馬鈴薯種質資源抗病毒分子標記輔助篩選

婁樹寶 楊夢平 邢金月 翟玲俠 王輝 劉春生 王立春 宋繼玲

（1 黑龍江省農業科學院克山分院/國家馬鈴薯種質資源試管苗庫（克山），161005，黑龍江齊齊哈爾；2 青海大學農林科學院，810016，青海西寧）

馬鈴薯是世界第三大糧食作物，種植面積僅次于小麥和水稻[1]。目前，全球有160 多個國家和地區種植馬鈴薯，中國的馬鈴薯種植面積和總產量均居世界首位，但單產沒有達到世界平均水平[2]。馬鈴薯是無性繁殖作物，生長過程中會受到病毒的侵染并且不斷積累，導致種薯退化減產。病毒病是馬鈴薯生產上的主要病害之一，其危害程度僅次于晚疫病，是馬鈴薯生產中極難解決的問題[3]。自1916 年第一個馬鈴薯病毒病被發現以來，目前已發現40 多種病毒侵染馬鈴薯，我國已報道的有16 種[4-5]。危害我國馬鈴薯生產的主要病毒有PVX、PVY、PVS、PVM、PVA 和PLRV，其中馬鈴薯Y 病毒（PVY）危害最為嚴重[6]。PVY是馬鈴薯生產中最常見的一種病毒，可引起花葉、皺縮、壞死等癥狀。它是全球分布范圍最廣、破壞性最大的馬鈴薯病毒之一，幾乎遍布所有的馬鈴薯種植區[7]。馬鈴薯感染PVY 后一般減產50%，當與其他病毒復合侵染后，最高可減產80%[8]。馬鈴薯X 病毒（PVX）又稱普通花葉病毒，一般只產生輕微癥狀，產量損失可達10%～40%，若與PVY 或PVA 復合侵染可導致塊莖產量損失80%以上[9-10]。目前，針對馬鈴薯病毒病缺乏有效的防治措施，主要通過莖尖脫毒技術或者選育抗病毒的馬鈴薯品種，其中培育抗病毒品種是控制病毒最為簡便快捷、經濟有效的途徑[11-12]。

篩選高抗馬鈴薯病毒病的資源，發掘抗病基因對防控馬鈴薯病毒病具有重大的意義。隨著馬鈴薯病毒病抗性基因的克隆及抗性遺傳研究發展，開發分子標記進行輔助選擇，篩選出具有抗性基因的馬鈴薯品種是一個快捷、精準的方法[13-14]。在引起馬鈴薯病毒病的病毒中，PVY 和PVX 是危害比較嚴重的2 種病毒。目前已經發現3 個PVY抗性基因Ryadg[15]、Rysto[16]和Rychc[17]，對PVY 具有極端抗性。Ryadg來源于安第斯亞種（Solanum tuberosumssp.andigena），1996 年被定位在11 號染色體的末端[18]，根據Ryadg基因開發的標記RYSC3 在國外育種中已經成功應用[19-20]。Rysto是馬鈴薯抗PVY 的顯性基因，來源于S.stoloniferum[21]，該基因也定位在11 號染色體，開發的STS 標記YES3-3B 被用于檢測Rysto基因[22]。Rychc是顯性單基因，從日本品種‘Konafubuki’中發現，被定位在9 號染色體的末端[23]，根據該基因開發的STS 標記Ry186 用于檢測Rychc極端抗性[24]。Rx基因對PVX 具有極端抗性，可以快速地抑制病毒在最初感染的細胞中的積累[25]，Rx1來源于安第斯亞種，定位于12 號染色體上。Mori等[26]根據Rx1基因序列開發了STS 標記Rxsp，重組率為1.3%，說明其與Rx1緊密連鎖。

