溫光敏兩系雜交小麥雜交種純度的表型和標記檢測比較

李宏生 李紹祥 楊忠慧 楊家李 劉琨熊世安 李富乾 郭輝 楊木軍

（1 云南省農業科學院糧食作物研究所，650205，云南昆明；2 云南農業大學農學院，650201，云南昆明；3 鎮雄縣種子管理站，657200，云南昭通）

雜種優勢利用是進一步提高作物單產的有效途徑之一[1-5]。小麥溫光敏兩系法具有無需保持系、恢復源廣且制種程序簡單的優點，已成為我國小麥雜種優勢利用的主要途徑[6-9]。兩系雜交小麥品種在示范推廣中表現出豐產、節水、抗旱和耐瘠等優勢，尤其在中低產田，增產可達20%以上[10-12]。對雜交種進行純度鑒定是雜交種生產和應用中必不可少的環節[13]。常用的純度鑒定方法是田間種植雜交種，抽穗后對植株表型進行檢測，該方法鑒定時間長，且準確性易受環境影響[14-16]。近年來，SSR 標記已成功應用于核心種質基因型分析[17-19]、小麥區域試驗品系DUS 測試[20-23]以及構建小麥DNA 指紋圖譜[24-26]等?；跓晒鈽擞汼SR 的毛細管電泳檢測法可得到目標DNA 片段的準確大小，具有穩定、準確和高效等特點，已廣泛用于大批量品種的鑒定和指紋圖譜檢測分析[27-29]。

為探索熒光標記SSR 在溫光敏兩系雜交小麥雜交種純度檢測中應用的可行性，本研究對2 個溫光敏兩系組合的雜交種采用田間種植表型鑒定和熒光標記SSR 進行了純度分析，比較2 種方法的準確性，建立快速鑒定雜交種純度的方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為小麥溫光敏核不育系K64S、恢復系20Y4-5、組合K64S/20Y4-5 和K64S/MR1238的雜交種，均由云南省農業科學院糧食作物研究所提供；恢復系MR1238 由綿陽市農業科學研究院選育提供。不育系K64S、恢復系20Y4-5、組合K64S/20Y4-5 和K64S/MR1238 的雜交種均為春性品種，在昆明均可常年種植并正常抽穗；2 個雜交種均來自1334m2（2 畝）的小規模制種試驗。K64S、20Y4-5 和MR1238 在昆明常年種植的株高分別為60～65cm、75～80cm 和90～95cm，雜交種的株高介于雙親之間。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料種植 試驗材料于2021 年5 月21 日播種于云南省農業科學院昆明嵩明試驗基地，該地海拔1920m，春性小麥材料全年均可種植，并可正常抽穗收獲。行長1.2m，采用點播，株行距10cm×25cm，每個雜交種播種1500 粒，每20 行種植1 行父本和1 行母本作為表型鑒定對照。

1.2.2 田間表型鑒定 因不育系與恢復系間株高差異明顯，植株抽穗揚花后到成熟期，以株高結合穗部性狀判斷每個單株表型，與不育系相同記為“1”，與恢復系相同記為“2”，不同于雙親的記為“3”（即為雜交種）。

1.2.3 SSR 標記基因型鑒定 基因組DNA 提?。弘s交種及其雙親生長到3 葉期，從2 個組合所有雜交種行區各隨機選574 個單株（加上2 個親本共計576 個單株，96 孔PCR 儀剛好運行6 次）掛牌編號、取葉片，同時取對應不育系、恢復系植株葉片，用植物基因組DNA 提取試劑盒[天根生化科技（北京）有限公司]提取待檢測樣品基因組DNA；用Nanodrop one 檢測DNA 濃度，用超純水將DNA 稀釋為10ng/μL 備用。取樣的雜交種植株于抽穗后逐株記錄表型純度鑒定結果。

從行業標準《NY/T 3749-2020 普通小麥品種純度鑒定SSR 分子標記法》推薦的10 對引物中選取8 對引物，篩選父母本間有多態性的引物，引物信息見表1。

熒光PCR 擴增體系10μL，包括基因組DNA 1μL、上、下游引物0.3μL、2×TaqPCR Master Mix 5μL、超純水補足至10μL。反應程序為95℃預變性5min；95℃變性30s，62℃～52℃退火30s，72℃延伸30s，運行10 個循環；95℃變性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s，運行25 個循環；最后72℃延伸20min。然后上機檢測，取3μL 熒光PCR 擴增產物，用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測熒光PCR 擴增條帶是否正常，并參照標準DNA Marker 將熒光PCR 產物稀釋至相同濃度，分別取每個稀釋后的熒光PCR 產物1μL 加入7μL 混有4‰Liz 500 內標的去離子甲酰胺，上ABI 3730XL 測序儀進行毛細管電泳檢測。

