苦蕎抗立枯病基因FtTIR 的克隆及功能鑒定

陳媛媛 李光勝 劉洋 何毓琦 周美亮 方正武

（1 長江大學農學院，434025，湖北荊州；2 中國農業科學院作物科學研究所，100081，北京；3 湖南科技大學生命科學與健康學院，411201，湖南湘潭；4 西南大學農學與生物科技學院，400700，重慶）

作物的生長發育常受到病原微生物的侵害，在協同進化的過程中，作物逐漸形成了一系列復雜的防御機制來應對病原微生物的入侵[1]。這種防御機制是一個復雜的免疫應答調控過程，包含對病原微生物的識別、信號轉導和抗病基因的調控等[2]。面對病原微生物的侵害，作物體內抗病蛋白能通過特異識別病原菌分泌的效應蛋白、介導應激反應信號轉導、觸發免疫響應對抗病原微生物的侵擾[3]。

TIR（toll-like receptor）基因是TIR-NB-LRR類型的抗病基因（resistance gene，Rgene）。TIR 蛋白的N 端含有白細胞介素受體TIR 結構域，能夠特異識別病原菌分泌的效應蛋白，協助蛋白質之間的結合[4-5]。目前，已經從煙草[6]、擬南芥[7]和亞麻[8]中鑒定到了TIR基因，并對其功能進行了分析。在煙草中，將TIR 蛋白中與Toll 或TIR 信號轉導相關的保守氨基酸位點突變后，突變的轉基因煙草植株對煙草花葉病毒的抗性減弱，且病毒可以在突變位點及周圍擴散[9]。此外，AtTIR基因突變后，擬南芥植株在沒有病原菌誘導情況下的存活率顯著降低[10]。同樣，在亞麻中發現，TIR 結構域突變后，植株的抗病性也顯著降低，證實TIR基因在植物抗病性中具有重要作用[11]。迄今為止，對TIR基因的研究主要集中在信號轉導及病原菌識別方面。然而，關于苦蕎TIR基因克隆與功能等方面的研究還鮮見報道。

苦蕎是蓼科（ Polygonaceae ） 蕎麥屬（Fagopyrum）的一種食藥同源的雜糧作物，富含蛋白質、維生素、礦物質及各種藥用類黃酮[12]。近年來，隨著我國蕎麥種植面積的不斷擴大，由立枯絲核菌（Rhizoctoniasolani）侵害引起的蕎麥立枯病害也呈逐年加重趨勢，嚴重阻礙了我國蕎麥產業的高質量發展。蕎麥立枯病主要發生在苗期，立枯絲核菌通過侵入蕎麥種子的種皮或幼苗莖基部和根部的傷口來感染蕎麥植株，被感染的蕎麥種皮表現為黃色或者褐色，嚴重時會導致種子腐爛[13]。受到感染的幼苗，前期莖基部會出現暗褐色的病斑或者水澤狀，接著病斑部位不斷擴大，病斑部位組織凹陷和腐爛，植株發生倒伏現象，后期幼苗發生枯萎，嚴重時幼苗死亡[14]。目前，蕎麥立枯病的防治主要依賴噴施化學藥物，雖然能有效殺死致病菌或抑制病菌的生長，但長期使用化學藥物會導致土壤微生物種群減少、土壤板結和肥力下降等問題[15]。

為了解析蕎麥立枯病菌的致病機理，挖掘抗病基因，本研究從苦蕎中克隆了FtTIR基因，對其進行生物信息學分析和基因表達模式分析，并進一步在擬南芥中過表達FtTIR基因進行抗病性鑒定，為研究苦蕎TIR基因在立枯絲核菌致病機制提供重要依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理方法

供試的立枯絲核菌株、野生型擬南芥（Col-0）、苦蕎品種“品苦1 號”和植物表達載體pBI121 均由中國農業科學院作物科學研究所蕎麥基因資源創新研究組提供。

選取顆粒飽滿、大小均一的苦蕎種子，經蒸餾水浸泡12h 后剝去外表皮。依次用1% NaClO 和75%乙醇消毒6min，然后用無菌水清洗3～5 次，將其平鋪于MS 培養基上，在22℃、16h/8h 光暗周期的培養室中培養。將培養2 周后的幼苗用活化好的立枯絲核菌菌柄侵染，菌柄直徑約3mm，用菌層接觸無菌苗。于侵染后0、6、12、24 和48h 分別對幼苗根、莖和葉取樣，用液氮速凍。

