免疫分析儀檢測血栓四項的性能驗證

王瑩瑩 鄭雙林 謝華斌

作者單位：361000 福建廈門，廈門大學附屬心血管病醫院檢驗科，廈門市心血管疾病精準醫學重點實驗室

血栓性疾病是全世界范圍內導致患者死亡的重要因素之一。在檢驗篩查項目中，除了已有的凝血基礎篩查檢測項目外，目前新興的血栓四項檢測正逐漸進入人們的視野，血栓四項主要檢測項目包括血栓調節蛋白（thrombomodulin，TM）、凝血酶-抗凝血酶復合物（thrombin-antithrombin complex，TAT）、組織纖溶酶原激活物-抑制物1復合物（tissue plasmin activator inhibitor 1 complex，tPAIC）和纖溶酶-抗纖溶酶復合物（plasmin antiplasmin complex，PIC），上述四項檢測標志物將預測血栓性風險的關口前移，能夠在早于血栓發生之前預測其存在。

目前最早檢測血栓四項的儀器為日本希森美康株式會社HISCL-5000 電化學發光檢測分析儀，但因進口設備和試劑價格高，所以成本高昂，很多中小型醫院對血栓四項檢測只能望而卻步。本研究通過對國全自動化學發光免疫分析儀檢測血栓四項進行性能驗證，為該檢測在全國各級醫療機構的開展提供一種新的選擇，現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1儀器和試劑 萬孚FC-302 化學發光免疫分析儀及血栓四項配套檢測試劑、定標品、質控品均由廣州萬孚生物技術有限公司提供。

1.2標本收集 收集本院2021 年7 月1—30 日健康體檢者的新鮮血液標本，避免有出現乳糜、脂血、溶血、黃疸等不合格現象的標本，且血細胞比容＜55%。使用0.109 mmol/L 濃度的枸櫞酸鈉抗凝劑采血管采集樣本，參照臨床實驗室標準化研究所（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）H21-A5 文件［1］中，對于抗凝血漿的處理標準操作規程進行處理，并以1 500g離心10 min。

1.3性能驗證方法

1.3.1精密度驗證 ① 批內精密度：參照CLSI 制訂的EP15-A 文件［2］標準操作要求，分別對萬孚原廠血栓四項配套質控品進行檢測，該質控品每個項目有兩個不同的濃度水平，每個水平質控品連續檢測20 次。記錄結果后，計算各項目的均值（x_）以及標準差（s），并根據x_和s計算各項目結果的變異系數（coefficient of variation，CV；CV＝s/x_），根據廠家試劑說明書要求，各項目批內精密度CV≤8%。② 批間精密度：選擇兩個不同濃度水平的原廠血栓四項質控品，并依據檢測需要量分成5 等份，儲存于-20 ℃冷凍冰箱，隨后于連續5 d 內測定TM、TAT、PIC、tPAIC 結果，并根據上文公式計算CV。根據試劑說明書要求，各項目批間精密度CV≤10%。

1.3.2線性驗證 參照CLSI 標準中定量測定方法的線性評價（Evaluation of the Linearity of Quantitative Measurement Procedures，EP6-A）文件［3］，選擇原廠高濃度和低濃度質控品，分別使用原廠樣本稀釋液對每個濃度質控品稀釋8 個階段，不同濃度標本的稀釋關系已知，使稀釋后的樣本濃度能覆蓋整個線性范圍，上述稀釋操作完成后，每個標本測定檢測項目3 次，隨后，將所得項目結果的均值作為其中一點，將所得的實測值與理論值共8 組數據進行直線回歸計算，并根據回歸方程Y＝aX+B 及其對應的相關系數r2，驗證檢測試劑的線性范圍，落在1±0.05范圍內的回歸方程斜率可判定為合格。

根據廠家試劑說明書要求，各指標正常參考值范圍：TM 為1.0～200 TU/mL，TAT 為0.4～120 μg/L，tPAIC 為1～100 μg/L，PIC 為0.05～40 mg/L。各項目線性驗證相關系數r2≥0.990 0，判定為合格。

1.3.3攜帶污染率 參照CLSI H57-A 文件［4］要求，進行攜帶污染率驗證，具體方法如下：準備三個連續的檢測位置，將低值標本置于第一和第三個位置，高值標本則置于二者之間，并將每個樣本均檢測3 次，最終結果需按照Low1、Low2、Low3、High1、High2、High 3、Low4、Low5、Low6 記錄。則高值對低值樣本的攜帶污染率＝［Low4 -（Low1、Low2、Low3 均值）］/（Low1、Low2、Low3 均值），低值對高值樣本的攜帶污染率＝［High1 -（High1、High2、High3 均值）］/（High1、High2、High3 均值），因血栓四項的相關指南性文件中對于其檢測項目的攜帶污染率規定尚不明確，故而本次實驗可依據凝血相關性驗證要求，CV＜10%為合格［5-7］。

1.3.4空白檢出限驗證 綜合參照EP17-A 文件［8］及廠家空白檢出限驗證要求進行驗證，采用零濃度（即無分析物）樣本進行檢測，本實驗采用原廠樣本稀釋液，每個樣本重復檢測20 次，記錄測量結果的相對發光值（relative light unit，RLU 值），并根據檢測記錄計算平均值（Z）和標準差（SD）并最終得出Z±2SD對應的RLU 值。因本儀器血栓四項試劑均采用夾心法原理檢測，接下來依據夾心法試劑計算方法，即依據主校準曲線空白濃度校準品，與相鄰濃度校準品之間的濃度與RLU 結果，進行兩點回歸，并擬合得出一次方程，隨后將Z+2SD的RLU 值帶入上文方程中，求出的對應濃度值即為空白限［9］。接受標準為不低于廠家試劑說明書所要求的空白限要求標準。

