紫花苜蓿胚性愈傷組織誘導及胚狀體分化研究

王曉春 高婷 楊煒迪 王川 陳彩錦

（1 寧夏農林科學院動物科學研究所，750000，寧夏銀川；2 寧夏農林科學院固原分院，756000，寧夏固原）

紫花苜蓿（MedicagosativaL.）被譽為“牧草之王”，具有適應性強、產草量高和營養豐富等優點，是世界各國人工草地和畜牧養殖中重要的草種[1]。近年來，隨著我國“振興奶業苜蓿發展行動”和“糧改飼”等政策的實施，苜蓿的種植面積逐漸擴大，已是我國種植面積最大的豆科牧草[2]。市場上流通的苜蓿種子主要是國外育成品種。紫花苜蓿傳統育種方法周期長，制約了育種速度，國產自主苜蓿品種的研發任重道遠。轉基因分子育種技術通過外源目的基因的高效轉化，可加速育種進程。

體細胞胚胎再生具有嵌合體少、多再生型和遺傳背景一致的優點[3]，是一種常用的高效遺傳轉化途徑。有關紫花苜蓿體胚途徑建立再生體系的研究相對較多，李玉珠等[4]以9 個苜蓿品種的下胚軸為外植體，通過不同激素配比，有2 個品種最終誘導出體細胞胚。溫之雨等[5]通過愈傷誘導和體胚誘導等幾個關鍵環節的研究，最終建立了紫花苜蓿品種三得利的高頻再生體系。但紫花苜蓿體細胞胚胎再生途徑依然存在培養周期長、分化率低和可重復性差等缺點。本研究以紫花苜蓿地方品種固原紫花為對象，開展不同外植體、激素種類和激素濃度配比的研究，旨在建立該品種高頻再生體系，為該品種的遺傳轉化提供穩定的受體。

1 材料與方法

1.1 材料及無菌苗培養

供試材料為紫花苜蓿地方品種固原紫花。將固原紫花干種子在水龍頭下沖洗，留下飽滿的種子，在超凈工作臺消毒，先用75%的酒精振蕩消毒1min，無菌水沖洗3 遍，再用0.1%升汞消毒15min，沖洗后接種在1/2 MS 培養基中培養。

1.2 外植體選取

取發芽7d 后無菌苗的下胚軸、莖段、子葉和健壯再生苗的幼嫩葉片和葉柄，并將下胚軸、莖段和葉柄切割成1cm 長小段，子葉和真葉劃割四邊，接種于誘導培養基內。

1.3 不同2,4-D 濃度對苜蓿愈傷/胚性愈傷組織的誘導

以MS 培養基為基本培養基，分別添加0、2、4、6、8mg/L 的2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）處理，接種下胚軸、莖段和子葉3 種外植體，每個處理20 瓶，每瓶15 個外植體。待完全脫分化后，轉入1/2 MS 培養基內分化，統計出愈率，記錄完全脫分化時間、愈傷組織狀態及體細胞胚發育情況。12d 繼代一次，繼代培養基為原培養基。

1.4 2,4-D 與不同細胞分裂素組合對苜蓿愈傷/胚性愈傷組織的誘導

以MS 培養基為基本培養基，通過低濃度（0.5mg/L）的細胞分裂素6-芐基氨基嘌呤（6-BA）、激動素（KT）與初篩出的2,4-D 濃度范圍進行組合，配方見表1。待完全脫分化后觀測出愈率，并記錄愈傷組織狀態及體細胞胚發育情況。

1.5 胚性愈傷組織/體胚苗的分化培養

將脫分化后的愈傷組織轉入分化培養基。分化培養基以1/2 MS 培養基為基本培養基，添加低濃度6-BA、KT 和NAA，設置6 個分化培養基處理：D0（不添加對照，CK）[6]、D1（0.5mg/L KT+0.1mg/L NAA）、D2（0.5mg/L KT+0.3mg/L NAA）[7]、D3（1.0mg/L KT+0.5mg/L NAA）[8]、D4（0.4mg/L KT）[9]、D5（2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA）[10]，D2 根據D3 降低了NAA 濃度。

