代次為145。取1 個145 代的T225 按照1 ∶6 的傳代比例，傳1 個CF2，置于37.0 ℃、5% CO2的培養箱內培養3 d，此時的細胞代次為146。

（3）傳代比例控制。取146 代細胞消化后的細胞懸液，按照1 ∶4（7.5×104個/cm2）、1 ∶6（5×104個/cm2）、1 ∶8（3.75×104個/cm2）的接種密度接種至T75 細胞培養瓶，每個密度接種16 瓶，置于5% CO2培養箱內（37±1）℃進行培養。

1.4.2 葡萄糖含量檢測及細胞計數

分別于24 h、48 h、72 h、96 h 和120 h 取3 瓶不同傳代比例細胞的上清液檢測葡萄糖含量，并消化細胞，取20 μL 細胞懸液用細胞計數儀計數，記錄培養上清液葡萄糖含量和細胞密度。

1.4.3 統計方法

以培養時間為X 軸，細胞數量為Y 軸，繪制不同傳代比例的細胞生長曲線。使用Excel 2010 軟件，以葡萄糖累計消耗量為X 軸，以細胞數量為Y 軸作散點圖，添加線性趨勢線，得到葡萄糖消耗與細胞數量關系方程。

1.4.4 葡萄糖消耗和細胞數量關系在生物反應器上的應用

從反應器中每天取培養上清液，用生化分析儀檢測其葡萄糖含量，再結合灌流量、上一次測得的培養上清液的葡萄糖含量，按照公式（1）計算出葡萄糖消耗量，將累計消耗的葡萄糖量代入葡萄糖消耗量與細胞數量關系方程，即可得到反應器內細胞總量。以培養時間為X軸，反應器內細胞總數為Y軸作生長曲線，分析Vero 細胞的生長規律。

其中，M為葡萄糖消耗量，M1為上次取樣測得的葡萄糖濃度，M2為灌流培養液葡萄糖濃度，M3為本次取樣測得的葡萄糖濃度，V1為生物反應器培養體積，V2為灌流體積。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖消耗與細胞數量關系的確定

不同傳代比例的細胞生長曲線見圖1。從生長曲線上看，3 種傳代比例細胞均呈現S 型的生長趨勢，延遲期、對數生長期和平臺期初期時間基本一致，所選傳代比例對細胞生長影響不大。

圖1 Vero 細胞生長曲線

設置截距為0，1 ∶4、1 ∶6 和1 ∶8 傳代比例的葡萄糖消耗量與細胞數量的線性方程分別如圖2 所示，R2分別為0.966 1、0.983 3、0.969 1。葡萄糖消耗量與細胞數量基本呈線性關系，且呈現傳代比例越小斜率越大的規律；取3 個斜率的平均值4.107×108作為葡萄糖消耗量與細胞數量線性方程的系數，即每消耗1 g 葡萄糖對應的細胞收獲量為4.107×108個，與文獻[6]報道的每消耗1 g 葡萄糖對應5.345×108個細胞非常接近。

圖2 葡萄糖消耗量與細胞數量關系

2.2 葡萄糖消耗量與細胞數量關系在反應器上的應用

Vero 細胞進行反應器培養，從圖3 所示的生長曲線可以發現，0 ～2 d 細胞生長緩慢，為停滯期；2 ～6 d 細胞進入對數生長期，葡萄糖消耗量不斷增加；5 ～6 d 達到最高峰，而后處于平臺期。

圖3 生物反應器內Vero 細胞生長曲線

3 結論與討論

片狀載體和微載體細胞培養是最主流的貼壁細胞培養工藝，而片狀載體相對于微載體培養，具有可以得到更高的細胞收獲量、灌流速度和換液操作可在很短的時間內完成、不會對細胞造成影響等優點，被廣泛應用于病毒疫苗生產領域[7]。如楊屹等[8]應用片狀載體生產的Vero 細胞密度高達1.0×107個/mL，收獲的病毒液毒力達7.5×106～3.4×108FFU/mL；劉巖松等[9]使用籃式生物反應器制備森林腦炎滅活疫苗（Vero 細胞），獲得細胞密度1.04×107個/mL，病毒收獲液平均滴度8.4 lg LD50/mL。

但片狀載體工藝存在無法將載體取出進行計數的缺點[7]，對于片狀載體細胞計數方法的文獻報道較少。周蕾等[6]使用培養瓶培養的細胞，先建立Vero細胞濃度與電容的線性關系，然后檢測生物反應器內電容，通過電容值和線性方程算出細胞密度?；诖?，本文建立了葡萄糖消耗量與Vero 細胞數量的計算方法，即每消耗1 g 葡萄糖對應的細胞數量為4.107×108個，在Cellipower 09-5L 反應器內細胞生長6 d 累計消耗葡萄糖71.28 g，所獲得細胞數量為2.93×1010個，為生物反應器片狀載體細胞培養工藝細胞計數提供了一種方法。