PAN 微塑料脅迫下胞外聚合物對小球藻生長及光合特性的影響

蘇芳，蘇明德

（1.近海流域緩解測控治理福建省高校重點實驗室，福建福清 350300；2.福建技術師范學院 海洋學院，福建福清 350300；3.宸鴻科技（廈門）有限公司，福建廈門 361000）

近年來，微塑料污染作為一種新興有機污染物備受環保領域研究者的關注[1]。微藻作為水體中的初級生產者，是食物鏈的基礎環節，對水體的生產力與自凈能力有很大的影響，是重要的水體污染的指示生物[2]。目前研究主要集中在微塑料對微藻的毒性效應方面[3]，關于微藻響應微塑料脅迫過程中的自我保護機制的研究較少。已有的報道稱藻細胞能通過藻-微塑料的異聚集作用來抵御脅迫，恢復種群生長[4]。這提示，在微藻的細胞外有能與微塑料結合的物質或者位點。

細胞外聚合物（EPS）是微生物和藻類分泌的復雜高分子聚合物，主要由蛋白質和多糖組成，具有羧基、磷酸基、羥基、硫酸鹽、氨基和疏水鏈等多種官能團[5]，是污染物接觸細胞的第一道屏障，能在一定程度上抑制重金屬、納米金屬顆粒等常規污染物的毒性效應[5]。但在微塑料的脅迫下，EPS 是否能參與藻類的抗逆境脅迫，以及它是如何起抗逆境的作用機制還不明確，亟待開展相應的研究。本實驗通過研究微塑料脅迫下，EPS 有無對藻類的生長及光合生理的影響來探尋藻類的抗逆生理機制，可為藻類的胞外聚合物的抗逆境脅迫、抵御污染機制研究提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

DM500 型三目生物顯微鏡，德國徠卡公司；UV-2600 型紫外分光光度計，島津儀器（蘇州）有限公司；TGL-16M 型臺式高速冷凍離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；HANDYPEA 型植物效率分析儀，英國漢莎科學儀器有限公司。

培養基和色素提取所用試劑均為分析純，除VB1、VB12購自福晨（天津）化學試劑有限公司外，其余試劑均購自國藥集團化學試劑有限公司。海水小球藻（Chlorella vulgaris）由福建技術師范學院近海流域環境測控治理福建省高校重點實驗室微藻庫提供。聚丙烯腈聚合物微塑料（PAN-MPS），粒徑為0.05 ～0.20 μm，由福建師范大學聚合物資源綠色循環利用教育部工程研究中心提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養條件

使用L1 培養基培養小球藻，溫度（25±0.5）℃，光照強度為4 000 lx，光暗比為12 h ∶12 h[6]。

1.2.2 試驗設計

（1）EPS 去除組。采用高速離心法提取小球藻的EPS。將培養至指數生長后期藻液，在4 ℃、4 000 r/min條件下離心15 min 后取出，棄上清液后用0.6% NaCl重懸，再在4 ℃、10 000 r/min下離心15 min后棄上清液，剩余藻細胞即為無胞外聚合物的藻細胞（EPS-F）。

（2）EPS 保留組。取同批次藻細胞在4 ℃、4 000 r/min 條件下離心10 min 后棄上清液，獲得的藻細胞即為EPS 保留的藻細胞（EPS-C）。

（3）微塑料脅迫處理。分別向EPS-F 組和EPS-C 組的各培養瓶中添加PAN-MPS 儲備液，使得體系中PAN-MPS 的最終濃度為0 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、500 mg/L，每個處理3 個重復，共24 個培養瓶，起始藻細胞密度約為3.0×106cell/mL。

1.2.3 測定方法

（1）采用血球計數板顯微計數法測定生物量。

（2）每天定時取樣后3 800 r/min 離心10 min 棄上清，加入5 mL 的乙醇溶液重懸，置于冰箱4 ℃過夜后3 800 r/min 離心5 min 獲得色素提取液，隨后使用分光光度法測定在470 nm、666 nm 和653 nm 處的吸光值。利用公式（1）～（3）計算出葉綠素和類胡蘿卜素的含量[7-8]。

