氟磺胺草醚脅迫紅小豆幼苗代謝物及通路分析

楊建 湯華成,3,4 曹冬梅,3,4 崔航 婁雨豪 王冀菲 張東杰

（1 黑龍江八一農墾大學食品學院，163319，黑龍江大慶；2 黑龍江省農產品加工與質量安全重點實驗室，163319，黑龍江大慶；3 黑龍江省雜糧加工及質量安全工程技術研究中心，163319，黑龍江大慶；4 國家雜糧工程技術研究中心，163319，黑龍江大慶；5 北大荒現代農業產業技術省級培育協同創新中心，163319，黑龍江大慶）

紅小豆是我國重要的雜糧作物之一[1]，其苗期易受雜草影響，導致產量下降，因此，合理使用除草劑既可以控制雜草，又可以減少藥害，達到有效種植，確保紅小豆增收增產。氟磺胺草醚（fomesafen，FSA）又稱虎威，屬于二苯醚類除草劑，其主要作用于原卟啉原氧化酶[2]，因其除草效率高、選擇性好[3]，可被雜草葉片及根部吸收，抑制雜草光合速率及對有機物和能量汲取，從而達到除草效果[4]，目前已廣泛用于大豆[5]、番茄[6]、小麥[7]、草莓[8]和玉米[9]等田間闊葉類雜草的防除。研究[10]表明，用25%FSA·烯草酮乳油對綠豆和紅小豆田間闊葉雜草防除效果較好。紅小豆田間噴施25%FSA 能使紅小豆增產[11]。但田間噴施FSA 影響大豆幼苗的光合速率[12]，抑制幼苗蔗糖代謝和碳代謝過程，阻礙同化產物的合成和運輸，影響大豆根瘤的能量供應[13-14]。

代謝組學是系統生物學的一個分支，在研究環境因素作用下的特定代謝型具有較高的靈敏度，在環境變化對機體的影響研究等方面具有優勢[15-16]。前人[17]研究表明，采用LC-MS 技術分析樂果對小鼠的影響，在尿液中篩選出12 種差異代謝物，在血漿中篩選出13 種差異代謝物，且代謝物二甲基硫代磷酸和二甲基二硫代磷酸在所有的差異代謝物中最為顯著。利用LC-MS 方法檢測吡蟲啉對蜜蜂羽化出房時代謝物的影響，共鑒定出18 種差異代謝物，主要調控鳥苷酸代謝和能量代謝等途徑，對蜜蜂的生長發育產生顯著影響[18]。利用代謝組學技術研究了惡唑烷酮對玉米幼苗代謝產物的影響，檢測到90 多種代謝產物，其中24 種差異顯著，這些差異代謝物參與玉米幼苗的能量和蛋白質代謝[19]。

目前，已有文獻[10-11]報道，FSA 在紅小豆田間具有良好的除草效果，但其在田間施用后對紅小豆幼苗生長代謝影響的相關研究未見報道。因此，本研究以紅小豆幼苗為研究對象，利用LC-MS 技術探究FSA 脅迫紅小豆幼苗生長過程中代謝物及代謝通路變化情況，為紅小豆田間使用FSA 的安全性評價提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗紅小豆品種為珍珠紅。試驗試劑為25%氟磺胺草醚水劑；甲醇、乙腈、甲酸和異丙醇均為色譜純，2-氯-L-苯丙氨酸（純度≥98%）。

1.2 儀器與設備

試驗所用設備如下，冷凍離心機（Centrifuge 5430 R）、多樣品冷凍研磨儀（Wonbio-96 c）、臺式快速離心濃縮干燥器（LNG-T 88）、氮氣吹掃儀（JXDC-20）、UHPLC 液相色譜系統（Vanquish Horizon system）、質譜儀（Q-ExactiveHF-X）。

1.3 試驗設計

1.3.1 FSA 脅迫紅小豆種植試驗及樣品采集 挑選出籽粒大小均勻、飽滿的紅小豆種子，用去離子水洗去表面污漬后，浸泡于30%H2O2溶液中消毒5min，再用去離子水沖洗，直到泡沫完全消失，晾干后備用。根據除草劑FSA 的推薦使用量進行紅小豆萌發試驗。每盆種50 粒，每3 盆為1 個處理，每個處理3 個重復，以未噴藥為空白對照，待紅小豆苗長到2～3 葉時用除草劑FSA（0.3mL/m2）進行噴施，噴藥次數為2 次，間隔時間為14d，第2 次噴藥結束7d 后，對紅小豆幼苗進行采樣（即紅小豆幼苗為5 葉時），采集未噴施FSA 的紅小豆幼苗為Z-2-ZZ 組，噴施FSA 的紅小豆幼苗為Z-2-ZZ-2組，所有采集樣品置于-20℃冰箱中儲存備用。

