黑棗醋蛋液響應面法工藝優化及醋蛋水解度影響因素分析

孔煒浩　高琳　劉靜　張仁堂

摘要：目的：開發一款營養功能兼具的黑棗醋蛋液產品。方法：通過響應面試驗優化了黑棗醋蛋液工藝參數，研究了黑棗醋蛋液蛋白質水解度的影響因素。結果：最優工藝參數為醋蛋比質量比為3：1、浸泡溫度為30 ℃、浸泡時間為60 h；對比不同pH處理可知，在保證醋蛋液品質的基礎上，pH 3.0最適合醋蛋水解，此時蛋白質水解度最高，可達22.6%；25 ℃時醋蛋水解度最高為20.0%；金屬離子的加入能夠促進醋蛋水解，亞鐵離子、鈣離子、鋅離子、銅離子均在濃度為60 mmol/L時，黑棗醋蛋液水解度達到最高，分別為26.6%、28.2%、23.6%、23.0%。結論：最優工藝下生產的黑棗醋蛋液質量穩定，醋蛋水解度可達20.23%，且不同pH、溫度以及金屬離子均對醋蛋水解度有一定影響。

關鍵詞：黑棗醋蛋液；響應面優化；醋蛋水解度醋蛋液是由禽蛋浸泡于米醋中而成，同時具有醋與雞蛋的各種營養成分。醋蛋液營養保健價值極高，在國內外均屬傳統食療保健品，具有提高免疫力、降血壓、降血脂、抗氧化、補鈣、防治心血管疾病、治療扁平疣等作用[1-6]。黑棗是由紅棗經控溫控濕發酵而成[7]。紅棗黑化過程中通過非酶褐變反應使其口感、原有成分及功能發生變化[8]。同時黑棗還兼具紅棗抑制癌細胞、保肝護脾、美容護膚、補氣養血、增強人體免疫力、預防心血管疾病等主要作用[9]。

楊萍芳[10]優化得到醋蛋液浸泡的最優條件為醋蛋比值3.2、浸泡時間64 h、浸泡溫度24 ℃，蛋白質水解度可達37.19%。艾華[11]研究表明，醋蛋液有良好的調節血脂和抗氧化作用。李琳[12]研究表明，醋蛋液具有降壓作用。前人研究主要集中在傳統醋蛋液工藝優化及功能方面，對于新型醋蛋液的開發以及浸泡過程中外界因素對醋蛋液蛋白成分的影響研究較少。本試驗以黑棗醋浸泡禽蛋，一方面減少蛋腥味，增加棗香味，同時也會增加其營養成分，提高功能特性，明確外界因素對醋蛋液中蛋白水解度的影響對醋蛋液的制備、儲存與推廣具有重要影響。

1材料與方法

1.1材料與儀器

雞蛋（大小均勻且無損傷的紅殼雞蛋），購于山東泰安批發市場；9 g/100 mL黑棗醋（多酚含量為0.164 mg/mL；初始pH為3.4），山東農業大學果蔬加工實驗室發酵；甘氨酸、果糖（分析純），北京索萊寶科技有限公司；茚三酮試劑（分析純），上?？曝S實業有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鉀、無水乙醇、亞硝酸鈉、碳酸鈉、濃硫酸、濃硝酸、濃鹽酸、氫氧化鈉、氯化鋅、氯化鈣、氯化鈉、三氯乙酸（分析純），天津市凱通化學試劑有限公司；鉬酸銨、無水亞硫酸鈉、氯化亞鐵、氯化銅、蘆丁標準液（分析純），上海源葉生物科技有限公司；氫氧化鉀（分析純），天津市科密歐化學試劑開發中心。

AX124ZH分析天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；YP2003電子天平，上海光正醫療儀器有限公司；TG16臺式高速離心機，長沙英泰儀器有限公司；平行蒸發儀，杭州嘉維創新科技有限公司；PB-10型pH計，賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；PH-070A培養箱、磁力攪拌器，上海一恒科學儀器有限公司；101-2ES電熱鼓風干燥箱，北京市永光明醫療儀器廠；HH-6數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司；KQ2200DE型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.2方法