用峰圖分析軟件GeneMarker 2.0 讀取熒光PCR 擴增片段大小。

1.3 純度鑒定

通過表型鑒定和基因型鑒定分別計算雜交種純度。計算公式如下。

田間雜交種純度（%）=表型為“3”的植株數/播種雜交種總株數×100；

分子標記雜交種純度（%）=父母本雜合帶植株數/檢測雜交種總株數×100。

1.4 數據處理

采用SPSS 21.0 對數據進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 田間表型純度鑒定

組合K64S/MR1238 和K64S/20Y4-5 的雜交種分別播種1500 粒，各出苗1467 和1448 株。不育系K64S 平均株高62.3cm，變幅為61.2～63.1cm；恢復系MR1238 平均株高88.6cm，變幅為87.8～90.2cm；恢復系20Y4-5 平均株高75.6cm，變幅為74.3～76.9cm；K64S/MR1238 雜交種平均株高74.7cm，變幅為62.5～88.9cm；K64S/20Y4-5 雜交種平均株高69.3cm，變幅為62.4～74.4cm。2 個雜交種與其雙親間株高均差異明顯，以株高差異結合穗部性狀對2 個雜交種的純度進行表型鑒定，結果見表2。

K64S/MR1238 的雜交種中偽雜交種17 株，其中8 株為不育系，9 株為恢復系MR1238，純度為98.84%。

K64S/20Y4-5 的雜交種中偽雜交種30 株，包括23 株自交不育系和7 株恢復系，純度為97.93%。

2.2 SSR 標記篩選

8 對引物中，3 對引物在恢復系20Y4-5、MR1238與不育系K64S 間表現出多態性（表3，圖1），可用于2 個雜交種的純度鑒定。其中barc164在3 個親本間分別擴增出211、199 和208bp 片段；gwm161擴增出192、195 和174bp 片段；gwm610在2 個恢復系20Y4-5和MR1238上均分別擴增出189、189bp片段，在不育系K64S 擴增出193bp 片段，仍可用于純度鑒定，但如果制種中2 個組合相鄰種植，該標記不能區分雜交種中混雜的恢復系來源。因此，3 對引物中barc164和gwm161的檢測效果更好。

圖1 3 個親本的多態性引物峰圖Fig.1 The peak spectrum of polymorphic primers of three parents

表3 親本間多態性引物篩選Table 3 Polymorphic primer screening between parents

2.3 雜交種單株基因型檢測

根據上述SSR 引物篩選結果，選擇引物barc164對2 個雜交種進行純度檢測，并與對應表型鑒定結果進行比較（表4）。2 個組合雜交種隨機取樣的574 株表型鑒定純度分別為98.43%和97.74%，對應的SSR 標記檢測純度分別為97.73%和97.21%，經卡方檢驗兩種純度間差異不顯著，χ2檢測值分別為0.55（P=0.51）和0.62（P=0.49），說明分子標記鑒定與田間表型鑒定都可用于雜交種純度鑒定，且兩者間鑒定結果相近。574 株雜交種田間表型檢測純度分別為98.43%和97.74%，全部1467 株和1448 株雜交種的表型鑒定純度分別為98.84%和97.93%，經卡方檢驗兩者間純度差異不顯著，χ2檢測值分別為0.55（P=0.46）和0.07（P=0.79），說明隨機取樣的574 株雜交種的表型檢測純度與全部1467 株和1448 株雜交種的表型鑒定純度相同。

表4 574 株雜交種的表型和標記鑒定純度比較Table 4 Comparison of the purity of 574 hybrids tested by phenotype and marker identification

標記檢測發現，組合K64S/MR1238 的雜交種中有13 株偽雜種，包括4 株不育系、5 株恢復系MR1238 和4 株其他基因型，其雜交種純度為97.73%（表4）。4 株其他基因型偽雜種，其基因型為224bp/208bp 雜合帶型，MR1238 的barc164帶型為199bp（表3），4 株偽雜種單株占總鑒定數（574 株）0.70%，可能來自MR1238 中雜株。

