水稻粉質胚乳突變體cse 的表型分析及基因定位

花芹 林泉祥 宋遠輝 孫家猛 張祖普陳慶全 李金才 張海濤

（1 安徽農業大學農學院，230036，安徽合肥；2 江蘇紅旗種業科技有限公司，225311，江蘇泰州；3 江蘇?。t旗）稻麥良種繁育工程技術研究中心，225311，江蘇泰州）

水稻（OryzasativaL.）作為重要的糧食作物，其胚乳主要由近80%淀粉和10%貯藏蛋白組成，為人類日常膳食提供重要能量。淀粉的生物合成和貯藏蛋白積累直接影響稻米的外觀、產量和食味品質。

胚乳發育中貯藏物質的合成受復雜基因調控。淀粉中ADP-葡萄糖焦磷酸化酶催化葡萄糖-1-磷酸和ATP 而產生活化的葡萄糖基供體ADP-葡萄糖和焦磷酸[1]。隨后在歧化酶、淀粉磷酸化酶、可溶性淀粉合酶、顆粒結合淀粉合酶I、淀粉分支酶和淀粉脫支酶等催化協同酶的作用下合成[2]。這些關鍵酶的缺失有可能導致胚乳皺縮[3]、黏稠[4]、白核[5]、粉質[6]和暗淡[7]等異常表型。其中白核和粉質等突變胚乳常表現為淀粉粒的數量、大小與排列等變異。SSG6編碼一種轉氨酶同源蛋白，其突變體ssg6成熟核淀粉顆粒增大，但千粒重顯著下降且呈輕微粉質狀[8]；fse1和flo6中出現較小的淀粉粒且排列松散，導致胚乳呈粉質狀態[9-10]；FLO19編碼一個定位在質體的丙酮酸脫氫酶復合物E1 組分亞基α1，該基因突變導致復合型淀粉顆粒減少，單粒型淀粉顆粒增多，導致籽粒內胚乳呈不透明狀[11]。除合成淀粉外，粉質胚乳表型也與貯藏蛋白積累有關。谷蛋白合成相關的基因GPA4、GPA5和GPA6發生突變均呈現粉質外觀。GPA4編碼一個保守膜蛋白GOT1B，通過與Sec23蛋白特異性互作調控COPII（coat protein complex II）組裝，積累57kD 的谷蛋白前體，形成2 種異常的Ⅰ型蛋白體，gpa4-1突變體的種子中蛋白含量顯著降低[12]；GPA5編碼一種植物特有的PX（phox-homology）結構域蛋白，與Rab5a 和VPS9a協同互作調控密集囊泡介導的后高爾基體向蛋白貯藏液泡的運輸[13]；GPA6編碼一個Na+/H+反向轉運體OsNHX5，gpa6只有部分谷蛋白被轉運到II型蛋白體中，導致II 型蛋白體減小[14]。此外，一些基因突變導致淀粉與蛋白合成均受影響，形成粉質胚乳。轉錄因子OsNAC20和OsNAC26雙突變體表現為淀粉和貯藏蛋白含量顯著下降，呈現粉質胚乳[15]。FLO2編碼一個具有3 個四肽重復基序（TPR）蛋白，TPR 包含2 個反向平行的α-螺旋結構，作為容納靶蛋白的互補區域，與多個目標蛋白同時發生相互作用[6]。突變體中與FLO2相關的參與淀粉和貯藏蛋白生物合成的許多基因的表達水平顯著降低，產生異常胚乳，表現為暗色和粉質特征，胚乳中貯藏物質含量減少，籽粒變小，F1種子育性降低[16-17]。

雖然水稻粉質胚乳成因研究取了一定進展，但相關基因調控網絡仍不明晰，仍需進一步發掘相關品質突變體，闡明淀粉和貯藏蛋白的生物合成與調控機制，促進優質水稻育種。本文通過篩選中花11組織培養突變體庫，獲得一個呈粉質、堊白和皺縮外觀胚乳的突變體cse（chalkinessandshrunken endosperm）。對突變體進行表型觀察、理化性質測定、遺傳分析、基因定位和候選基因克隆等研究，發現cse為flo2的一個新等位變異。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與定位群體構建