1.2 苦蕎總RNA 提取和cDNA 合成

取苦蕎幼苗80～100mg，按照RNA Easy Fast Plant Tissue Kit（北京天根生化科技有限公司）植物組織RNA 提取試劑盒提取樣品總RNA；用HiScript?III 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wiper）試劑盒（南京諾唯贊生物技術有限公司）反轉錄合成第1 鏈cDNA，并于-20℃保存備用。

1.3 FtTIR 基因克隆及生物信息學分析

利用CE 軟件以FtPinG0404132400.01.T01（Pinku1：http://mbkbase.org/Pinku1/）序列為參考序列，設計FtTIR基因全長擴增引物FtTIR-F/R（表1），以cDNA 為模板進行PCR 擴增。PCR 產物經電泳檢驗后，回收純化?；厥债a物經連接和轉化，篩選陽性克隆后送北京擎科生物科技股份有限公司測序，得到FtTIR-T 載體質粒。

表1 引物序列匯總Table 1 Summary of primer sequence

利用NCBI 在線網站對測序正確的序列進行blast 比對分析，確定FtTIR的開放閱讀框（ORF）。利用Expasy（https://web.expasy.org/protparam/）網站預測FtTIR編碼氨基酸數目、蛋白分子量（MW）、等電點（pI）等理化性質。分別利用PRABIGERLAND（https://npsa-prabi.ibcp.fr/）和SWISSMODEL（https://swissmodel.expasy.org/interactive）網站預測FtTIR 蛋白的二級結構和三級結構。利用Cell-PLoc 2.0（http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）對FtTIR 蛋白進行亞細胞定位預測分析。在NCBI 網站上利用FtTIR 蛋白序列進行blast同源比對，用DNAMAN 軟件進行TIR 蛋白的多序列比對，并用MEGA-X 軟件構建系統發育樹。

1.4 立枯絲核菌侵染下苦蕎FtTIR 基因的表達模式分析

利用CE 軟件設計FtTIR基因熒光定量PCR 引物FtTIR-qPCR-F/R（表1），以苦蕎組成型表達基因FtH3為內參基因。使用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 熒光定量試劑盒（南京諾唯贊生物技術有限公司）和7500 Real Time PCR System 儀器進行qRT-PCR 分析。按公式2-ΔΔCT計算基因的相對表達量。

1.5 pBI121-FtTIR 過表達載體的構建及擬南芥的遺傳轉化

以測序比對正確的FtTIR-T 質粒為模板，參照pBI121 圖譜設計特異性引物121-FtTIR-F/R（表1）進行PCR 擴增，利用同源重組方法將FtTIR基因的全長編碼區連接到空載體pBI121 中，測序比對后得到過表達載體質粒pBI121-FtTIR。

將重組質粒pBI121-FtTIR轉化到農桿菌GV3101 感受態中，篩選鑒定得到陽性克隆。將陽性菌液培養至OD600=0.6～0.8，通過浸花法侵染野生型擬南芥，收取T0代轉基因擬南芥種子，然后經卡那霉素抗性篩選得到T1代過表達擬南芥。以T1代過表達擬南芥葉片的DNA 為模板，載體pBI121的通用引物121F 為正向引物、121-FtTIR-R 為反向引物進行PCR 以鑒定陽性轉基因擬南芥植株。篩選至純化的T3代轉基因擬南芥（FtTIR-OE）并進行后續的生理生化分析。

1.6 pBI121-FtTIR 過表達擬南芥的抗病性鑒定

采用離體葉片接種法檢測轉基因擬南芥的抗病性，將過表達FtTIR擬南芥T3代和野生型擬南芥種子消毒滅菌后先在MS 固體培養基上培養，7d后轉移到蛭石:營養土=1:1 的混合土中培養，培養條件為25℃，光周期為光照16h、黑暗8h。取3周齡大小一致的葉片用于立枯絲核菌侵染。把葉片放置在鋪有濕潤濾紙的培養皿中，將活化好的立枯絲核菌平板菌打成直徑0.3mm 的菌餅，菌層接觸葉片正面。每個株系取15 個葉片，設置3 次生物學重復，對照使用無菌PDA 培養基。在接菌后24h統計發病情況。進一步做DAB 染色試驗，并觀察其病斑情況，然后檢測立枯絲核菌侵染和未侵染條件下擬南芥中FtTIR和病程相關基因AtPR1的相對表達量，并測定過氧化物酶（POD）和超氧化物歧化酶（SOD）活性。

