基于主成分分析及隸屬函數法對芝麻苗期耐熱性綜合評價

蘇小雨 高桐梅 張鵬鈺 李豐吳寅 王東勇 田媛 衛雙玲

（1 河南省農業科學院芝麻研究中心，450002，河南鄭州；2 神農種業實驗室，450002，河南鄭州；3 河南省特色油料作物基因組學重點實驗室，450002，河南鄭州）

作物的產量及品質受環境和遺傳雙重因素制約，其中，高溫是一種常見的重要環境因子。近年來，隨著溫室氣體排放和氣候變暖，全球范圍內高溫災害頻繁發生，且范圍也越來越廣，已對作物的正常生產構成嚴重威脅[1-2]。芝麻（Sesamum indicumL.）作為我國重要的特色油料作物，栽培歷史悠久，種植范圍廣[3]。高溫熱害是我國芝麻生產上經常遇到的氣象災害。芝麻主產區夏季氣溫普遍較高，高溫天氣頻繁發生導致落花嚴重，生長發育受到影響，顯著降低了芝麻產量和品質。此外，世界各地對芝麻產品的需求不斷上升，種植面積不斷擴大，全球芝麻種植面積從2007 年的710 萬hm2增加到2019 年的1313 萬hm2[4]，非傳統地區芝麻的種植面積也在增加，研究芝麻對高溫的響應不僅能確定其適宜產區，還可以應對與氣候變化相關的挑戰[5]。因此，如何提高芝麻耐熱性和選育耐熱性品種是目前急需解決的問題。

高效評價鑒定方法是選育耐熱性品種工作順利開展的基礎，然而作物的耐熱性是一種復雜的生物學現象，不同或同種作物的不同基因型和不同生育期耐熱性受高溫強度、持續時間及與其他逆境復合因素的影響不同[6]。目前，作物苗期耐熱性主要通過測定高溫處理后存活天數、相關形態指標及生理生化指標等，利用主成分分析和隸屬函數法來綜合評價，該方法已廣泛應用于多種作物，如玉米[7]、大豆[8]和小麥[9]等。研究[10-13]表明，高溫脅迫下膜的熱穩定性、光合相關指標以及抗氧化酶活性是公認的耐熱性鑒定生理指標，但在不同作物耐熱性評價中，這些指標的變化存在明顯差異，在不同作物中起關鍵作用的指標也明顯不同。綜上所述，不同作物的耐熱性評價具有特異性，不同作物在不同的高溫環境下，其評價方法和標準仍需進一步探索和構建。

目前，有關芝麻耐熱性鑒定方法的研究鮮見報道，為了探究不同芝麻品種的耐熱性，建立芝麻耐熱性鑒定體系和評價標準以及明確芝麻耐熱性與其內部生理過程變化的關系，本研究從芝麻種質資源材料庫中篩選出20 個芝麻品種為試驗材料，經高溫處理后通過測定相關耐熱性指標，進行相關性和主成分分析，構建芝麻耐熱性評價體系，為耐熱性芝麻新品種的選育和相關高產栽培提供種質資源及理論和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

選取來源和種皮顏色不同的20 份芝麻種質資源為試驗材料，材料均由河南省農業科學院芝麻研究中心提供，具體信息詳見表1。

表1 供試芝麻種質資源信息Table 1 Informations of tested sesame germplasm resources

1.2 試驗設計

試驗于河南省農業科學院芝麻研究中心實驗室進行，采用盆栽試驗，在20 份芝麻材料中選取籽粒飽滿、大小均勻的種子播種在塑料盆（直徑16cm，高14cm）中，每個品種重復3 盆。培養基質中營養土:珍珠巖為3:1，在光照培養箱中育苗，培養條件為光照14h/黑暗10h，濕度70%，光照350μmol/(m2·s)，溫度30℃。待植株長至3 對真葉時選取長勢一致的植株進行高溫處理，選取43℃±1℃作為高溫脅迫處理，以30℃±1℃條件下正常生長的幼苗為對照，連續處理直到植株死亡，記錄每天植株死亡數，每個處理重復3 次。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 株高和葉片干重 高溫脅迫處理8d 后，測定每個芝麻基因型的高溫和正常環境下的植株株高，采集葉片后放入烘箱中105℃殺青15min，再在80℃烘至恒重后測定干重[14]。