水稻粉質胚乳突變體cse來源于粳稻（Oryza sativaL.ssp.japonica）品種中花11 的組織培養。自然環境下，連續多代自交和田間考察發現，突變性狀能夠穩定遺傳。將其與粳稻品種IRAT129 配制雜交組合獲得F1。F1自交獲得F2，F2群體用于遺傳分析和基因定位。親本、F1雜交種和F2群體材料均播種于安徽農業大學國家高新技術農業園（合肥），單株種植，株行距為18cm×25cm，田間管理同大田生產。其中親本各種植8 行，每行10 株，設3 次重復，觀察并記錄分析水稻各生育期親本間形態特征及農藝性狀差異，并進行單株收獲。利用JLGJ-45 型電動礱谷機（大吉光電，杭州）去除穎殼后，統計群體中正常表型單株和突變體表型單株的分離比，選取極端個體用于精細定位。利用SPSS 20.0 軟件進行統計分析。

1.2 籽粒干物質積累測定

在中花11 和突變體穗部穎花開花后第3、7、14、21、28d 剪取穗頂部籽粒，置于105℃烘箱殺青30min 后，在80℃恒溫干燥箱中烘至恒重，脫除穎殼后測量干重，每個樣品設置10 次重復[18]。

1.3 碘染與掃描電鏡

親本種子去稃后用超純水浸潤12h，橫切并滴加2%I2-KI 溶液染色，并置于尼康S261-60 型體視鏡下觀察并拍照記錄。掃描電鏡觀察參照Zhang等[19]方法，使用E1010 型離子濺射儀（日立，日本）在斷面鍍上碳膜，采用S-4800 型高分辨率掃描電子顯微鏡（日立，日本）觀察并拍照。

1.4 成熟種子的理化性質測定

去殼籽粒采用200T 型高速多功能粉碎機研磨成糙米粉，過100 目篩，50℃恒溫箱中烘至恒重備用。采用A1481-1 植物淀粉含量試劑盒測定總淀粉含量；參照標準米質方法NY 147-88 測定直鏈淀粉含量[20]；參照龍武華[21]的方法測定總蛋白含量；參照蒽酮比色法[22]測定可溶性糖含量；采用DA7200 型近紅外快速分析儀（Perten，美國）測定糙米中脂肪酸、堊白度、堿消值和膠稠度[23]；使用Pyris DSC8000 型差示掃描熱量儀（Perten，美國）測定淀粉糊化特性[24]。參照于艷芳等[25]的方法測定尿素膨脹體積。每個樣本進行3 次生物學重復。

1.5 目的基因定位與分子標記的開發

SSR 和Indel 分子標記的開發利用Gramene（http://www.gramene.org）和NCBI（https://www.ncbi.nlm.nih.gov）網站數據庫下載日本晴和9311序列，通過BLAST 對比插入/缺失位點，利用Primer 3.0（http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0）開發分子標記，并由南京擎科生物科技有限公司合成。利用篩選出具有多態性的均勻分布于12 條染色體的197對SSR 和Indel 分子標記。選取F2群體中具有粉質胚乳表型的種子，用3%H2O2浸泡30min 破除休眠后，置于RXZ-50CD 型智能人工氣候箱（江南儀器，浙江）培養至三葉期，采用CTAB 法[26]提取葉片總DNA，構建CSE定位的DNA 混池，尋找與目標基因的連鎖位點，在此基礎上利用F2和F3群體進行目標基因的初步定位。再開發新的標記，擴大定位群體，對目標基因進行精細定位（表1）。10μL PCR 反應體系如下，2×TaqPCR StarMix 5μL、正反向引物（10μmol/L）各1μL、DNA 模板1μL、10%聚乙烯吡咯烷酮（PVP，polyvinylpyrrolidone）1μL 和ddH2O 1μL。PCR 反應條件為94℃預變性2min；94℃變性30s，退火溫度55℃～60℃退火30s，72℃延伸1min，共計35 個循環；最后72℃下終延伸5min，4℃保存。PCR 產物經8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、0.1%AgNO3染色后在3%的甲醛和NaOH 中顯色，觀察拍照并記錄基因型[27]。