2 結果與分析

2.1 苦蕎FtTIR 基因的克隆與生物信息學分析

以苦蕎幼苗cDNA 為模板，經PCR 擴增獲得一條長度為576bp 的目的片段（圖1）。

圖1 苦蕎FtTIR 基因序列擴增Fig.1 Sequence amplification of FtTIR gene in tartary buckwheat

基因結構分析（圖2a）表明，FtTIR基因編碼蛋白與其他植物上的該基因編碼蛋白具有相同的保守結構域TIR，屬于TIR-NB-LRR 類型抗病基因家族，但不同植物間具有不同程度的同源性。SOPMA 在線網站分析（圖2b）顯示，FtTIR 蛋白二級結構包含41.36%α-螺旋、34.03%不規則卷曲、15.71%β-折疊及8.90%β-轉角。三級結構預測（圖2c）顯示，FtTIR 蛋白與模板c5ku7B 的相似性達33%，與二級結構預測結果基本一致。利用Phyre2預測FtTIR 的三級結構，顯示FtTIR 與TIR-NB-LRR型抗性蛋白rpv1（c5ku7B）的相似性達100%，與二級結構預測結果一致。系統發育分析（圖2d）顯示，FtTIR 蛋白與藜麥XP_021726625.1 和赤豆XP_047164412.1 親緣關系較近，屬于同一分支。

圖2 FtTIR 基因的生物信息學分析Fig.2 Bioinformatics analysis of FtTIR gene

2.2 苦蕎FtTIR 基因的表達模式分析

qRT-PCR 結果（圖3）表明，FtTIR基因在立枯絲核菌侵染下總體表達上調，但苦蕎根、莖和葉中FtTIR基因存在不同程度的誘導表達，且在根中的表達量普遍較低，在莖中的表達量較高。在莖中FtTIR基因的表達量在接菌后6h 時達到峰值，與不接菌相比表達量上調約7 倍。在根中FtTIR基因的表達量在接菌后48h 時達到峰值，且表達量僅上調0.5 倍左右。在葉中FtTIR基因的表達量在接菌后24h 時達到峰值，表達量上調約9 倍。

圖3 立枯絲核菌侵染下FtTIR 基因在苦蕎不同器官中的表達模式Fig.3 Expression patterns of FtTIR genes in different organs of tartary buckwheat under infestation with R.solani

2.3 FtTIR 過表達擬南芥的抗病性鑒定

2.3.1 過表達擬南芥葉片接種立枯絲核菌表型 選取生長狀態相同的3 周齡的轉基因和野生型擬南芥葉片進行立枯絲核菌接種（圖4），在正常條件下，野生型（WT）與過表達擬南芥株系（FtTIR-OE）之間無明顯差異。而在立枯絲核菌侵染后，過表達擬南芥株系葉片的抗病性較WT 強。

圖4 轉基因擬南芥的抗病性表型驗證Fig.4 Phenotypic verification of disease resistance in transgenic Arabidopsis

2.3.2 DAB 染色試驗 選取3 周齡的FtTIR-OE 和WT 擬南芥葉片進行立枯絲核菌侵染，對照組不作侵染。經28℃培養箱培養24h 后，用DAB 染色液對離體葉片染色20min，再用葉綠體脫色液脫色至葉片透明。如圖5 所示，對照組FtTIR-OE 和WT擬南芥葉片無明顯差異，而被立枯絲核菌侵染的葉片出現大量的病斑，呈棕褐色。在立枯絲核菌侵染24h 時，經DAB 染色后，FtTIR-OE 擬南芥株系葉片的病斑明顯少于WT。這表明FtTIR基因對立枯絲核菌的侵害具有一定的抵抗作用。

圖5 轉基因擬南芥的抗病性DAB 染色驗證Fig.5 DAB staining for resistance of transgenic Arabidopsis

2.4 立枯絲核菌侵染FtTIR 過表達擬南芥的表達模式

采用qRT-PCR 方法檢測FtTIR-OE 和WT 擬南芥在立枯絲核菌侵染下FtTIR基因的表達模式，以Atactin為內參。如圖6a 所示，FtTIR-OE 轉基因株系中FtTIR基因的表達量較WT 顯著提高，而在立枯絲核菌侵染后FtTIR-OE 轉基因株系（OE-RS）中FtTIR基因的表達量較不侵染時（OE）的表達量顯著提高。

圖6 轉基因擬南芥中的表達模式分析Fig.6 Analysis of expression patterns in transgenic Arabidopsis

進一步研究FtTIR在苦蕎立枯病抗病信號通路中的作用，通過qRT-PCR 檢測擬南芥葉片中病程相關基因AtPR1的表達水平，結果表明轉基因擬南芥中AtPR1基因的表達量顯著高于WT（圖6b），同時在立枯絲核菌侵染下，AtPR1基因的表達量顯著增加。

