外源褪黑素對干旱脅迫下紅小豆幼苗生長和產量的影響

姜珊 劉佳 曹亮 任春元 金喜軍 張玉先

（黑龍江八一農墾大學農學院，163319，黑龍江大慶）

紅小豆（Vignaangularis）為豇豆屬一年生草本植物，又名小豆、赤豆[1]。其營養價值高，具有生育期短、耐瘠薄、適應性廣等特點。黑龍江省大部分地區位于中溫帶，適宜種植食用豆類作物[2]，是我國重要的紅小豆主產區之一。但以雨養為主的農業生產模式決定了作物產量受自然降雨的影響較大，而黑龍江省受寒溫帶與溫帶大陸性季風氣候控制，春季年際間降水量變化大、分布不均引起的局部干旱是紅小豆生產中主要農業災害之一[3]。春旱嚴重抑制作物苗期生長[4-5]，進而在一定程度造成產量和品質下降。干旱脅迫導致氣孔關閉、活性氧（ROS）過度積累、細胞器遭到破壞，進而引起生理代謝功能發生紊亂，最終導致作物減產[6]。

褪黑素作為一種新型植物生長調節劑，在調節植物生長發育、抵抗逆境方面有重要作用。如褪黑素可以提高干旱脅迫下小麥的光合速率和葉綠素含量[7-8]，增強大豆苗期抗冷性[9]，提高高溫脅迫下黃瓜幼苗的抗氧化酶活性及抗氧化物質含量，減輕高溫對幼苗造成的傷害[10]，還可提高鹽脅迫下水稻幼苗的滲透調節能力，清除過量ROS，從而增強水稻幼苗耐鹽性[11]。

雖然大量研究證實了褪黑素在調控植物生長發育，尤其在促進逆境脅迫下植物生長和產量提高方面有積極作用。但目前缺少褪黑素調控紅小豆抗旱能力和產量的研究報道。因此，本研究通過盆栽控水方式模擬干旱脅迫，研究了葉面噴施褪黑素對干旱脅迫下苗期紅小豆抗旱和光合生理以及最終產量的影響，為實際生產中提高紅小豆產量提供理論依據和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2019 年在黑龍江省大慶市國家雜糧工程技術研究中心試驗基地遮雨大棚進行，以黑龍江省主栽紅小豆品種珍珠紅為供試材料，褪黑素購自Sigma 公司。

盆栽塑料桶（高33cm，直徑30cm）桶底鋪雙層紗網，鉆6 個直徑1cm 小孔。培養基質為珍珠巖、蛭石和黑鈣土，按照1:3:12 的比例混合均勻，每桶裝入16kg 混合基質。挑選大小均勻、無破損和病斑的紅小豆種子，先用5% NaClO 溶液消毒10min，再用蒸餾水反復沖洗5 次，放置于陰涼通風處陰干。播種前用自來水將培養土澆透，次日均勻擺放9 粒紅小豆種子后，表面覆蓋2kg 混合基質。待紅小豆幼苗達到V1 期定苗，每盆保留3 株。在播種完成后，通過環刀法測定田間水量，并通過烘干法測出每桶干土重量，用于計算控水標準。

1.2 試驗設計

于V2 期選取長勢一致的材料平均分成3 組，采用定期稱重法結合定量控水逐漸控制土壤含水量達到目標含水量。設置3 個處理，分別是正常供水（對照，CK，維持80%田間持水，每天18:00通過稱重法確定蒸發和蒸騰失水量，采用量筒補充水分）、干旱脅迫處理（D，每天18:00 通過稱重法確定蒸發和蒸騰失水量，直至達到50%田間持水量后，采用量筒補充每天損失水分以維持50%田間持水量）、干旱脅迫下葉面噴施褪黑素處理（D+M，控水和補充水分方式與D 處理相同，并于控水當晚20:00 開始葉面噴施100μmol/L 褪黑素，此濃度為前期預備試驗明確，連續噴施葉片5d），CK 和D處理葉面噴施等量蒸餾水。噴施褪黑素當天記為第1 天，達到干旱脅迫（50%田間持水量）為第7 天，分別于10、15、20、25、30d 取樣（25d 取樣后復水），測定相關指標。3 個處理分別取樣5 次，每個處理每次取樣5 盆用于測定生理指標或形態指標，成熟期每個處理保留5 盆用于測產，共計播種90 盆。