式中，Ca、Cb和Cl分別表示葉綠素a、葉綠素b和總類胡蘿卜素含量，mg/L；A666、A653、A470分別表示色素提取液在666 nm 、653 nm 和 470 nm 處的吸光度值。

（3）每天定時取樣，暗適應20 min 后，根據ZHANG 等[9]的方法用植物效率分析儀測定樣品葉綠素熒光參數。

1.2.4 數據處理

采用Excel 2021 軟件對數據進行統計處理，結果用平均值±標準差表示；通過軟件SPSS 26.0 進行數據的差異顯著性分析，使用Origin 2021 軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 不同濃度PAN-MPS 對小球藻種群生長的影響

由圖1 可知，PAN-MPS 的添加，顯著抑制了小球藻的生長，且抑制效果隨著微塑料暴露濃度的增加而加強。對比EPS-C 和EPS-F 小球藻的生長表現，發現由于EPS 的缺失，EPS-F 組的球藻細胞少了抵御緩解微塑料的污染侵害的第一道防線，受到微塑料的毒害更加嚴重，不僅細胞總量低于EPS-C 組，且指數期也比EPS-C 組晚。

圖1 不同濃度PAN-MPS 脅迫下EPS-C 和EPS-F 小球藻種群數量增長曲線

2.2 不同濃度PAN-MPS 脅迫對小球藻光合色素含量的影響

圖2 是不同濃度PAN-MPS 脅迫下，EPS-C 和EPS-F 小球藻光合色素含量變化情況。（1）EPS-C 組，在PAN-MPS 暴露的前48 h，各實驗組光合色素的含量顯著上升，最大值出現50 mg/L PAN-MPS 添加組。（2）EPS-F 組，PAN-MPS 添加后，整個實驗周期中光合色素的積累均受到抑制，最小值出現在500 mg/L PAN-MPS 添加組。（3）對比EPS-C 和EPS-F 組的數據，可以發現去除EPS 后，藻細胞中的葉綠素a 和總類胡蘿卜素的含量均顯著下降，但葉綠素b 的含量在實驗后期有顯著提升。此外，所有處理組的葉綠素a 和總類胡蘿卜素含量的組間差異隨培養時間的增加而縮小。

圖2 不同濃度PAN-MPS 脅迫下EPS-C 和EPS-F 小球藻的光合色素含量變化

2.3 不同濃度PAN-MPS 脅迫對小球藻葉綠素熒光參數的影響

由圖3 可以看出，不同濃度PAN-MPS 脅迫后，小球藻的PSII 潛在活性（Fv/Fo）以及最大光量子效率（Fv/Fm）有著不同程度的變化。（1）EPS-C 組，隨著PAN-MPS 濃度的增加，Fv/Fo 和Fv/Fm 大體呈下降趨勢，且差異隨著培養時間的增加而逐漸顯著。（2）EPS-F 組，Fv/Fo 和Fv/Fm 的變化趨勢與EPS-C組基本一致，但從數值上來看，EPS-F 組的Fv/Fo 和Fv/Fm 值顯著高于EPS-C 組。同時隨著培養時間的增加，EPS-F 組的葉綠素熒光參數值均有不同程度的提升，說明小球藻在通過調節光合作用相關活性來對抗微塑料的脅迫。

圖3 不同濃度PAN-MPS 脅迫下EPS-C 和EPS-F 小球藻的葉綠素熒光參數變化

3 結論

聚丙烯腈微塑料（PAN-MPS）會抑制小球藻的生長，且存在濃度依賴效應。對比EPS-C 和EPS-F的各個實驗組小球藻的光合色素含量，EPS-F 的藻細胞中光合色素含量下降更為明顯。在PAN-MPS 脅迫下，小球藻的Fv/Fm 和Fv/Fo 不管EPS 存在與否都會被抑制，但是EPS-F 組的Fv/Fo 和Fv/Fm 值顯著高于EPS-C 組。