1.6 再生苗的誘導及體細胞的分化

分化出的再生苗經培養基1/2 MS+0.1mg/L 吲哚丁酸（IBA）進行生根、壯苗培養后，以葉片和葉柄為外植體，再經誘導和分化培養，觀察再生苗的誘導、分化情況。

1.7 培養條件

所有培養基pH 均調至5.8，蔗糖濃度30g/L，瓊脂粉7.5g/L。在智能人工氣候箱內培養，溫度25℃±2℃，除愈傷階段暗處理，其他培養均為16h/8h 光暗周期，光照強度2000lx，每天觀察并及時挑揀出生菌的培養瓶。

1.8 數據處理

愈傷組織誘導率（%）=完全脫分化的愈傷組織數/接種的外植體數×100；分化率（%）=有體細胞胚發生的愈傷組織數/接種的愈傷組織數×100；成苗率（%）=發育出莖、葉的植株數/接種的有體胚發生的愈傷組織數×100。

利用Excel 對數據進行整理，用SPSS 17.0 軟件對結果進行Duncan 法多重比較。

2 結果與分析

2.1 不同濃度2,4-D 對苜蓿愈傷/胚性組織誘導的影響

由表2 可知，不添加2,4-D 的對照處理外植體誘導率為0.0%，與添加2,4-D 處理間差異顯著（P＜0.05）。當2,4-D 濃度為2、4mg/L 時，誘導率都達到100.0%，約24d 后完全脫分化，愈傷塊在顏色和質地上無明顯區別，但整體上前者比后者體積小。當2,4-D 濃度為6mg/L 時，誘導率下降為84.7%，愈傷塊體積較2,4-D 4mg/L 處理??；當增大到8mg/L 時，誘導率降到76.6%，愈傷塊體積最小，且在繼代培養過程中，脫分化愈傷組織開始褐化時間早于其他處理。由此可見，高濃度的2,4-D 對外植體愈傷化有抑制作用。

表2 不同濃度2,4-D 對苜蓿愈傷組織的誘導Table 2 Induction effects of different concentrations of 2,4-D on alfalfa callus

2.2 不同外植體的愈傷效果

將無菌苗的莖段、下胚軸和葉片3 種外植體分別放置在誘導培養基上誘導，誘導率均達到100.0%。下胚軸和幼莖放置3d 后愈傷化啟動，增粗，逐漸蓬松。大概4d 后可見葉片增厚（圖1）。下胚軸和幼莖愈傷速度前期稍快于葉片，但經繼代培養，24d 后都能完全脫分化，不同來源外植體愈傷組織在形態上無明顯區別。

圖1 固原紫花的不同外植體及對應的出愈狀態Fig.1 Different explants of Guyuan alfalfa and corresponding callus status

2.3 2,4-D 與不同細胞分裂素組合對苜蓿胚性愈傷組織誘導及分化的影響

常見的苜蓿胚性愈傷組織誘導是通過生長素2,4-D 與低濃度細胞分裂素6-BA、KT 的組合。通過2.2 結果可見，2,4-D 濃度在6mg/L 及以上時對苜蓿愈傷組織的誘導具有抑制作用。采用表1 配方，經過20～25d 的誘導，除了CK，其余10 個組合外植體都已完全脫分化，誘導率達到100%（表3）。當2,4-D 濃度為5mg/L 時，誘導出的愈傷塊體積略大于其他濃度，但愈傷塊在顏色和質地上無區別，說明1～5mg/L 2,4-D 組合0.5mg/L 的6-BA與KT 對愈傷組織的形成有促進作用。添加6-BA和KT 后形成的愈傷組織在質地上有區別，前者為黃綠色，后者整體偏白色（圖2）。