1.3.2 樣品處理 準確稱取50mg 樣品至2mL 離心管中，加入一顆直徑為6mm 的研磨珠和400μL提取液[甲醇:水=4:1（v:v）]，在冷凍組織研磨儀研磨6min（-10℃，50Hz），再用低溫超聲提取30min（5℃，40kHz），將樣品于-20℃條件下靜置30min，離心15min（13 000g，4℃），移取上清液至帶內插管的進樣小瓶中上機分析。最后每個樣本分別移取20μL 上清液混合后作為質控樣本。

1.3.3 LC-MS 檢測 色譜條件參考林立銘等[20]的檢測條件。質譜條件參照王琪琪[21]的檢測條件并稍作修改，毛細管溫度325℃，加熱溫度425℃，分辨率7500MS2。

1.4 數據處理

使用ProgenesisQI（美國）軟件進行峰提取等預處理，并將提取的特征峰在公共的代謝組數據庫KEGG 和HMDB 進行搜庫鑒定，匹配出的代謝集用ropls（R）軟件進行多元統計分析，結合Student’s t 檢驗的P＜0.05 和正交偏最小二乘―判別分析（OPLS-DA）中VIP＞1 篩選出差異代謝物，最后對代謝物進行KEGG 通路富集分析。

2 結果與分析

2.1 FSA 脅迫下紅小豆幼苗主成分分析（PCA）

PCA 圖直觀地反映樣本中代謝物的豐富度情況，樣本間位置越近則越相似，越遠則反之[22]。對Z-2-ZZ-2 組與Z-2-ZZ 組進行差異代謝物主成分分析，并繪制得分圖。由圖1 可知，2 組樣本除少數點外，其余都在95%置信圈內，Z-2-ZZ-2 組與Z-2-ZZ 組的主成分明顯不同，分別位于置信圈的左右兩側。從分布模式來看，正離子模式下，置信圈內右側的Z-2-ZZ-2 組樣本存在部分重疊現象，可能是因為相同處理樣本的代謝物具有相似性造成的；負離子模式下，置信圈左側6 個平行樣品間的距離更近，說明6 個樣本代謝物鑒定結果十分相近。

圖1 紅小豆幼苗Z-2-ZZ-2 組和Z-2-ZZ 組主成分分析得分圖Fig.1 Scores of principal component analysis of adzuki bean seedlings in Z-2-ZZ-2 and Z-2-ZZ groups

2.2 FSA 脅迫紅小豆幼苗正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）

OPLS-DA 可剔除PCA 中不相關的變量，計算出VIP 值，用于差異代謝物的篩選[23]。通過對Z-2-ZZ-2 組和Z-2-ZZ 組進行OPLS-DA 置換檢驗分析，由圖2 可知，正離子模式下，R2X累積=0.75，R2Y累積=1，Q2=0.997，負離子模式下，R2X累積=0.79，R2Y累積=1，Q2=0.998，都比較接近于1，說明模型的預測能力和穩定性較好。經過200 次置換檢驗后，正負離子模式下的R2和Q2的回歸直線均與縱坐標相交且Q2分別為-0.201 和-0.1971，說明模型具有有效性和可靠性，不存在過擬合現象。

圖2 紅小豆幼苗Z-2-ZZ-2 組和Z-2-ZZ 組OPLS-DA 置換檢驗結果Fig.2 OPLS-DA replacement test results of adzuki bean seedlings in Z-2-ZZ-2 and Z-2-ZZ groups

2.3 FSA 脅迫下紅小豆幼苗差異代謝物數量和類別鑒定結果

由圖3 可知，紅色點表示差異代謝物的表達量呈上調趨勢，藍色點表示差異代謝物的表達量呈下調趨勢，越往左右兩邊，差異越顯著。2 種離子模式下分析出的代謝物數量極多，但多數僅有變化趨勢，差異不顯著。