1.3 測定項目與方法

1.3.1 氣體交換參數 于取樣當天9:00 選取完全生長的倒2 葉片采用Li-6400 光合儀（LiCor，Huntington Beach，CA，美國）測定凈光合速率（Pn）、葉片氣孔導度（Gs）、蒸騰速率（Tr）、胞間CO2濃度（Ci）。測定光強為1200μmol/(m2·s)，CO2供應濃度為400CO2/mol，葉片溫度25℃，相對濕度約25%，每個處理5 次重復。

1.3.2 葉綠素熒光分析 葉綠素熒光參數采用便攜式葉綠素熒光儀（FMS-2，Hansatech）在設定光強下測定紅小豆葉片的測定植株頂部向下第2片完全展開功能葉片的葉綠素熒光參數。測定前將葉片暗適應15min，以弱檢測光測定初始熒光（Fo），之后以飽和脈沖光測定最大熒光（Fm）。當熒光從Fm回落至接近Fo時，以連續的作用光測定穩態熒光（Fs）；之后疊加一個飽和脈沖光，測定光下最大熒光（Fm'）；最后關閉作用光，并立即打開遠紅光，測定光下最小熒光（Fo'）；可變熒光（Fv）=Fm–Fo，PSⅡ的最大光化學效率=Fv/Fm、PSⅡ的量子產額（ΦPSII）=(Fm'–Fs)/Fm、最大光能轉化潛力（Fv/Fo）=(Fv/Fm)/(1–Fv/Fm)，每個處理3 次重復。

1.3.3 葉綠素和碳水化合物含量 稱取0.2g 紅小豆倒2 葉功能葉片浸泡于20mL 無水乙醇中，常溫暗處理24h，參照胡秉芬等[12]方法測定葉綠素含量，按照以下公式計算，

葉綠素a（Chl a）=13.95OD665–6.88OD649

葉綠素b（Chl b）=24.96OD649–7.32OD665

總葉綠素含量=Chl a+Chl b

參照文獻[13-14]測定可溶性糖、蔗糖、果糖和淀粉含量。

1.3.4 抗氧化酶活性 取樣當天取完成生長的倒2葉放入液氮中30min，然后儲存于-20℃用于測定抗氧化酶活性。根據文獻[15]測定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性，根據文獻[16]測定抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性，每個處理3 次重復。

1.3.5 滲透調節物質和膜脂過氧化水平 采用磺基水楊酸法測定游離脯氨酸（Pro）含量，采用考馬斯亮藍G-250 比色法[17]測定可溶性蛋白含量，采用硫代巴比妥酸法（TBA）[18]測定丙二醛（MDA）含量，用電導率儀（DDS-307）[19]測量相對電導率，采用Chaitanya 等[20]的方法測定超氧陰離子（O2–.）含量，參照Mukherjee 等[21]的方法測定H2O2含量。

1.3.6 形態指標和產量 于處理后10、15、20、30d每次取樣5 盆（共15 株），采用直尺測量株高（cm），采用游標卡尺測量莖粗（mm），采用天平測定地上和地下部分（根系）干重（g），采用Yaxin-1241葉面積儀測量葉面積（mm2）。

于成熟期進行收獲測產，每個處理取5 盆（共15 株），進行單株莢數、單株粒數、單株粒重和百粒重的考察，以單株粒重表示產量。

1.4 數據處理

用SPSS 2.0 軟件進行數據統計分析，用Excel作圖。

2 結果與分析

2.1 褪黑素對干旱脅迫條件下紅小豆幼苗生長的影響

如表1 所示，干旱脅迫對紅小豆幼苗株高和莖粗起明顯抑制作用。與CK 相比，D 處理后25d 內株高、莖粗、葉面積、地上和地下干重降低幅度分別為16.37%～29.09%、10.13%～14.96%、14.93%～23.90%、12.79%～43.52%和18.18%～45.45%，并隨著干旱脅迫時間延長抑制作用越明顯。施用外源褪黑素可以提高紅小豆株高和莖粗，與D 相比，D+M處理后25d 內上述指標提高幅度分別為7.04%～14.37%、3.65%～6.44%、12.12%～17.74%、7.41%～29.55%和6.59%～22.58%。結果表明，褪黑素在一定程度上能夠緩解干旱脅迫對紅小豆生長的抑制。

表1 干旱脅迫條件下褪黑素對形態指標的影響Table 1 Effects of melatonin on growth of adzuki bean seedlings under drought stress