1.3.2 相對電導率 高溫脅迫處理8d 后，采用電解質滲漏法測定相對電導率，方法如下，檢測高溫脅迫處理與對照植株第3 對真葉，用蒸餾水沖洗3 次，濾紙吸干葉片表面水分后，置于50mL試管中，加入去離子水10mL，室溫下浸泡12h，用便攜式電導率儀（DDBJ-350，上海儀電科學儀器股份有限公司）測定溶液電導率（R1），然后加熱煮沸30min，冷卻至室溫后，再次測定溶液電導率（R2），相對電導率（REC，%）=R1/R2×100。

1.3.3 存活天數 在高溫脅迫下，記錄每天不同品種植株死亡個數，利用加權平均值法計算存活天數，存活天數（SV）=∑（脅迫天數×每天死亡株數）/總株數。

1.3.4 葉綠素含量（Chl） 利用葉綠素儀（SPAD-502 Plus，Konica Minolta）測定高溫脅迫處理8d和對照植株第3 對真葉葉綠素相對含量（SPAD值）。

1.3.5 氣體交換參數和葉綠素熒光參數 采用GFS-3000 光合作用測定儀（WALZ，德國）在9:00-10:30 測定基部第3 對真葉凈光合速率（Pn），有效輻射強度為1500mol/(m2·s)。利用雙通道調制葉綠素熒光儀Dual-PAM-100（WALZ，德國）測定葉片葉綠素熒光參數。用葉片夾夾住葉片，暗適應30min 后測定初始熒光（Fo）、最大熒光（Fm）、最小熒光（Fo′）及穩態熒光（Fs）等熒光參數，計算實際量子產量（φPSⅡ）和光系統Ⅱ（PSⅡ）最大光化學率（Fv/Fm）。

1.3.6 生理生化指標 稱取不同基因型品種高溫和正常環境下處理的葉片樣品0.2g，加入預冷的磷酸緩沖液3mL（50mmol/L，pH=7.8）在研缽中磨成勻漿，吸入離心管中在4℃環境下12000g 離心20min，將上清液定容到10mL，每個處理重復3 次。上清液用于測定丙二醛（MDA）、游離脯氨酸（Pro）含量及超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性[15-17]。采用氮藍四唑法測定SOD 活性，SOD 的反應液為依次加入pH 7.8 的PBS 緩沖液、甲硫氨酸、NBT（氮藍四唑）、EDTA（乙二胺四乙酸）、核黃素液及酶液。用加入緩沖液作對照管，以加粗酶液為測定管，放置在光照下約20min，以黑暗對照管調零，在560nm 比色測定光吸收值。

SOD 總活性（U/g）=（Ack–Ae）V/（Ack×0.5×W×Vt），式中，Ack為對照管的吸光度，Ae為樣品管的吸光度，V（mL）為提取液總量，Vt（mL）為測定用提取液量，W（g）為樣品鮮重。

采用愈創木酚法測定POD 活性，酶反應體系為30μL 酶液加入3mL 反應液，反應液為50mL PBS，加入愈創木酚（2-甲氧基酚）28μL，攪拌溶解后加入30%H2O219μL。POD 活性計算以每分鐘OD 值變化（升高）0.01 為1 個酶活性單位（U）。POD 活性[U/(g·min)]=ΔA470×Vt/（W×Vs×0.01×t），式中，ΔA470為反應時間內吸光度的變化，W（g）為葉片的質量，t（min）為反應時間，Vt（mL）為提取液總量，Vs（mL）為測定用提取液量。

采用紫外分光光度法測定CAT 活性；采用硫代巴比妥酸法測定MDA 含量[18]；采用磺基水楊酸法測定Pro 含量[18]；采用試劑盒（蘇州格銳思生物科技有限公司）測定H2O2含量和超氧陰離子產生速率。

1.4 數據處理

采用Excel 整理數據，采用DPS v18.10 進行相關性分析、主成分分析、隸屬函數分析、聚類分析、灰色關聯度及逐步回歸分析。

耐熱系數（γ）=高溫處理測定值/對照處理測定值。根據提取的特征值，以大于1 或累計貢獻率大于80%的準則提取主成分。利用隸屬函數將每個主成分上各品種的性狀綜合指標的得分值進行標準化，μ（xi）=(Xi–Xmin)/(Xmax–Xmin)，i=1，2，3，…，n。，式中，wp表示提取的第p個主成分的權重，λp表示提取的主成分所對應的貢獻率。，式中，C表示高溫處理響應因子綜合值，以C值進行聚類統計，劃分耐高溫等級。