圖3 FSA 脅迫下紅小豆幼苗差異代謝物火山圖Fig.3 Volcanic figure of different metabolites of adzuki bean seedlings under FSA stress

Z-2-ZZ-2 與Z-2-ZZ 相比，從數量上看，在P＜0.05、VIP＞1 的條件下共篩選出236 種差異代謝物，如表1 和表2 可知，正離子模式下，分析出有名稱的代謝物106 種，其中上調50 種，下調56種；負離子模式下，分析出代謝物130 種，其中上調42 種，下調88 種。從分類上看，正離子模式下，上調的差異代謝物主要是苯丙烷和聚酮化合物、有機化合物、脂質和類脂分子等，下調的差異代謝物主要是有機酸及其衍生物、脂質和類脂分子、有機雜環化合物、核苷、核苷酸及其類似物、苯丙烷和聚酮化合物等；負離子模式下，上調的差異代謝物主要是苯丙烷和聚酮化合物、脂質和類脂分子、有機氧化合物以及有機雜環化合物等，下調的差異代謝物主要是有機酸及其衍生物、脂質和類脂分子、有機氧化合物、核苷、核苷酸及其類似物、苯丙烷和聚酮化合物等。

表1 FSA 脅迫下紅小豆幼苗差異代謝物定性結果（正離子)Table 1 Qualitative results of different metabolites in adzuki bean seedlings under FSA stress(cation)種species

表2 FSA 脅迫下紅小豆幼苗差異代謝物定性結果（負離子)Table 2 Qualitative results of different metabolites in adzuki bean seedlings under FSA stress(anion)種species

2.4 FSA 脅迫下紅小豆幼苗差異代謝物代謝通路分析

植物的生長伴隨著復雜的代謝過程，由多種小分子代謝物共同調控，并不能從單一物質含量變化對整體變化進行判斷，因此需進一步對其代謝途徑進行具體的分析[24]。將篩選出的差異代謝物與KEGG 通路數據庫信息進行匹配，對匹配到的代謝通路進行拓撲分析并繪制氣泡圖。由圖4 可知，正離子模式下，共分析出16 條代謝通路；負離子模式下，共分析出12 條代謝通路，再結合Impact 值和P＜0.05 綜合分析，篩選出差異顯著的代謝通路以及參與相應通路的差異代謝物。如表3 和表4 可知，正離子模式下，富集到5 條差異顯著的代謝通路，分別是嘧啶代謝、異黃酮生物合成、嘌呤代謝、半乳糖代謝和精氨酸和脯氨酸代謝，映射出13 種差異代謝物，其中差異代謝物尿嘧啶和胞嘧啶參與嘧啶代謝的代謝途徑，2,7,4′-三羥基異黃酮、甘氨酸和毛蕊異黃酮參與了異黃酮生物合成，鳥嘌呤、次黃嘌呤和β-谷甾酮參與嘌呤代謝，甘露三糖和蔗糖參與了半乳糖代謝，4-（谷氨酰胺）丁酸酯、對香豆酰腐胺和（2 S）-2-（3-羧基丙酰氨基）-5-氧代戊酸參與了精氨酸和脯氨酸代謝；負離子模式下，富集到2 條差異顯著的代謝通路，映射出5 種差異代謝物，分別是花青素生物合成和黃酮類生物合成，其中差異代謝物矢車菊素-3-葡萄糖苷和花葵素參與了花青素生物合成，根皮苷、（2 R,3 R）-3,4′,7-三羥基黃烷酮、花葵素和香樹脂參與了黃酮類生物合成。

表3 FSA 脅迫下紅小豆幼苗代謝通路富集結果（正離子）Table 3 Enrichment of metabolic pathway in adzuki bean seedlings under FSA stress(cation)

圖4 FSA 脅迫下紅小豆幼苗代謝途徑拓撲分析氣泡圖Fig.4 Bubble diagram of topological analysis of metabolic pathway of adzuki bean seedlings under FSA stress

由圖4 可知，顏色越紅，P值越小，說明通路越顯著，氣泡越大，通路越重要。正離子模式下，嘧啶代謝途徑、異黃酮生物合成途徑和嘌呤代謝途徑的氣泡相對較大，說明這3 條通路在分析FSA對紅小豆幼苗代謝途徑的影響較為重要，其次，半乳糖代謝和精氨酸和脯氨酸代謝的氣泡相對較小，說明FSA 對紅小豆幼苗代謝途徑的影響也有一定的重要性；負離子模式下，花青素生物合成途徑的氣泡較大，說明FSA 對紅小豆幼苗的花青素生物合成影響較大，通路較為重要，黃酮類生物合成途徑的氣泡稍小，說明FSA 對紅小豆幼苗中黃酮類物質的合成有顯著影響。