1.2.1黑棗醋蛋液工藝研究（1）響應面試驗優化黑棗醋蛋液生產工藝：通過Box-behnken試驗設計原理，采用Design-Expert.V8.0.6.1，參照陳文璐等[13-14]研究，通過分析比較前人研究方法步驟，確定響應面試驗變量為與試驗聯系最為密切的因素，參照楊萍芳[15]等的研究，研究其方法步驟，數據分析，確定選值范圍，選取對黑棗醋蛋液影響顯著的醋蛋比（A）、浸泡溫度（B）、浸泡時間（C）3個因素，以蛋白質水解度（Y）為響應值，進行三因素三水平的響應面設計，將得到的試驗結果進行回歸方程擬合，得出最優醋蛋液工藝參數。試驗過程均重復3次。響應面設計試驗因素及水平見表1。

1.2.2黑棗醋蛋液蛋白質水解度穩定性影響因素研究（1）不同pH對黑棗醋蛋液蛋白質水解度穩定性的影響：稱取紅殼雞蛋若干份，按醋蛋質量比3：1的比例分別添加9 g/100 mL黑棗醋，分別調節pH至3、5、7、9、11，在25 ℃的恒溫培養箱中浸泡64 h，過濾，檢測樣品的蛋白質水解度。平行操作3次。（2）不同溫度對黑棗醋蛋液蛋白質水解穩定性的影響：稱取紅殼雞蛋若干份，按醋蛋質量比3：1的比例分別添加9 g/100 mL黑棗醋，分別在20、40、60、80、100 ℃條件下處理64 h，過濾，檢測樣品的蛋白質水解度。平行操作3次。（3）不同金屬離子對黑棗醋蛋液蛋白質水解度穩定性的影響：稱取紅殼雞蛋若干份，按醋蛋質量比3：1的比例分別添加9 g/100 mL黑棗醋，分別用鈣、鐵、鋅、銅4種金屬離子進行處理，每種金屬離子濃度均為0、30、60、90、120 mmol/L，于25 ℃的恒溫培養箱中處理64 h，過濾，檢測樣品的蛋白質水解度。平行操作3次。

1.2.3指標測定方法

（1）蛋白質水解度測定：參照趙新淮等[16]的方法。蛋白質水解度DH（%）=（浸泡后醋蛋液中游離氨基酸一浸泡前蛋液中游離的氨基酸）/雞蛋中含有的所有氨基酸（雞蛋液中的蛋白氮）×100（1）

（2）標準曲線的測定：精確稱取0.100 0 g甘氨酸，加水溶解，轉移至100 mL容量瓶中，定容，取出2.00 mL定容完畢的甘氨酸溶液。分別稀釋，獲得含量為0、4、8、12、16、20 μg/mL的溶液。分別取2.00 mL稀釋液于試管中加入1.00 mL顯色劑，混和均勻后放入水浴鍋中，100 ℃沸水浴中加熱15 min；取出后用冷水冷卻，加入5.00 mL 40%乙醇溶液混合均勻，放置15 min使之反應，用零管調零，并測定其在570 nm處的吸光值。

（3）醋蛋液中游離氨基酸的測定：取醋蛋液10.00 mL定容至100 mL，取0.40 mL稀釋液于試管中并加入1.6 mL蒸餾水、1.00 mL顯色劑，混勻后置沸水浴中加熱15 min，然后冷水冷卻，加入5.00 mL 40%乙醇溶液混勻，放置15 min后用1 cm比色杯，以零管調零于570 nm處測定A值。利用標準曲線計算醋蛋液中游離氨基酸的含量。

1.3數據分析處理

試驗采用 SPSS 18.0 軟件進行數據分析，采用 Origin Pro 8.5 進行作圖，采用 Design-Expert 10.0.1 軟件進行響應面實驗設計及分析。

2結果與分析

2.1黑棗醋蛋液加工工藝優化

（1）響應面試驗結果與方差分析：以醋蛋比值（X₁）、浸泡時間（X₂）、浸泡溫度（X₃）為自變量，以蛋白質水解度為響應值（Y），做響應面分析試驗，試驗設計及結果見表2。利用Design-Expert軟件，采用 Box-BehnkenDesign 模型對數據進行統計分析，得到多項式回歸方程：