2.5 擬南芥抗病性相關生理生化指標分析

測定擬南芥葉片中POD 活性（圖7a）發現，在WT 擬南芥中經立枯絲核菌侵染24h 條件下，POD 活性沒有顯著差異；而在FtTIR-OE 株系中，POD 活性在經立枯絲核菌侵染24h 后顯著升高。WT 擬南芥在立枯絲核菌侵染下，SOD 活性顯著低于正常條件；而在FtTIR-OE 株系中，與正常生長條件相比，被立枯絲核菌侵染24h 后，SOD 活性顯著升高（圖7b）。結果表明，過表達擬南芥株系在被立枯絲核菌侵染時，植株體內的POD 和SOD 活性均顯著提高，表明過表達株系相較于WT 具有更強的抗病性。

圖7 轉基因擬南芥生理生化指標分析Fig.7 Analysis of biochemical indices in transgenic Arabidopsis

3 討論

為了適應極端環境，植物進化出一系列防御機制來抵抗病原菌的侵害[15]。TIR抗病基因在植物的抗病信號通路中發揮著至關重要的作用[16]。蕎麥的藥用價值和經濟價值日益顯著，種植面積不斷擴大，而其生產受立枯病影響日益嚴重[3,17]。立枯病是由立枯絲核菌感染造成的，用立枯絲核菌感染苦蕎植株后，90%的植株出現壞死的褐色病變[18]。到目前為止，關于蕎麥的立枯病抗病機制尚未明確。為解析苦蕎對立枯絲核菌的抗病性，本研究從苦蕎品種“品苦1 號”中克隆出FtTIR基因，生物信息學分析顯示其具有TIR 家族特有的TIR 結構域。在苦蕎苗期，立枯絲核菌侵染后的qRT-PCR 分析表明，FtTIR基因受立枯絲核菌脅迫的誘導；組織特異性分析表明，FtTIR基因在根、莖和葉中有不同的表達量，參與不同的發育階段。

TIR基因的作用機制是通過與病原菌結合，將信號轉遞給轉導因子[4]。轉導因子與免疫反應基因的啟動子相結合，誘導免疫反應基因表達，從而對病原菌產生抗性[18]。在煙草中，TIR基因的突變導致轉基因煙草對煙草花葉病毒的抗性消失，且病毒的擴散速度大幅提升，說明TIR基因參與了煙草花葉病毒的信號轉導[19]。在擬南芥中，TIR基因的突變導致轉基因擬南芥在沒有病原菌效應蛋白誘導的情況下也可以引起細胞壞死[11,20]。同樣，在亞麻中TIR基因突變也導致轉基因植株對條銹病的抗性消失[21]。這些研究證實，TIR基因與病原菌的效應分子識別有關，但TIR 蛋白是否直接與病原菌效應蛋白結合還有待進一步研究證實。此外，TIR基因具有調節信號轉導的功能[22]。對擬南芥中TIR基因的研究[20,23]發現，TIR基因具有負調節抗性信號傳導的功能，因為TIR基因的突變導致轉基因擬南芥的防御反應一直處于激活狀態。同樣，過表達馬鈴薯TIR基因導致植株的病菌防御反應降低[24]。與上述研究矛盾的是，有研究[25]發現，TIR基因具有正調節功能。將TIR基因的LRR 結構域突變后，植株的抗性反應消失，說明LRR 結構域具有正調控信號轉化功能。因此，TIR 是否作為植物抗病反應信號轉導的負調控因子仍需進一步研究證實。

本研究中，在擬南芥中異源表達FtTIR后顯著提高了擬南芥葉片對立枯絲核菌的抗病性。生理指標檢測分析發現，其抗病性的提高與植物體內SOD和POD 活性的增加有關。此外，在立枯絲核菌侵染過表達擬南芥中病程相關基因AtPR1的表達水平也顯著提高，這種病程相關蛋白激活了植株的防御機制，從而使植物最大程度減少損傷。本研究結果表明，FtTIR在提高苦蕎對立枯絲核菌抗病性中發揮著積極作用。本研究證實了TIR基因通過激活病程相關基因PR1的表達來提高植株的抗病性，是苦蕎立枯病抗性的正向調節因子，該結果為后續深入研究TIR基因調控苦蕎立枯病抗病分子機制奠定了基礎。

4 結論

從苦蕎中克隆出TIR-NB-LRR 類型的抗病基因FtTIR，在立枯絲核菌侵染24h 后，其在苦蕎根、莖和葉中表達量均有顯著增加，在莖中表達量最高，表明FtTIR基因受立枯絲核菌誘導表達。過表達擬南芥離體葉片侵染和DAB 染色結果說明，FtTIR基因具有明顯的抗病性。在立枯絲核菌侵染條件下，FtTIR轉基因擬南芥植株的POD 和SOD活性較WT 顯著提高，其抗病能力顯著高于對照。