3 討論

植物中產生的次級代謝產物主要用于應對不良環境條件，如黃酮類物質、萜類化合物和生物堿等，它們對非生物的脅迫具有耐受性[25]。紅小豆田間噴施FSA，主要對紅小豆幼苗中苯丙烷和聚酮類化合物、脂質和類脂分子類化合物以及有機酸及其衍生物類化合物產生顯著影響。苯丙烷和聚酮類化合物中的差異代謝物主要是黃酮類化合物，研究[26]表明，黃酮類化合物是豆類中的一種酚類化合物，具有調理細胞分化、凋亡、抗自由基等作用[27-28]，紅小豆田間噴施FSA 能刺激紅小豆幼苗產生次級代謝產物中的黃酮類物質，促進紅小豆幼苗的生長代謝。植物根系分泌有機酸是為了適應環境脅迫，紅小豆幼苗生長過程中受除草劑FSA 的脅迫，產生的有機酸釋放到根際土壤中，從而改變土壤環境，例如土壤的理化性質和微生物活性等[29-31]，為紅小豆幼苗的生長提供養分和能量，并且有機酸及其衍生物化合物中的羧酸及其衍生物屬于萜類化合物，具有抵御FSA 脅迫的作用。

糖類物質能為植物的細胞代謝提供碳源和能量[32]。本研究發現，參與半乳糖代謝途徑的差異代謝物——蔗糖的表達量顯著下調，與程茁等[14]的研究結果一致，糖代謝為氨基酸代謝提供能量[33]，因此，氨基酸代謝中的精氨酸和脯氨酸代謝也受一定的影響。嘌呤和嘧啶主要以核苷酸的形式存在，而參與精氨酸和脯氨酸代謝的差異代謝物4-（谷氨酰胺）丁酸酯為嘌呤和嘧啶核苷酸類化合物的合成提供一部分氮源[34]。嘌呤和嘧啶屬于生物堿，生物堿的合成和積累受生物和非生物的調控[35]，本研究中嘌呤代謝和嘧啶代謝途徑富集到的差異代謝物尿嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、次黃嘌呤等的表達量在FSA 脅迫下發生顯著下調，噴施FSA 抑制了紅小豆幼苗的嘌呤代謝和嘧啶代謝。此外，植物類黃酮能使植物抵御外界環境的壓迫[25,36]，噴施FSA 能促進紅小豆幼苗中黃酮類物質的合成?；ㄇ嗨貙儆邳S酮類化合物，是一種天然色素，幼苗的花色由各種花青素的比例決定，矢車菊素-3-葡萄糖苷和花葵素分別產生紅色和橙色的花[37]，但花青素生物合成容易受外界因素的影響[38]，紅小豆田間噴施FSA 顯著影響紅小豆幼苗中花青素的生物合成。

4 結論

采用LC-MS 代謝組學技術分析紅小豆幼苗受FSA 脅迫后代謝物的變化具有可行性。結果表明，FSA 對紅小豆幼苗代謝產物的種類和數量都有顯著影響，主成分分析顯示，Z-2-ZZ-2 組和Z-2-ZZ組之間存在代謝組學差異，經多元統計分析后，共篩選出236 種差異代謝物，且多數呈現下調趨勢，說明紅小豆田間噴施FSA 對紅小豆幼苗的生長代謝造成顯著影響。

KEGG 通路分析發現，除草劑FSA 對紅小豆幼苗的生長代謝途徑有顯著影響，正離子模式下，差異顯著且最為重要的通路是嘧啶代謝和異黃酮生物合成，負離子模式下，差異顯著且最為重要的通路是花青素生物合成。本研究中篩選出7 條差異顯著的代謝通路中有3 條（異黃酮生物合成、花青素生物合成和黃酮類生物合成）與紅小豆幼苗中黃酮類化合物的合成有關，噴施FSA 對紅小豆幼苗中黃酮類物質的影響較大，黃酮類化合物是通路分析的關鍵代謝物。