醋蛋水解度=19.02+1.28A+0.53B+3C+0.025AB-0.73AC+0.37BC-2.72A²-3.37B²-1.57C²（2）

該二次項方程及各項方差分析如表3所示。模型P<0.01，模型極顯著，失擬項P>0.05，失擬項不顯著，說明該模型具有統計學意義。觀察各因素的P值可以得出，因素A、C、A2、B2、C2對醋蛋水解度的影響極顯著（P<0.01）；因素B及交互項AC對醋蛋水解度的影響顯著（P<0.05）；其他變量的影響均不顯著（P>0.05）；說明單因素作用和交互作用對醋蛋水解度均有顯著的影響。校正系數R²_Adj=0.983 7，說明僅1.63%的變異不能被該回歸方程解釋；CV值為2.85，說明模型方程能夠很好地反映真實的實驗值。相關系數R²=0.992 9，由此可見，預測值與實際值之間具有高度相關性。因此該模型能夠用于優化黑棗醋蛋液的浸泡工藝。

（2）各因素及其交互作用對醋蛋水解度的影響：響應面圖形是通過二維空間和三維空間，直觀地反應各因素及其交互作用對響應值的影響。從圖1可以看出，各因素在醋蛋水解過程中的交互作用。等高線形狀反映了各因素之間交互作用的強弱。等高線的變化趨勢反應了各因素對醋蛋水解度的影響能力的強弱。通過等高線可以看出，AC、BC、AB其形狀均為橢圓形，說明醋蛋比（A）、浸泡時間（B）、浸泡溫度（C）對醋蛋水解度的影響復雜，各因素之間均有交互作用。且醋蛋比與浸泡溫度的交互作用最顯著。通過等高線的變化趨勢可得，各因素對醋蛋水解度的影響的大小順序為浸泡溫度＞醋蛋比＞浸泡時間。這與方差分析結果一致。為進一步準確確定最優配方，以醋蛋水解度最高為優化目標，根據Design-Expert 10.0.1 軟件運行結果，醋蛋水解度在醋蛋比、浸泡時間、浸泡溫度的共同影響下的最佳條件為醋蛋質量比3.05 ∶1，浸泡時間60.52 h，浸泡溫度29.72 ℃，在此條件下，模型預測的最大醋蛋水解度為20.54%。

（3）最優條件的驗證試驗：根據軟件預測結果，結合實際工藝設置的可行性，取醋蛋質量比3 ∶1、浸泡時間60 h、浸泡溫度30 ℃為條件進行3次重復試驗，得平均醋蛋水解度為20.23%，與模型預測結果接近，表明基于該響應面模型分析優化黑棗醋蛋液浸泡工藝的方法有效可行。

2.2黑棗醋蛋液蛋白質水解度穩定性影響因素研究

2.2.1pH對水解度穩定性的影響黑棗醋蛋液浸泡過程中不同pH對醋蛋水解度的影響顯著[17]。由圖2a可知，pH 3～7范圍內醋蛋水解度不斷降低，這一階段發生蛋白質的酸水解，且pH越低越有利于蛋白質水解。pH 7～11時，醋蛋水解度先升高后降低，在pH 9時達到最高，這一階段發生蛋白質的堿水解。對比不同pH處理可知，當pH為3時最適合醋蛋水解，醋蛋液蛋白質水解度最高，可達22.6%。

2.2.2溫度對水解度穩定性的影響由圖2b可知，醋蛋液蛋白質水解度隨溫度的升高呈現先升高后降低的趨勢。在處理溫度15～25 ℃范圍內，醋蛋水解度隨著溫度的升高而增大，在25～35 ℃范圍內，隨著溫度的升高，醋蛋水解度不斷降低，25 ℃時醋蛋水解度最高為20.0%。結果表明，25 ℃左右的溫度處理有助于醋蛋液的醋蛋水解更充分。當溫度過低時，醋蛋酸水解反應速度較慢，醋蛋水解程度較??；當溫度過高時，蛋白質會發生變性，不利于醋蛋水解，同樣使得醋蛋水解度比較小[18]。