2.2 褪黑素對干旱脅迫下紅小豆抗逆生理指標的影響

2.2.1 對抗氧化酶活性的影響 如圖1 所示，干旱脅迫顯著提高了紅小豆葉片內SOD、POD、APX和CAT 活性，隨干旱脅迫時間的延長SOD、POD、APX 和CAT 活性呈先上升后下降的趨勢。與CK相比，D 處理后20d 內葉片SOD、POD 和APX 活性提高幅度分別為7.72%～28.36%、9.61%～17.02%、8.23%～14.94%，CAT 活性在25d 內提升幅度為17.21%～33.01%。施用褪黑素可提高干旱脅迫下葉片內SOD、POD、APX 和CAT 活性，與D 處理相比，D+M 處理后25d 內葉片SOD、POD、CAT 和APX 活性提高幅度分別為2.79%～10.78%、2.08%～24.39%、2.52%～19.38%、1.72%～9.37%。復水后，D+M 處理SOD、POD、CAT 和APX 活性仍高于D處理，由此可知，外源褪黑素可顯著提高干旱脅迫下紅小豆葉片內抗氧化酶活性，緩解干旱脅迫對葉肉細胞的氧化損傷，提高紅小豆的抗旱能力。

圖1 干旱脅迫下褪黑素對抗氧化酶活性的影響Fig.1 Effects of melatonin on antioxidant enzyme activities under drought stress

2.2.2 對膜脂過氧化與滲透調節物質的影響 如圖2 所示，干旱脅迫導致紅小豆葉片中、MDA和H2O2含量顯著上升，并隨著干旱脅迫時間的延長呈先上升后下降的趨勢。與CK 處理相比，D 處理后25d 內葉片中、MDA 和H2O2含量分別增加了34.76%～68.96%、30.16%～44.94%、18.01%～38.89%。施用外源褪黑素在一定程度上降低了、MDA 和H2O2含量，與D 處理相比，D+M 處理后25d 內葉片中、MDA 和H2O2含量分別降低13.02%～43.13%、12.70%～23.60%，8.87%～20.30%。復水后D 處理的、MDA 和H2O2含量仍高于D+M 處理。由此可知，干旱脅迫下褪黑素可以降低葉片中ROS（H2O2和）含量，緩解葉片中ROS 對植物細胞的損傷，且復水后褪黑素可以提高植株恢復能力，維持植株葉片組織ROS的平衡。

圖2 干旱脅迫下褪黑素對膜脂過氧化的影響Fig.2 Effects of melatonin on membrane lipid peroxidation under drought stress

干旱脅迫造成紅小豆葉片中滲透調節物質可溶性蛋白、Pro 含量和相對電導率顯著提高。與CK相比，D 處理可溶性蛋白、Pro 含量和相對電導率分別增加8.89%～21.76%、8.33%～43.33%、20.00%～27.69%。施用外源褪黑素可進一步增加可溶性蛋白和Pro 含量，降低相對電導率，與D 處理相比，D+M 處理25d 內葉片中可溶性蛋白和Pro 含量分別增加了3.80%～7.50%、0.53%～11.31%，相對電導率降低了5.36%～16.67%。復水后經D 處理的滲透調節物質含量及相對電導率仍高于D+M 處理。由此可知，干旱脅迫下葉片滲透調節物質顯著增加，葉片相對電導率上升，外源褪黑素可進一步增加滲透調節物質的含量，降低滲透勢和相對電導率，穩定葉片細胞結構，進而增強抗旱能力。

2.3 干旱脅迫下褪黑素對紅小豆光合生理指標的影響

2.3.1 對光合參數的影響 由圖3 所示，干旱脅迫顯著降低了紅小豆Pn、Tr、Gs和Ci，隨著干旱脅迫時間的延長呈逐漸下降趨勢。與CK 相比，D 處理后25d內上述指標分別下降了32.13%～49.87%、18.90%～58.26%、21.57%～46.12%和11.60%～27.97%。噴施外源褪黑素可以緩解干旱脅迫下紅小豆Pn、Tr、Gs和Ci的降低，與D 處理相比，D+M 處理后25d 內上述指標分別增加了8.65%～28.55%、8.00%～35.65%、6.53%～15.54%和4.56%～12.78%。復水后D+M 處理上述指標的恢復效果較D處理更好，但D和D+M處理均未恢復到CK 水平。由此可知，外源褪黑素處理能有效提高紅小豆在干旱脅迫下葉片光合能力，促進葉片中物質積累。

圖3 干旱脅迫條件下褪黑素對紅小豆光合參數的影響Fig.3 Effects of melatonin on photosynthetic parameters of adzuki bean under drought stress