2 結果與分析

2.1 高溫脅迫下芝麻相關指標遺傳變異分析

由表2 可知，高溫脅迫后各芝麻品種的株高、干重、葉綠素含量、Pn和Fv/Fm較對照均下降（γ＜1），而REC、MDA 含量，SOD、POD、CAT活性、產生速率和H2O2含量均升高（γ＞1），僅Pro 含量存在降低和升高（γ＞1 或γ＜1）。同時發現，除株高外，同一指標耐熱系數在各品種間存在差異，且各指標變異系數差異明顯，其中Pn變異系數最大，其次為Pro、H2O2含量和存活天數，株高的變異系數最小，整體為3.53%～18.26%。由于不同指標的耐熱系數在品種間的變異幅度較大，根據單一性狀指標的耐熱系數直接判斷芝麻品種的耐熱性過于片面，缺乏可靠性，因此，需進一步對各指標相關性進行分析和評價。

表2 芝麻種質資源單項指標耐熱系數和存活天數Table 2 Heat-tolerance coefficien of each single indext and survival days of sesame germplasms

2.2 高溫脅迫下各指標間相關性分析

由相關系數矩陣（表3）可知，各指標間存在不同程度的相關性，X1（SV）與X3（DW）、X6（Pn）、X8（Fv/Fm）和X9（Pro）呈極顯著高度正相關（R＞0.8，P＜0.01），相關系數分別為0.83、0.84、0.82 和0.92；與X5（SPAD）、X10（SOD）、X11（POD）和X12（CAT）呈極顯著中度正相關（0.5＜R＜0.8，P＜0.01），與X4（REC）、X7（MDA）、X13（）和X14（H2O2）呈極顯著高度負相關（P＜0.01），相關系數分別為-0.86、-0.78、-0.73 和-0.88。此外，其他指標之間存在不同程度的相關性。由此看出，各指標間有著復雜的相關性，所反映的耐熱性信息存在不同的交叉與重疊現象，充分說明芝麻耐熱性為綜合性狀。因此，為了全面系統地評估各品種（系）的耐熱性，需將各單項指標綜合考慮從而得到較為準確的信息量，消除單一指標評價耐熱性的不足，需要進一步采用多元分析方法進行綜合評價。

表3 不同芝麻品種的耐高溫系數和存活天數的相關性分析Table 3 Correlation analysis of the heat-tolerance coefficients and survival days in different sesame varieties

2.3 高溫脅迫下不同芝麻品種指標的主成分分析

通過主成分分析法對不同芝麻品種測定的單項指標進行分析（表4），根據主成分因子累計貢獻率大于80%的準則提取了3 個主因子，將14 個單項指標換算為3 個新的相互獨立的綜合指標，分別用CI(1)、CI(2)和CI(3)表示，其特征值分別為10.09、0.94 和0.66，貢獻率分別為72.09%、6.74%和4.71%，累計貢獻率達83.54%，包含芝麻耐熱性的大部分信息，說明這3 個綜合主因子具有較強的信息代表性。此外，通過各性狀的成分矩陣分析，從各主成分綜合指標系數大小可以看出，第1 主成分主要包括X1、X3、X4、X6和X14；第2主成分主要包括X2；第3 主成分主要包括X9、X10、X11和X12。結果表明，通過主成分分析取得的3個獨立的綜合性指標可以較為全面地反映出原始14 個指標包含的信息，能夠準確地進行芝麻耐熱性評價分析。

表4 各主成分綜合指標的系數及貢獻率Table 4 Coefficients and contribution of comprehensive indexes of principal components

2.4 不同芝麻品種耐熱性綜合評價

利用DPS v18.10 數據處理軟件對各單項指標的耐熱系數和存活天數進行標準化，標準化后的數據和通過主成分分析得到的各主成分綜合指標的指標系數進行對應乘積，計算出每個芝麻品種的3 個綜合指標得分值[CI(x)]（表5）。根據公式計算每個材料3 個主成分綜合指標的隸屬函數值μ(x)，然后計算各主成分綜合指標的權重，3 個主成分綜合指標的權重分別為0.86、0.08 和0.06，各材料的綜合得分值（C）為各材料的耐熱能力，C值越大，該品種的耐熱性越高。由表5 可知，通過各品種C值排序，不同芝麻材料耐熱性表現為SP117 ＞SP170 ＞SP002 ＞SP028 ＞SP133 ＞SP157＞SP162＞SP102＞SP146＞SP067＞SP018＞SP174 ＞SP112 ＞SP039 ＞SP014 ＞SP197 ＞SP019＞SP059＞SP078＞SP184。