常規的抗病育種選擇周期長、效率低，選育過程需要花費大量的時間、財力和物力，但利用分子標記輔助育種（MAS），可在育種早期進行快速檢測，而且不受環境條件的限制，可加速育種進程，提高育種選擇效率。本研究利用與抗PVY的基因Ryadg、Rysto、Rychc緊密連鎖的分子標記RYSC3、YES3-3B、Ry186 和抗PVX 的基因Rx緊密連鎖的分子標記Rxsp，對102 份主要育成品種進行標記檢測，目的是篩選出具有多個病毒抗性基因的馬鈴薯品種，為馬鈴薯抗病毒育種提供寶貴資源，同時為馬鈴薯分子標記聚合育種提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試材料為國家馬鈴薯種質資源試管苗庫（克山）保存的102 份馬鈴薯種質資源的脫毒試管苗，主要選擇國內各育種單位近幾年登記的品種及部分野生種和原始栽培種。

1.2 馬鈴薯基因組DNA 提取

取試管苗頂部莖葉，使用天根DP-320 試劑盒提取基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測基因組DNA 質量，DNA 樣品保存于-20℃冰箱。

1.3 PCR 和電泳

分子標記信息見表1，由上海生工生物工程有限公司合成。PCR 反應體系20μL：2×TaqPCR Master Mix 10μL、正反引物各1μL、DNA 模板1μL、ddH2O 7μL。PCR 擴增程序為95℃預變性5min；95℃變性30s，55℃～59℃退火40s，72℃延伸1min，35 個循環；72℃延伸5min，4℃保存。PCR 結束后，取4μL 擴增產物與2μL 6×Loading Buffer 混勻，于1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，在紫外燈下觀察并拍照。

表1 分子標記信息Table 1 Information of molecular markers

2 結果與分析

2.1 基因組DNA 的提取

對供試的102 份材料進行基因組DNA 的提取。經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，DNA 主帶清晰，無拖尾、降解現象。各樣品間DNA 濃度均勻一致，純度高，質量好（圖1）。

圖1 DNA 濃度與質量檢測Fig.1 Examination of DNA concentration and quality

2.2 PVX 抗性基因分子標記Rxsp 的檢測

根據與馬鈴薯PVX 抗性基因Rx1連鎖標記Rxsp 的擴增結果（圖2）顯示，含Rxsp 標記的材料可以擴增出約1230bp 的特異性片段，102 份材料中有11 份材料含有Rxsp 標記，占供試材料的10.78%。

圖2 部分材料Rxsp 標記擴增Fig.2 The PCR of Rxsp marker of part of accessions

2.3 PVY 抗性基因分子標記RYSC3、YES3-3B、Ry186 的檢測

根據與馬鈴薯PVY 抗性基因Ryadg連鎖標記RYSC3 的擴增結果（圖3）顯示，含RYSC3 標記的材料可以擴增出約321bp 的特異性片段，102 份材料中有95 份材料含有RYSC3 標記，占供試材料的93.14%。含YES3-3B 標記的材料可以擴增出約284bp 的特異性片段（圖4），102 份材料中有101 份材料含有YES3-3B 標記，占供試材料的99.02%。含Ry186 標記的材料可以擴增出2～3 條帶（圖5），能夠擴增出587bp 的片段記為含有Ry186 標記，102 份材料中有35 份材料含有Ry186標記，占供試材料的34.31%。

圖3 部分材料RYSC3 標記擴增Fig.3 The PCR of RYSC3 marker of part of accessions

圖4 部分材料YES3-3B 標記擴增Fig.4 The PCR of YES3-3B marker of part of accessions

圖5 部分材料Ry186 標記擴增Fig.5 The PCR of Ry186 marker of part of accessions

2.4 102 份馬鈴薯品種病毒抗性標記分析

表2 列出了不同品種抗性標記的分布情況，其中只含有1 個標記的品種有4 個，占供試材料的3.92%；同時含有2 個標記的品種有62 個，占供試材料的60.78%；同時含有3 個標記的品種有30 個，占供試材料的29.41%；同時含有4 個標記的品種有6 個，占供試材料的5.88%。