圖2 不同細胞分裂素（6-BA、KT）與2,4-D 組合形成的愈傷組織Fig.2 Callus formed by combinations of different cytokinins(6-BA,KT)with 2,4-D

表3 不同誘導培養基的愈傷塊的分化Table 3 Differentiation of callus in different induction media

分別將以上完全脫分化的愈傷塊轉入不添加任何激素且培養條件一致的分化培養基1/2 MS 中（參照李娟等[9]的文章），觀察分化出的胚狀體，統計分化率（表3）。

經過20～30d 的培養，主要形成2 種類型的愈傷組織，一種是有綠色球形胚或有綠色芽點的愈傷組織，多次繼代，不失活，屬于胚性愈傷組織；另一種是無組織狀態、繼代1 次后逐漸褐化、失活，為非胚性愈傷組織（圖3）。I1～I10 培養基誘導出的愈傷組織在1/2 MS 培養基內都分化出了胚狀體，但分化率都不高。添加6-BA 的組合（I1～I5）中，I2 組合的分化率最高（10.2%），I1 組合最低（7.2%）。添加KT 的組合（I6～I10）中，I7 組合的分化率最高（12.6%），I9 組合最低（7.4%）。由此可見，分化率最高的培養基2,4-D 添加濃度為2.0mg/L。不同濃度2,4-D 與6-BA 組合的胚狀體平均分化率為8.4%，與KT 組合的胚狀體平均分化率為9.4%，誘導培養基I7 分化率最高，2,4-D添加濃度為2.0mg/L、KT 為0.5mg/L。

圖3 2 種不同類型愈傷組織Fig.3 Two different types of calluses

2.4 不同分化培養基對胚性愈傷組織/體胚苗的影響

將添加2.0mg/L 2,4-D 組合0.5mg/L KT 的培養基誘導出的完全脫分化愈傷塊轉入分化培養基，如圖4 所示，5 個分化培養基胚狀體分化率均高于CK，其中D4 的分化率（42.7%）顯著高于其他處理（P＜0.05），D5 的分化率最低，略高于CK（P＞0.05）。

圖4 不同分化培養基內胚狀體/體胚苗的分化率比較Fig.4 Comparison of differentiation rates of embryo/seedlings in different differentiation media

2.5 再生苗的誘導分化培養

將以上分化出的再生苗經生根、壯苗培養（1/2 MS 培養基+0.1mg/L IBA）后擴繁，擴大再生苗數量。以再生苗的幼嫩葉片和葉柄為外植體，以不同濃度的2,4-D（1.0～8.0mg/L）組合0.5mg/L 6-BA、KT 培養基誘導，20d 后發現外植體均能100%誘導出胚性愈傷組織（黃綠色，有綠點），在不添加激素的分化培養基（1/2 MS）也分化出大量的胚狀體，且能分化為無根小苗，剝離出后在壯苗培養基里可發育成完整植株。

3 討論

3.1 不同來源外植體對苜蓿愈傷組織誘導及胚狀體分化的影響

紫花苜蓿體胚誘導途徑中常見的外植體有下胚軸、子葉、莖段、葉柄和根等，通常選擇生理代謝旺盛、分化程度較低的離體組織。下胚軸分化能力相對較強，是最佳外植體[11-12]。以子葉為外植體，可成功建立苜蓿高頻再生體系[13-14]。本研究發現，下胚軸和莖段出愈早于葉片，完全脫分化時間短于葉片2～4d，但經24d 誘導后，都能100%脫分化。不同外植體脫分化后的愈傷組織形態和質地沒有明顯區別。但有研究[10-15]顯示，體胚分化能力與外植體來源有關。本研究中，3 種外植體的愈傷組織轉入不添加任何激素的分化培養基后，分化率都較低，最終分化出胚狀體的愈傷組織很少，多數都失活并褐化死亡，無法比較不同外植體的體胚分化能力。