1.3.5正常參考值驗證 本實驗依據CLSI C28-A2文件［10］要求，隨機抽取本院體檢部20 名健康體檢者的新鮮血漿標本，納入標準如下：① 無重大肝病史；② 半年內無輸血或大手術史；③ 身體各項發育指標及精神狀態正常；④ 未服用過抗凝藥物或避孕藥等干擾凝血功能指標檢測的藥物。測定所收集標本并計算r值，r＝檢測落在正常人參考值內的樣本數/總樣本數，r≥0.95 即認為驗證通過。

1.4統計學處理 應用Excel 2010 軟件對檢測數據進行統計分析。

2 結果

2.1精密度驗證結果 按照廠家試劑說明書要求，TM、TAT、PIC、tPAIC 項目的批內精密度要求CV≤8%，批間精密度要求CV≤10%，本研究驗證結果均符合要求。見表1。

表1 國產免疫分析儀檢測血栓四項的精密度驗證結果

2.2線性驗證 線性驗證結果可見，TM理論值與實測值回歸方程為Y＝0.988 6X-0.698 8，r2＝0.999 4；TAT 理論值與實測值的回歸方程為Y＝0.987 3X-0.480 5，r2＝0.999 5；tPAIC 理論值與實測值回歸方程為Y＝0.991 4X+8.479 1，r2＝0.994 4；PIC 理論值與實測值回歸方程為Y＝0.992 9X-0.840 4，r2＝0.990 6；驗證結果均為合格。

2.3攜帶污染率 TM 高值對低值攜帶污染率為-1.22%，低值對高值攜帶污染率為-2.63%，均符合要求。TAT 高值對低值攜帶污染率為3.04%，低值對高值攜帶污染率為0.31%，均符合要求。tPAIC 高值對低值攜帶污染率為-7.11%，低值對高值攜帶污染率為5.82%，均符合要求。PIC 高值對低值攜帶污染率為-6.04%，低值對高值攜帶污染率為0.21%，均符合要求。見表2。

表2 國產免疫分析儀檢測新血栓四項的攜帶污染率驗證結果

2.4空白檢出限結果 TM 的空白檢出限結果為0.017 08 TU/mL，試劑說明書要求為≤1.0 TU/mL；TAT的空白檢出限結果為0.019 88 μg/L，說明書要求≤0.4 μg/L；tPAIC 空白檢出限結果為0.001 34 μg/L，試劑說明書要求≤1.0 μg/L；PIC 空白檢出限結果為0.000 65 mg/L，要求為≤0.05 mg/L；均驗證通過。

2.5參考值范圍驗證結果 參考值范圍驗證結果可見，20 名健康體檢者中，TM 最低值為7.05 TU/mL，最高值為13.28 TU/mL，均在廠家說明書參考值范圍之內，符合要求。TAT 最低值為0.91 μg/L，最高值為3.76 μg/L，符合要求。tPAIC 最低值為男性2.862 μg/L，女性1.485 μg/L，最高值為男性16.782 μg/L，女性10.374 μg/L，符合要求。PIC 最低值為0.20 mg/L，最高值為0.57 mg/L，符合要求。見表3。

表3 國產免疫分析儀檢測血栓四項參考范圍驗證結果

3 討論

血栓性疾病發病隱匿、突然，病死率高，目前臨床常用的凝血基礎篩查項目屬于血栓形成后的被動檢測和晚期篩查項目［11］，對血栓前狀態、彌漫性血管內凝血前期（pre diffuse intravascular coagulation，Pre-DIC）等疾病不敏感，血栓四項（TM、TAT、PIC、tPAIC）檢測則能將血栓檢測風險的關口前移。

TM 主要分布于毛細血管內皮細胞，在凝血酶激活啟動蛋白C 的過程中起輔助作用。蛋白C 能滅活凝血途徑的兩個輔因子FⅤa、FⅧa，因此TM的水平高低調控著血管內皮細胞抗凝活性的強弱。TAT 不僅可以將血栓形成的預測關口前移，更有實驗發現對于血栓再栓的復發也有預測意義；PIC 能夠及時指導并提醒纖溶系統中纖溶酶分子的活躍程度，在溶栓治療過程中對于再栓風險的指導意義重大；tPAIC 升高不止意味著此時人體血管內皮細胞可能受到損傷，同時也可認為人體內纖溶系統分子正處于活躍狀態。有臨床研究證明，血栓四項可能與肺癌疾病進展有關［12］。其中TAT、TM、PIC 水平在急性早幼粒細胞白血病患者的臨床診斷及預后評估中也有較高價值［13］。聯合檢測血栓四項對早期診斷彌散性血管內凝血（disseminated intravascular coagulation，DIC）具有臨床指導意義［14-16，17-18］。PIC與tPAIC 與與多種心血管疾病的進展密切相關［19］?？梢娧ㄋ捻棛z測的開展對臨床患者的診斷及治療具有積極的輔助意義。

日本希森美康株式會社是國際首發檢測血栓四項的廠家，但因進口設備和試劑成本較昂貴，在很多中小型醫院難以上線使用。廣州萬孚目前是國內較早主導并推動血栓四項檢驗試劑國產化的品牌，檢測成本及經濟負擔相對會輕許多。

綜上所述，本研究證實，廣州萬孚生物技術公司FC-302 全自動化學發光免疫分析儀符合檢測血栓四項的性能驗證要求。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突