2.3.2 對熒光參數的影響 由圖4 可知，干旱脅迫顯著降低了光系統Ⅱ的Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ和表觀電子傳遞速率（ETR）。與CK 相比，D 處理25d 內葉片中Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ和ETR 分別下降了4.76%～44.12%、3.97%～22.01%、5.08%～31.67%、4.73%～31.92%。施用外源褪黑素不同程度地緩解了干旱脅迫下上述指標的下降程度，與D 處理相比，D+M 處理25d 內上述指標分別增加了1.64%～18.18%、2.68%～10.71%、5.08%～19.61%和1.44%～15.60%。復水后經褪黑素處理的Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ和ETR 恢復效果較D 處理更好，但均未達到顯著水平。因此，外源褪黑素處理能有效提高紅小豆在干旱脅迫下葉片熒光參數，提高光合效率。

圖4 干旱脅迫條件下褪黑素對紅小豆葉綠素熒光參數的影響Fig.4 Effects of melatonin on chlorophyll fluorescence parameters of adzuki bean under drought stress

2.3.3 對光合色素含量的影響 由圖5 可知，干旱脅迫顯著降低了葉片中葉綠素a、葉綠素b 和總葉綠素含量，隨著干旱脅迫時間的延長，上述指標的下降幅度逐漸增大。與CK 相比，D 處理25d 內葉片中葉綠素a、葉綠素b 和總葉綠素含量分別下降了17.54%～43.66%、8.22%～41.98%、15.66%～42.77%。施用外源褪黑素不同程度地緩解了干旱脅迫下葉綠素a、葉綠素b 和總葉綠素含量下降程度，與D處理相比，D+M 處理后25d 內上述指標分別增加了10.77%～15.74%、7.09%～28.51%和9.60%～15.52%。復水后D+M 處理的光合色素含量較D 處理恢復效果更好，但仍未達到顯著水平。因此，施用外源褪黑素處理可在一定程度上緩解干旱脅迫下光合色素的降低，促進葉片對光能的吸收。

圖5 干旱脅迫條件下褪黑素對紅小豆光合色素含量的影響Fig.5 Effects of melatonin on photosynthetic pigment contents of adzuki bean under drought stress

2.3.4 對糖類物質含量的影響 由圖6 可知，干旱脅迫顯著提高了葉片內果糖、蔗糖和可溶性糖含量，降低了淀粉含量?？扇苄蕴呛偷矸酆侩S干旱脅迫時間延長呈逐漸下降趨勢；果糖和蔗糖含量則呈先上升后下降趨勢。與CK 相比，D 處理后25d內葉片中果糖、蔗糖和可溶性糖含量分別增加了7.30%～18.44%、14.91%～36.18%、22.52%～30.45%，淀粉含量下降了19.06%～35.70%。施用外源褪黑素顯著提高了干旱脅迫下果糖、蔗糖和可溶性糖含量，降低淀粉含量，與D 處理相比，D+M 處理后25d 內果糖、蔗糖和可溶性糖含量分別增加了4.24%～8.36%、6.96%～20.12%、3.73%～15.93%，淀粉含量降低了9.41%～18.53%。復水后，D 和D+M處理的糖類物質含量均上升，其中D+M 處理果糖和蔗糖含量顯著增加。因此，施用外源褪黑素處理在一定程度上可提高干旱脅迫下碳水化合物（果糖、蔗糖和可溶性糖）含量。

圖6 干旱脅迫下外源褪黑素對紅小豆糖類物質含量的影響Fig.6 Effects of exogenous melatonin on sugar contents of adzuki bean under drought stress

2.4 對產量構成因素的影響

如表2 所示，干旱脅迫降低了紅小豆植株單株莢數、單株粒數、百粒重和單株粒重。與CK 相比，D 處理分別降低了13.89%、7.29%、4.82%和6.82%。施用外源褪黑素處理可提高干旱脅迫下單株莢數、單株粒數、單株粒重和百粒重，與D 相比，D+M處理下單株莢數、單株粒數、百粒重和單株粒重分別提高了2.14%、4.65%、0.36%和5.20%，可見外源褪黑素可防止干旱脅迫對產量構成因素的影響，最終避免減產。

表2 干旱脅迫條件下褪黑素對產量構成因素的影響Table 2 Effects of melatonin on yield components under drought stress