組合K64S/20Y4-5 的雜交種中有16 株偽雜種，包括9 株不育系、4 株恢復系20Y4-5 和3 株其他基因型，其雜交種純度為97.21%。3 株偽雜種基因型為199bp/208bp 雜合帶型，20Y4-5 的barc164帶型為211bp，MR1238 的barc164帶型為199bp，該組合的雜交種出現199bp/208bp 雜合帶型的原因可能是制種中與上一組合的父本MR1238 發生“串粉”，因2 個組合試制種時相鄰種植，用吹風機輔助授粉時，少量MR1238 花粉越過隔離布與鄰田不育系K64S 授粉，導致K64S/20Y4-5 雜交種中出現199bp/208bp 帶型的雜交種。

3 討論

溫光敏兩系法雜交種的純度受恢復系純度、不育系純度和制種環境溫光條件的影響。雜交種純度直接影響雜種優勢的表現，種子純度每下降1 個百分點可直接導致作物減產約1%[30]，而且純度不達標的雜交種不能進入市場銷售。因此，雜交種在種子加工前必須進行純度檢測。

傳統的雜交種田間種植表型純度檢測法，需在異地或異季耗時一個生長季節（3～4 個月），如果雙親與雜交種間表型差異較小，還會影響鑒定結果的準確度。SSR 熒光標記毛細管電泳技術能夠檢測2bp 差異，分辨率較傳統銀染高[31-34]，本研究中也獲得相同結果，引物cfa2028 在父本20Y4-5 和母本K64S 間擴增出275bp 和277bp 片段，因此能精準鑒定雜交種在該位點的來源。此外，本研究篩選出3 個標記barc164、gwm161、gwm610可用于優勢組合K64S/MR1238 和K64S/20Y4-5 的雜交種純度檢測，其中barc164和gwm161標記較好；不同雜交組合可能有不同的純度檢測分子標記，需另行篩選確定。

分子標記利用種子即可進行基因型鑒定，進行純度估算。小麥溫光敏兩系雜交種分子標記檢測純度鮮有研究。為驗證分子標記檢測的適用性，本研究利用田間苗期取樣，表型與基因型相互對應，從而使表型鑒定與標記鑒定為同一材料，降低因材料不同而產生的隨機誤差。

本研究中2 個組合K64S/MR1238 和K64S/20Y4-5 雜交種的SSR 標記檢測純度（97.73%和97.21%）略低于田間表型鑒定純度（98.84%和97.93%），與匡猛等[35]和李倩等[36]在棉花和茄子雜交種的純度檢測結果一致，差異原因與2 種方法對偽雜種的區分程度有關。本研究中偽雜種來自小麥溫光敏不育系自交結實和父本的機械混雜或生物學混雜，SSR 熒光標記分析發現K64S/20Y4-5 雜交種中有3 株為母本K64S 與鄰田父本MR1238 花粉“串粉”產生的雜交種，雖然正季種植時2 個組合的雜交種株高相差約5cm，但在本次夏播田間種植表型鑒定中未能區分出來，加之2 個組合為同一母本，對表型鑒定有干擾，這也顯示了分子標記檢測純度的優點。同一品種或組合，在異季、異地種植時其表型與正季種植相比有一定差異，進而影響純度鑒定結果。

本研究同時用田間種植表型鑒定和SSR 熒光標記2 種方法對2 個溫光敏兩系雜交小麥雜交種的純度進行了測定，2 種方法的純度鑒定結果在2 個組合上都高度一致，無明顯差異，證明SSR 熒光標記不僅能準確檢測小麥雜交種純度，還能進一步鑒定偽雜種的來源，為制種中的防雜保純提供參考依據，因此可以替代田間種植表型鑒定法。同時該檢測方法7d 內即可獲得純度結果，為后續種子加工、銷售或新組合參加各種試驗提供了充足時間。

在利用SSR 熒光標記進行小麥雜交種純度檢測中，檢測樣本大小無疑對結果的準確性有影響。本研究中用于標記分析的樣本數約占田間種植總株數的1/3（574 株），準確鑒定純度所需最少樣本數還需進一步研究確定。

4 結論

通過田間種植表型鑒定和標記基因型鑒定對2 個小麥溫光敏兩系雜交種純度進行鑒定，發現分子標記鑒定不僅可區分雜交種中恢復系和不育系混雜，還可以區分其他恢復系花粉“串粉”等造成的偽雜種，且檢測周期短，可替代田間種植表型鑒定法。