2.2.3金屬離子對水解度穩定性的影響由圖2c可知，4種金屬離子不同濃度對醋蛋液水解度影響不同。隨著金屬離子濃度的增加，醋蛋液水解度均呈現先上升后降低的趨勢。亞鐵離子、鈣離子、鋅離子、銅離子均在濃度為60 mmol/L時，醋蛋液水解度達到最高，分別為26.6%、28.2%、23.6%、23.0%。未經金屬離子處理的醋蛋水解度最低，分別為18.6%、23.4%、18.6%、19.2%。4種金屬離子處理的醋蛋液水解度均大于未被金屬離子處理的醋蛋液水解度，這說明金屬離子處理有助于醋蛋液蛋白質的水解。一方面，酸性環境下，雞蛋中蛋白質發生水解使醋蛋液水解度增加；另一方面，亞鐵離子、鈣離子、鋅離子、銅離子等不同金屬離子處理，可能會改變雞蛋中蛋白質分子間的一些作用力，如-OH、-NH₂的氫鍵可能因配位形成有利于醋蛋肽水解的物質，促進了醋蛋液中蛋白質水解[19-20]。綜上所述，亞鐵離子、鈣離子、鋅離子、銅離子對醋蛋液的處理對醋蛋水解度均有促進作用，且促進醋蛋液蛋白質水解程度為鈣離子＞鐵離子＞鋅離子＞銅離子。

3結論

本研究通過響應面法優化黑棗醋蛋液浸泡工藝參數，最優工藝參數為醋蛋比（m/m）3：1、浸泡時間60 h、浸泡溫度30 ℃，在此條件下生產出的黑棗醋蛋液水解度可達20.23%，與預測值接近，說明結果可靠。不同pH、溫度對醋蛋水解度穩定性影響不同，pH為3、溫度25 ℃時醋蛋水解度最高，金屬離子有助于醋蛋水解，且影響順序為鈣離子＞鐵離子＞鋅離子＞銅離子。本研究優化確定了黑棗醋蛋液工藝及醋蛋水解度的影響因素，不僅拓寬了黑棗應用領域，彌補傳統醋蛋液生產工藝的不足，同時對醋蛋液產品的推廣具有重要意義。參考文獻

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Process Optimization of Black Date and Vinegar Egg Liquid Response Surface Method and

Analysis of Factors Influencing The Hydrolysis Degree of Vinegar EggKONG Wei-hao GAO Lin LIU Jing ZHANG Ren-tang

（1College of Food Science and Engineering，Shandong Agricultural University，Tai'an 271018，China;

2Shandong Zaoshang Good Agricultural Science and Technology Co.，Ltd. ，Tai'an 271000，China;

3Shandong Land Rural Revitalization Group Co.， Ltd.，Jinan 250000，China）Abstract：ObjectiveTo develope a product with both nutritional and functional black date and egg vinegar liquid. MethodThe process parameters of black date vinegar egg liquor were optimized by response surface testing，and the factors influencing the protein hydrolysis degree of black date vinegar egg liquor were investigated. ResultThe optimum process parameters were 3：1 vinegar-egg mass ratio，30 ℃ soaking temperature and 60 h soaking time. Comparing different pH treatments，it was found that pH 3.0 was the most suitable for vinegar-egg hydrolysis on the basis of ensuring the quality of vinegar-egg liquor，and the highest protein hydrolysis degree was 22.6% at this time; the highest degree of vinegar-egg hydrolysis was 20.0% at 25 ℃.The addition of metal ions could promote the hydrolysis of black jujube vinegar egg，with ferrous ions，calcium ions，zinc ions and copper ions all reaching the highest hydrolysis at a concentration of 60 mmol/L，26.6%，28.2%，23.6% and 23.0% respectively. ConclusionThe quality of black date vinegar egg liquid produced under the optimal process is stable and the degree of vinegar egg hydrolysis can reach 20.23%，and different pH，temperature and metal ions have some influence on the degree of vinegar egg hydrolysis.

Keywords： jujube vinegar egg；Response Surface Optimization；degree of hydrolysis of vinegar egg