表1 引物信息Table 1 Information of primers

1.6 RNA 提取與Real-time PCR 表達分析

取野生型和突變體三葉期葉片、根、莖、旗葉、花后3、7、14、21 和28d 穗，于-80℃保存，使用多糖多酚植物總RNA 提取試劑盒（擎科）提取總RNA，超微量分光光度計（DENOVIX，美國）檢測濃度。RNA 反轉錄試劑盒（艾瑞科）獲得cDNA。利用CSE的CDS 設計熒光定量PCR 引物，水稻基因Ubiquitin（LOC_Os03g13170）作為內參（表1）。反應體系采用莫納生物科技有限公司試劑盒MonAmpTMChemoHS qPCR Mix（MQ00401），20μL反應體系為0.4μmol/L 的正、反向引物、MonAmpTMChemoHS qPCR Mix 以及適宜濃度的cDNA；在BIO-RAD CFX96TM型熒光定量PCR 儀（BIORAD，美國）上進行擴增反應，反應條件為：95℃預變性10min；95℃變性10s，60℃延伸30s，40個循環。每個樣品重復3 次，用2-△△CT法計算CSE的表達量[28]。

2 結果與分析

2.1 突變體表型分析

水稻粉質胚乳突變體cse在合肥經多年種植性狀穩定。與野生型相比，cse在營養生長階段分蘗數顯著增加48.0%；生殖生長階段，生長較緩慢，株高顯著降低，主要表現在第3、4 節間分別縮短29.4%和40.0%、穗長縮短7.9%（表2，圖1a～c）?？挤N結果（表2）表明，cse二次枝梗數和結實率分別降低29.7%和3.0%。cse成熟干燥穎果表現為輕微皺縮，胚胎外圍呈透明狀，內胚乳粉質堊白不透明；而野生型穎果飽滿，胚胎輪廓清晰，胚乳硬質呈透明狀（圖1e～f）。與野生型相比，cse成熟籽粒的粒寬和粒厚顯著降低，千粒重僅為野生型的62.0%（圖1d，表2）。此外，我們分析了野生型和cse穎果發育過程中干重變化。從授粉后7d 開始，cse千粒重極顯著低于野生型，并且隨著籽粒的發育千粒重間差異逐漸擴大（圖2）。以上結果表明，cse的突變不僅影響植株的發育，也影響籽粒的灌漿速率。

圖1 野生型和突變體cse 的表型鑒定Fig.1 Phenotypic characterization of wild type and the cse

圖2 野生型和cse 的不同時期干物質積累比較Fig.2 Dry matter accumulation in wild type and cse at different stages

表2 野生型和突變體農藝性狀比較Table 2 Comparison of agronomic traits between the wild type and cse

2.2 胚乳淀粉顆粒染色與結構分析

野生型糙米橫截面呈透明狀且質地緊密，而突變體糙米橫截面呈粉質狀態且質地疏松。經2%的I2-KI 染色發現，突變體著色較野生型淺（圖3a～b），表明cse淀粉含量較野生型更低。利用掃描電鏡觀察野生型和cse成熟穎果橫斷面顯示，野生型胚乳淀粉顆粒緊密堆積、呈規則的多邊形晶體結構（圖3c）；而cse淀粉粒呈不規則球形且淀粉顆粒間縫隙較大，排列疏松，多以單一、分散的淀粉粒存在（圖3d）。上述結果表明，cse對胚乳中淀粉顆粒的發育至關重要。

圖3 野生型和cse 的成熟胚乳碘染和掃描電鏡觀察Fig.3 Iodine staining and SEM observation of mature endosperm between wild type and cse

2.3 成熟籽粒的理化性質分析

由于cse胚乳中淀粉發育異常，我們還檢測了成熟籽粒的理化性質。與野生型相比，cse的總蛋白質、脂肪酸和可溶性糖含量分別極顯著增加21.5%、83.7%和34.8%，堊白度增加340%；但總淀粉含量降低22.2%，且直鏈淀粉含量（8.8%）僅為野生型（17.6%）的49.9%（表3）。直鏈淀粉含量通常與糊化溫度、膠稠度相關。cse直鏈淀粉含量降低，其起始糊化溫度、峰值、結束溫度和焓變量也分別顯著降低6.9%、5.1%、3.1%和28.3%（表4），糊化溫度的關鍵指標堿消值也相應降低6.2%，但膠稠度增加11.2%。糊化特性影響米粉溶解性，尿素膨脹試驗結果表明，兩者在5mol/L 出現明顯膨脹現象（圖4），但突變體的米粉膨脹體積變化始終低于野生型。以上結果說明，cse突變影響了水稻穎果中淀粉和貯藏蛋白的累積，進而改變胚乳淀粉的理化性質。