表5 不同芝麻品種的綜合指標值、隸屬函數值μ(x)、權重和綜合得分值（C）Table 5 Values of different sesame varieties’comprehensive index,μ(x),index weight(IW),and comprehensive index score value(C)

2.5 不同耐熱性芝麻品種聚類分析

如圖1 所示，在數據標準化后歐氏距離0.15處可將20 個芝麻品種分為6 個類群，類群Ⅰ為強耐熱型（C≥0.86），包括SP117（河南，粒白）和SP170（河南，粒白）；類群Ⅱ為中耐熱型（0.76≤C≤0.80），包括SP002 和SP028；類群Ⅲ為耐熱型（0.56≤C≤0.70），包括SP067、SP102、SP133、SP157、SP146 和SP162；類群Ⅳ為敏感型（0.42≤C≤0.48），包括SP018、SP039、SP112 和SP174；類群Ⅴ為中敏感型（0.33≤C≤0.38），包括SP019、SP197 和SP014；類群Ⅵ為高敏感型（0.09≤C≤0.17），包括SP059、SP078 和SP184。在20 個芝麻品種中，耐熱型品種多來源于河南和江西，共篩選出白粒品種5 個、黃粒品種2 個、黑粒品種3 個；敏感型品種多來源于山東，共篩選出白粒品種4 個、黃粒品種4個、黑粒品種2 個。

圖1 20 個芝麻品種耐熱性聚類樹狀圖Fig.1 Dendrogram of thermotolerance for 20 sesame varieties

2.6 不同芝麻品種各單項指標與C 值的灰色關聯度分析

由表6 可知，各單項指標中存活天數與C值關聯最為密切，關聯系數為0.69，其他指標關聯性較大分別為葉片干重＞Pn＞SPAD＞Fv/Fm＞Pro，關聯系數分別為0.64、0.62、0.59、0.58 和0.57。這6 項指標與耐熱性關聯系數較高，尤其是存活天數可能是芝麻耐熱性品種評價的關鍵因素，可用于實際鑒定評價和等級劃分工作的主要參考指標。

表6 不同芝麻品種各單項指標與C 值的灰色關聯度分析Table 6 Analysis of grey correlation degree between each single index and C-value of different sesame varieties

2.7 芝麻耐熱性評價指標的篩選

為了有效分析14 個單項指標與不同的芝麻品種耐熱性的對應關系，通過多元逐步回歸分析方法以C值為因變量，以各單項指標耐熱系數和存活天數為自變量建立最優回歸方程，預測耐熱性數學模型，芝麻耐熱性鑒定回歸方程：

C=-1.50+0.024X1+1.49X2+0.27X3+0.25X6–0.16X7+0.04X10+0.07X11+0.18X12–0.14X14，該方程決定系數R2=0.998，F=2012.87，達到極顯著性水平（P＜0.001），Durbin-Watson 統計量d=2.68，充分說明該模型的解釋能力較強。從回歸方程式中可知，14 個單項指標中有9 個指標與C值存在顯著相關性（P＜0.05），分別為X1（SV）、X2（PH）、X3（DW）、X6（Pn）、X7（MDA）、X10（SOD）、X11（POD）、X12（CAT）和X14（H2O2），這9個指標可作為芝麻幼苗期耐熱性評價鑒定指標。

3 討論

高溫脅迫是影響植物生長發育的主要環境因子之一，對作物生長過程中所有階段均造成不同程度的損害，主要是造成植物細胞內穩態的不可逆轉的破壞、生理過程紊亂、代謝途徑的破壞、結構和功能蛋白質、代謝物和膜的降解，最終導致植物死亡[19-22]。研究[23-25]表明，高溫導致植物的生長受到抑制和干重顯著降低，主要是由于活性氧的過量積累導致膜脂過氧化程度加深，膜完整性喪失，葉綠素降解，光系統結構遭到破壞致使光合作用受到抑制。本研究發現，在20 份試驗材料中，高溫脅迫后各芝麻品種的株高、葉片干重、REC、葉綠素含量、Pn以及Fv/Fm均有不同程度下降，活性氧和MDA 含量均顯著提高，表明高溫脅迫能夠抑制芝麻的生長發育，與活性氧的過量積累導致的膜脂過氧化和光合作用下降密切相關。此外，為有效解除高溫脅迫導致過量活性氧的毒害作用，植物自身演化出一系列的抗氧化防御系統[26]，當植物感受到高溫脅迫壓力時通過提高這些酶的活性來增強自身的耐熱性。本研究發現，高溫脅迫后各芝麻品種的抗氧酶活性均提高，表明這些抗氧化酶在芝麻適應高溫逆境和自我防御保護中扮演著重要角色；而Pro 含量在各品種中呈現升高或降低趨勢，這可能是與不同芝麻品種的遺傳背景復雜有關。