表2 不同品種抗性標記分析Table 2 Analysis of markers of distinct varieties

3 討論

馬鈴薯是我國重要的糧菜兼用作物，但長期以來育種工作因為病毒感染而進展緩慢，很多優異材料在選種的過程中由于病毒侵染沒有及時脫毒處理而被淘汰掉，而隨著育種圃場規模的增加和病毒變異的加快，育種材料的脫毒工作日益繁重，因此，抗病毒育種在馬鈴薯育種工作中的重要性就凸顯出來。培育馬鈴薯抗病品種首先就需要擴大遺傳背景和豐富遺傳多樣性，鑒定并篩選出抗病品種是獲得抗病親本材料的最基礎有效的手段之一。常規的病毒抗性鑒定方法周期長、效率低，而分子標記輔助選擇運用分子標記技術可以快速篩選出具有不同抗性標記的材料。

本研究利用4 個與馬鈴薯病毒病抗性基因連鎖的分子標記（Rxsp、RYSC3、YES3-3B 和Ry186）對102 份馬鈴薯品種進行檢測，結果表明，所有檢測的材料至少含有1 個抗性標記，其中同時含2 個標記的品種最多，同時含4 個標記的品種只有6 份。在6 份野生種和原始栽培種中都至少含有2 個抗性標記，說明野生種和原始栽培種中含有豐富的抗病毒基因，這些資源的利用對馬鈴薯育種工作起著決定性的作用。生產實踐證明，在生產上能夠較長期發揮作用的品種，除了品質好、產量高等性狀外，抗病性好也是重要的原因，如克新1 號自1965 年開始推廣，由于高抗環腐病、抗PVY 和PLRV 并且耐旱和高產，到目前為止仍有較大種植面積[29]。

本研究表明，所有供試材料中含有YES3-3B標記的品種最多，為101 份，占供試材料的99.02%，含有Rxsp 標記的品種最少，為11 份，占供試材料的10.78%，這與黃鑫華等[30]的研究結果一致，并且檢測到隴薯10 號、冀張薯5 號和云薯401 同時含有RYSC3 和YES3-3B 標記，內薯7 號同時含RYSC3、YES3-3B 和Ry186 標記，大同里外黃同時含Rxsp、RYSC3 和YES3-3B 標記，這與黃鑫華等[30]研究結果也相符，但與白磊等[11]的研究結果不同。白磊等[11]研究認為，隴薯10 號不含RYSC3 和Ry186 標記、黑美人不含RYSC3 和Ry186 標記（本研究中黑美人同時含RYSC3 和YES3-3B 標記）、隴薯11 號只含RYSC3 標記（本研究中隴薯11 號同時含Rxsp、RYSC3、YES3-3B 和Ry186 標記），造成這一結果差異的原因還不清楚。本研究還檢測到克新23 號和克新25 號均含有RYSC3、YES3-3B和Ry186 標記，2 個品種是姊妹系，基因來源于同一個父母本。

分子標記技術作為一種輔助選擇手段，與人工接種病毒鑒定結果不能100%吻合，所以我們下一步的研究方向是對篩選出的含有多個抗性標記的材料進行人工接種鑒定，以確定其病毒抗性組成，并且依托國家馬鈴薯種質資源試管苗庫（克山）平臺，加大對資源庫保存資源病毒抗性分子標記的檢測，篩選出含有多個不同抗性標記的材料作為親本用于聚合育種，在育種早代進行分子標記檢測，結合產量、品質等性狀綜合評價，創造出聚合多個抗性基因的優異材料，提高育種效率，縮短育種年限，真正做到分子標記輔助選擇與聚合育種有效結合。

4 結論

本研究利用抗PVY 和抗PVX 基因的分子標記對102 份育成品種、野生種和原始栽培種進行標記檢測，結果表明，含有YES3-3B 標記的材料最多，占比99.02%；含有Rxsp 標記的材料最少，占比10.78%；只含有1個標記的品種有4個，占比3.92%；同時含有2 個標記的品種有62 個，占比60.78%；同時含有3 個標記的品種有30 個，占比29.41%；同時含有4 個標記的品種有6 個，分別是隴薯11號、S.acaule、富金、云薯105、晉薯8 號和大西洋，占供試材料的5.88%。