圖4 野生型和cse 的尿素膨脹分析Fig.4 The swollen volume of wild type and cse starch in urea solutions of various concentrations

表3 野生型和突變體理化性質比較Table 3 Physicochemical properties comparison between the wild type and cse

表4 野生型和突變體糙米粉的熱特性參數Table 4 Thermal parameters of the wild type and cse

2.4 cse 遺傳分析

以cse為母本，以粳稻品種IRAT129 為父本配制雜交組合，F1籽粒發育正常，F2籽粒出現正常表型和粉質胚乳表型分離。2020 年隨機調查F2群體212 株，2021 年隨機調查F2群體743 株（表5），cse符合3:1（χ22020、2021<χ20.05,1=3.84）的分離規律，推斷cse的表型性狀受1 對隱性核基因控制。

2.5 粉質胚乳基因的精細定位

利用2 個親本cse和IRAT129 間具有多態性的197 對分子標記，對F2極端隱性表型單株構成的DNA 混池進行連鎖分析，發現親本cse的帶型與位于第4 號染色體上標記Os4-10 一致（圖5a）。進一步利用Os4-10 附近的標記進行連鎖分析，并開發了另外5 對多態性引物Os4-11、Os4-12、Os4-12-11、Os4-13 和Os4-13-16，對550 株F2具有粉質胚乳外觀單株進行初定位，發現目標基因cse位于分子標記Os4-13 和Os4-13-16 之間（圖5b）?；贕ramene 中水稻基因序列信息，在Os4-13 和Os4-13-16 之間開發出4 對新的SSR 和Indel 標記（表2），借助3034 株F2隱性單株，將cse鎖定在物理距離為40kb 的Os4-14-8 和Os4-15 標記間（圖5c）。

圖5 cse 的精細定位Fig.5 Fine mapping of cse

Gramene（http://www.gramene.org/）網站和Rice Genome Annotation Project（http://rice.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/rice/）上的基因預測信息表明上述40kb 候選區間內共有6 個候選基因（圖5d，表6）。經反復測序發現，與野生型相比，cse的ORF1～5 不存在堿基序列差異，但ORF6（LOC_Os04g55230）的第1 個外顯子處（-ATG 51bp）缺失3 個堿基（GGC）,導致甘氨酸缺失；第14 個外顯子處（-ATG 7887bp）堿基G 被替換成A，導致精氨酸突變為賴氨酸（圖5e）。cse編碼含有四肽重復結構域的蛋白質，是已經報道[6,21]基因OsFLO2/OsCNY8的新等位基因。

表6 精細定位區間內注釋基因Table 6 Annotated genes in the fine mapping range

2.6 CSE 表達模式與同源分析

我們利用Phytozome13（https://phytozome.jgi.doe.gov）上LOC_Os04g55230序列信息，在水稻、擬南芥、小麥、玉米和大麥的基因組數據庫中搜索同源蛋白，利用MEGA7.0 軟件對CSE 及同源蛋白的氨基酸序列進行比對并構建系統進化樹，發現水稻中存在2 個未有相關研究報道的同源基因LOC_Os07g23990和LOC_Os02g15660，同源率分別為73.5%和72.2%。擬南芥中同源基因ATFLO2（AT1G15290）參與種子中貯藏物質的積累，其T-DNA 插入突變體表現為種子易碎、數量減少以及千粒重降低[29]；ATFLL1（AT1G01320）參與葉片中淀粉合成和糖代謝[30]。因此，表明CSE是粉質胚乳相關基因（圖6）。

圖6 CSE 和CSE 類蛋白的系統發育分析Fig.6 Phylogenetic analysis of CSE(LOC_Os04g55230)and CSE-like proteins

利用Real-time PCR 檢測CSE在野生型中的表達模式，結果（圖7）表明，CSE在檢測的水稻組織包括葉片、根、莖、旗葉和不同時期發育的胚乳中均有表達，在旗葉中大量表達，授粉后14d 的發育胚乳中表達量達到峰值。

圖7 CSE 在野生型不同組織及不同發育時期胚乳的表達模式分析Fig.7 Wild type expression analysis of CSE in different tissues and endospern of different growth periods