3 討論

干旱脅迫下植物體內活性氧動態平衡被打破，產生過量ROS，導致膜脂過氧化，褪黑素通過提高抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX）活性來清除過量的ROS，緩解干旱帶來的氧化損傷[22-23]。本試驗研究表明，干旱脅迫下紅小豆葉片內電導率、、MDA 和H2O2含量增加，說明葉肉細胞內ROS過度積累使細胞膜受到干旱帶來的損傷，褪黑素處理下的葉肉細胞內抗氧化酶活性增加，能清除MDA 和H2O2，維持細胞內動態平衡。在復水后干旱脅迫處理下，抗氧化酶活性有所提高但仍低于CK 處理，而褪黑素處理的抗氧化酶活性高于干旱處理，這有可能與褪黑素使細胞內維持更好的穩定性有關。在逆境下植物通過提高滲透調節物質的方式降低滲透勢，維持細胞內滲透勢平衡[24]，本試驗中，紅小豆在苗期受到干旱脅迫使葉肉細胞內滲透調節物質（Pro 和可溶性蛋白）含量增加，經褪黑素處理后使其進一步提高，維持細胞內滲透勢平衡及細胞膜的完整性，從而提高紅小豆對干旱環境的抵抗能力。

綠色植物吸收光能進行光合作用，葉綠素是光合作用的基礎。干旱脅迫會抑制植物光合作用及營養生長，最終導致產量降低[25]。隨干旱脅迫程度加劇，葉肉細胞內生理生化過程發生改變，阻礙葉綠素合成并加快其分解速度，使葉綠素含量迅速降低[6,26]。本試驗表明，干旱脅迫顯著抑制葉綠素a、葉綠素b 和總葉綠素含量，降低Pn、Tr、Gs和Ci，并隨著干旱脅迫時間延長呈不斷降低趨勢。在干旱脅迫下噴施褪黑素后葉綠素含量上升，Pn、Tr和Ci顯著升高，這可能是由于褪黑素改善了干旱下葉片氣孔狀態，促進葉片吸收更多光能。

Bakhshandeh 等[27]研究表明，干旱降低植物光合速率的同時，Fv/Fm和Fv/Fo也降低，光合作用的電子傳遞和光合原初反應過程減慢，導致光系統PSⅡ損傷。本研究發現，干旱脅迫下紅小豆Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ和ETR 隨著干旱時間的延長而下降。褪黑素處理在干旱初期的作用不顯著，但隨著干旱程度加劇，其Fv/Fm、Fv/Fo和ΦPSⅡ較干旱脅迫仍維持較高的水平，這可能與褪黑素提高了干旱脅迫下紅小豆葉片內葉綠素含量有關。研究發現，施用褪黑素可緩解葉綠素降解，提高Fv/Fm和ΦPSⅡ，促進玉米[28]和蘋果[29]葉片的光合作用。

光合作用最終產物是碳水化合物，包括可溶性糖、蔗糖、果糖和淀粉，干旱脅迫使光合速率下降，光合產物產生速率減慢，碳水化合物的合成減慢[30]。本研究表明，褪黑素處理在干旱脅迫下提高了蔗糖和果糖含量，但淀粉含量卻顯著下降，可能是褪黑素降低了干旱脅迫下CO2同化過程中磷酸丙酮酶轉化淀粉的能力。

苗期干旱脅迫抑制植株前期營養生長，進而造成作物產量下降，這是由于干旱脅迫抑制植物光合作用，碳水化合物合成受阻，同時植物體內產生過量ROS，細胞內動態平衡被打破，細胞膜受損，致使營養物質用于修復受損的機體，最終導致作物產量下降[31]。秦彬[32]研究表明，褪黑素對苗期干旱下綏農26 和黑農48 的株高、根長、單株莢數和單株粒重有促進作用，進而提高單株產量。本研究發現，隨著干旱時間的延長，紅小豆株高、莖粗和根長顯著降低，長期干旱使紅小豆單株莢數及單株粒數降低，單株粒重下降，進而百粒重減少。經過褪黑素處理的紅小豆在干旱脅迫后其形態和產量較干旱脅迫處理均有所提高，這是由于褪黑素可提高紅小豆的光合作用，提高抗氧化酶活性，清除ROS，緩解細胞內氧化損傷，促進碳水化合物的合成。

4 結論

干旱脅迫對苗期紅小豆營養生長和收獲期產量均起抑制作用。干旱脅迫下施用外源褪黑素可顯著促進紅小豆幼苗株高、葉面積和干物質積累，提高抗氧化酶活性，降低H2O2和MDA 含量，提高光合色素含量，改善光合和熒光參數，提高碳水化合物（蔗糖、果糖、可溶性糖）含量，最終可在一定程度上提高單株粒數，促進單株產量提高。