植物的耐熱性是一種復雜性狀，由于這些性狀的遺傳控制具有多基因性質特征，其受多基因位點調控[27]。綜上可知，高溫脅迫能夠影響植物的多個數量性狀指標，且各指標之間存在相關性，存在信息交叉和重疊現象，因此，用單一性狀指標去衡量植物的耐熱性過于片面，可靠性不足，如何準確評價植物的耐熱性是選育耐高溫品種的基礎條件[28]。目前，對植物耐熱性的評價方法主要采用多元統計分析方法，即利用主成分分析和隸屬函數法將不同的測量指標轉換成新的個數較少和相互獨立的綜合指標，能夠反映出植物所有測量指標的大部分信息，計算出各材料間的耐熱性綜合指標值，從而準確評價各材料的耐熱性。龐強強等[29]在高溫脅迫下，利用主成分分析和隸屬函數分析對20 個菜心品種進行耐熱性評價，將21 個指標轉化為3 個獨立綜合指標，將20 份材料劃分為6 個耐熱等級，并篩選出熱害指數、POD活性、MDA、可溶性糖和H2O2等6 個指標作為關鍵綜合鑒定指標；靳路真等[8]通過測定155 份大豆材料的13 項指標，利用主成分分析轉換成6 個綜合指標，通過綜合得分值進行聚類分析，劃分出6個耐熱類型，篩選出百粒重、單株莢重、每莢粒數和蛋白質等7 個指標作為大豆開花期耐熱性評價指標，單株粒重、單株莢重、地上部干物重和株高等7 個作為大豆豉粒期耐熱性的評價指標；李敏等[30]對20 個小麥品種進行耐熱性分析，利用主成分分析將9 個測定指標轉化為3 個獨立綜合指標，利用隸屬函數法將不同小麥品種耐熱性劃分3 個等級，并篩選出SOD 活性、單穗粒重、CAT活性和MDA 含量等7 個指標作為小麥灌漿后期耐熱性的評價指標。這些結果充分說明，主成分分析和隸屬函數分析用于評價植物的耐熱性具有可靠性和高效性，同時也表明，同一時期不同的作物用于篩選耐熱性的評價指標不盡相同。本研究采用主成分分析、隸屬函數法、系統聚類和多元逐步回歸分析等分析方法對芝麻幼苗期耐熱性進行了綜合評價，使得芝麻耐熱性評價更加科學合理，可靠性強，避免了單一指標作為耐熱性評價的局限性和片面性。

近年來，芝麻種植區高溫頻繁發生，嚴重影響芝麻的生長發育，然而，對于芝麻耐熱性種質資源挖掘的研究較少。因此，對芝麻種質資源進行耐熱性評價，為挖掘耐熱性芝麻種質資源、選育耐熱性芝麻新品種及解析耐熱機理和遺傳分析提供了核心材料。本研究通過用歐式距離法對芝麻品種的C值進行耐熱性等級聚類分析，將20個品種劃分為6 類等級，其中耐熱型芝麻品種多源于河南，敏感型多分布于山東，表明芝麻耐熱性與材料的地理來源存在一定的關聯，可能是由于長期自然選擇的原因，仍需進一步擴大種質資源進行篩選驗證。本研究可為芝麻抗逆栽培、耐熱品種選育和改良提供優良的親本材料和科學依據。

4 結論

在高溫脅迫下，對20 個芝麻品種苗期進行耐熱性評價鑒定，將20 個品種劃分為6 個等級，其中篩選出強耐熱型品種2 個（SP117 和SP170）和高敏感型品種3 個（SP059、SP078 和SP184）；建立了芝麻苗期耐熱性評價數學模型，篩選出9個關鍵評價指標，可以快速鑒定芝麻的耐熱性，簡化了鑒定程序，提高了鑒定效率。