3 討論

水稻胚乳的淀粉生物合成和貯藏蛋白積累是一個復雜而精密的生物過程，涉及一系列酶促反應。淀粉合成受到抑制，導致胚乳細胞淀粉顆粒排列疏松，顆粒間的縫隙引起光的散射，光在穿過胚乳損失而表現為白色不透明[31]。已有多個胚乳發育基因突變導致胚乳不透明的研究報道，如FLO5、WAXY和BEIIb[5,32]。胚乳缺陷突變體是闡明種子發育和淀粉生物合成分子機制的寶貴資源。本研究中，我們分離并鑒定了籽粒輕微皺縮、胚乳外圍輪廓清晰透明及內胚乳粉質不透明表型的cse突變體。與野生型相比，cse籽粒灌漿速率下降、結實率、千粒重和淀粉含量降低，淀粉的糊化特性和結構發生改變。掃描電鏡觀察顯示，cse橫截面質地疏松，淀粉粒呈不規則球形，淀粉顆粒間縫隙較大、多以單一、分散的形式存在且碘染色力較弱；而野生型胚乳淀粉顆粒緊密堆積，呈規則的多邊形晶體結構（圖3）。cse種子的橫截面外觀與flo7和flo5/ss3a突變體相似，flo7僅在籽粒外圍表現出粉狀的白色胚乳，而flo5/ss3a突變體則表現出白核粉狀胚乳[5,7]。淀粉合成由多個基因協同調控，因此，cse的粉質胚乳表型可能是水稻淀粉合成相關基因表達改變的共同作用。TPR 結構域廣泛存在于多種蛋白質中，并在蛋白質折疊、蛋白質運輸、細胞周期控制和翻譯后修飾等方面發揮關鍵作用，如編碼TPR 結構域的基因OsST2，對水稻分蘗起調控作用[33-34]。cse的第16、17、18 外顯子編碼3 個TPR基序，但第14 個外顯子處存在一個堿基G 被替換成堿基A，導致精氨酸突變為賴氨酸，可能造成TPR 結構域功能缺陷，使總淀粉含量降低22.2%，直鏈淀粉含量僅為野生型的49.9%（表3）。由此推測，cse可能對淀粉的合成與積累產生影響。此外，flo2僅籽粒大小和淀粉品質降低[6]，而cse還伴有植株變矮和分蘗數增加等性狀，表明cse是flo2的新等位基因突變體。

脂質通過調節代謝產物轉運活性間接影響淀粉粒的形成。編碼單半乳糖基二?；视停∕GDG）合酶的o5點突變導致MGDG 和半乳糖基二脂?；视停―GDG）減少，導致胚乳發育和淀粉合成異常[35]。此外，磷脂酸被證實與擬南芥中涉及半乳糖代謝和轉運的幾種蛋白結合，包括ABC 脂質轉運蛋白和DGD1[36]。粉質胚乳突變體fse1中總DGDG含量顯著降低，但總MGDG 含量有降低的趨勢[9]。cse胚乳發育過程中，脂肪酸含量顯著增加83.7%。cse脂質組成的改變可能導致種子發育異常，進而造成淀粉合成異常。因此，脂質介導的代謝物轉運可能是揭示種子淀粉積累機制的重要途徑，進一步對淀粉體中淀粉合成和膜脂合成之間的功能聯系研究，有助于闡明這種聯系背后的分子機制。

4 結論

cse是一個從組織培養后代植株中篩選出的胚乳發育異常突變體，該突變體籽粒受粉7d 后灌漿速率顯著降低，成熟籽粒表現為輕微皺縮，胚胎外圍呈透明狀，內胚乳粉質不透明。掃描電鏡結果顯示，淀粉粒呈不規則球形且淀粉顆粒間縫隙較大，排列疏松，多以單一、分散的淀粉粒存在且碘染色較淺。對籽粒理化性質測定表明，突變體的蛋白質、脂肪酸和可溶性糖含量顯著增加，總淀粉和直鏈淀粉含量降低。通過cse和IRAT129 配制雜交組合的F2遺傳定位群體分析表明，該性狀是由1 對隱性核基因控制。通過圖位克隆將該基因定位于4 號染色體Os4-14-8 和Os4-15 標記之間，物理距離為40kb。測序表明，候選區間內ORF6（LOC_Os04g55230）第1 個外顯子缺失3 個堿基（GGC）導致甘氨酸缺失，第14 個外顯子內存在一個由G 到A 的突變，導致精氨酸突變為賴氨酸。cse編碼的氨基酸改變，其蛋白功能活性受損，引起粉質胚乳表型。