3.2 2,4-D 與不同細胞分裂素組合對苜蓿愈傷組織誘導及體細胞胚發育的影響

2,4-D 濃度是影響苜蓿愈傷組織誘導率的主要因素[16]。不添加2,4-D（CK）的培養基苜蓿誘導率為0.0%，而添加2,4-D 的培養基都有愈傷組織出現。當2,4-D 濃度為2、4mg/L 時，誘導率達100.0%；當濃度為8mg/L 時，誘導率最低，愈傷塊體積最小，開始褐化時間也早，說明高濃度的2,4-D 對苜蓿愈傷組織的誘導有抑制作用，這個結論與史毅等[10]研究結果一致。

2,4-D 在苜蓿愈傷組織的誘導和體細胞胚早期發育過程中起關鍵作用，且常與低濃度細胞分裂素配合使用[11]。王英哲等[13]研究顯示，2,4-D 與KT 組合能分化出胚狀體。張凌云等[7]認為，2,4-D與6-BA 組合是最佳誘導培養基。李玉珠等[4]研究顯示，在相同濃度2,4-D 培養基上，有的品種添加KT 能誘導出胚狀體，而有的品種添加6-BA 有胚狀體出現。本研究中，當2,4-D 濃度為1.0～5.0mg/L時，與0.5mg/L 6-BA 或KT 組合，都有胚狀體產生，但胚狀體分化率都較低，故有必要開展分化培養條件研究。

3.3 不同分化培養基對胚狀體分化的影響

高濃度的2,4-D 對苜蓿胚發生存在抑制作用[17]，故通常在愈傷組織脫分化后降低2,4-D 濃度或不添加。本研究發現，5 個添加激素處理（3個添加KT 組合NAA，1 個只添加KT，1 個添加6-BA 組合NAA）分化率都高于不添加激素的1/2 MS 培養基對照，說明添加低濃度的KT、6-BA 與NAA 組合以及單獨添加低濃度KT 對苜蓿體胚分化都有促進作用。細胞分裂素對促進體細胞胚成熟及進一步分化有顯著作用[18]。KT 有促進組織細胞分裂和分化不定芽的作用[8]，但KT 的添加不利于愈傷組織分化[19]。以上研究結果的不同可能與誘導愈傷組織的基本培養基、培養條件、苜蓿品種等因素有關。苜蓿體胚分化依然存在再生率不穩定和試驗重復性差等問題，應根據不同苜蓿品種開展相應的分化培養條件、激素種類和濃度等研究。

3.4 再生苗對高頻再生體系建立的影響

以再生苗為外植體，開展愈傷組織的誘導和分化，發現葉片和葉柄在不同濃度2,4-D（1.0～8.0mg/L）和低濃度6-BA、KT 組合下，在不添加激素的1/2 MS 培養基上均能100%產生體細胞胚，經剝離后都能發育成完整植株。從愈傷組織的誘導到完整植株的出現，與初代相比，再生周期縮短，植株更健壯，說明基因型是影響苜蓿體胚再生植株形成的最關鍵因素。這也驗證了Sairam 等[20]關于苜蓿愈傷組織的再生能力受基因型控制且高度遺傳的結論。由此可見，建立一個苜蓿品種穩定高頻的體細胞胚胎再生途徑，可先誘導、分化出少數再生植株，再進行大量擴繁，從而以再生植株的外植體建立再生體系。

4 結論

以苜蓿地方品種固原紫花為材料，通過2,4-D與不同細胞分裂素組合及胚狀體分化培養基的比較篩選，得出胚性愈傷組織誘導率最高的培養基為MS 基本培養基+2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT，誘導率為12.6%；分化率最高的培養基為1/2 MS+0.4mg/L KT，分化率為42.7%。以分化出的再生苗開展誘導、分化，很容易建立穩定的體胚高頻再生體系，可見苜蓿再生能力高度遺傳，高度依賴基因型。