原發性腎病綜合征兒童外周血CD14 單核細胞TLR2 的表達及其與IL-7 表達水平的相關性分析

彭文娟，劉京濤，李曉琳

（三門峽市中心醫院兒科，河南 三門峽 472000）

兒童原發性腎病綜合征（Idiopaticnephrotic syndrome，INS）是兒科最常見的腎小球疾病，占小兒腎病綜合征總數的90%以上，典型表現為大量持久的蛋白尿、高度水腫、低蛋白血癥及高脂血癥等癥狀[1]。INS 的常見病因為感染、遺傳、免疫等因素，患者腎臟一般不能完全恢復為正常功能且復發率也比較高。病程延長，是患病兒童腎臟發生衰竭的較為重要的原因之一[2]。多數腎小球腎炎的發病機制是免疫炎癥功能紊亂[3]。Toll 樣受體2（Tolllike receptor 2，TLR2）為Toll 樣受體（Toll-like receptors，TLRs）家族成員，結構上屬于Ⅰ型跨膜受體蛋白，其通過識別與病原有關的分子模式和某些內源性配體，從而導致信號轉導，炎癥介質被釋放[4]。既往研究顯示，Toll 樣受體可能通過炎性反應這一途徑介導腎組織的損傷過程，且與INS 病情活動具有相關性[5-6]。白細胞介素-7（Interleukin-7，IL-7）主要通過IL-7 受體α 鏈發揮作用，可以調控并維持免疫細胞分化、發育和增殖，在感染、腫瘤、自身免疫性疾病中扮演著關鍵的角色[7]。既往研究顯示，IL-7 可以強化CD14 單核細胞的功能，在INS 中發揮促進炎癥的效果、誘導疾病進展的作用[8]?；诖?，我們推測INS 外周血CD14 單核細胞TLR2 與IL-7 等炎癥因子可能通過某種機制相互調節，共同參與了INS 發生、發展。本研究探討INS外周血CD14 單核細胞TLR2 的表達及其與IL-7表達水平，分析二者相關性，以期為臨床治療提供一定的理論基礎。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2019 年1 月到2021 年1 月在本院收治的112 例被確診的INS 患兒作為觀察組，其中男53 例，女59 例，年齡2～16 歲，平均（8.22±2.78）歲。病理學分類：微小病變（Minimal changing disease，MCD）49 例，系膜增生性腎小球腎炎（Mesangial prolif-erative glomerulonephritis，MsPGN）27 例，膜性腎?。∕embranous nephropathy，MN）19 例，局灶節段性腎小球硬化（Focal segmental glomerulus sclerosis，FSGS）17 例。納入標準：（1）符合《兒童常見腎臟疾病診治循證指南》[9]診斷標準；（2）血清白蛋白含量低于25 g/L，24 h 尿蛋白定量超過50 mg/(kg·d)，尿蛋白大于3+，伴有水腫等臨床癥狀；（3）腎臟生物檢查組織學切片腎小球總數超過20 個；（4）不伴其他自身免疫性疾病。排除標準：（1）先天性或遺傳性腎病綜合征患兒；（2）繼發于糖尿病、乙肝丙肝、多發性骨髓瘤等繼發性腎病綜合征患兒；（3）合并嚴重疾病，如自身免疫、肝臟和造血系統等疾??；（4）對本研究所用藥物過敏的患兒；（5）臨床資料不完整患兒。對照組另選同期體檢的健康兒童112 例，其中男54 例，女58例，年齡3～15 歲，平均（8.84±2.51）歲。本研究通過醫院倫理委員會，患者及家屬了解并同意。

1.2 主要試劑和設備 FACS Calibur 流式細胞分析儀購自美國Becton-Dickinson 公司；流式專用試管購自上海百賽生物有限公司；羅氏cobas6000 C501 全自動生化儀購自德國羅氏公司；醫用低速離心機購自德國Heraeus 公司；小鼠抗人CD14 單抗（熒光素PC-5 標記）、IgG2a 同型對照、FITC 標記小鼠抗人TLR2 單抗均購自北京百奧萊博科技有限公司；所用ELISA 試劑盒均購自北京索萊寶科技有限公司；所用免疫比濁法試劑盒均購自上海酶聯生物科技有限公司。

1.3 INS 患兒外周血CD14 單核細胞TLR2 檢測方法 采集所有患兒清晨空腹靜脈血3 mL，置于EDTA 管中，具體檢測步驟：首先，取三支樣品測定管并標記為A、B、C，加入抗凝血劑100 μL，再加入受體封閉劑5 μL。渦旋器振蕩，混勻并在暗室中孵育10 min；然后，在A、B 管中均加入PE-IgG2a 5 μL，在B、C 管中均加入FITC-CD14 20 μL，最后在A、C 管中分別加入FITC-IgG1 20 μL、PE-TLR2 5 μL，振蕩混勻，室溫暗室培養20 min；A、B、C 管中均加入500 μL 紅細胞裂解液后，振蕩混勻并在室溫下避光10 min；最后，進行離心，轉速1 500 r/min，離心半徑15 cm，離心5 min，棄上清液，加入PBS 液2 mL，振蕩混勻，再1 500 r/min，離心5 min，棄上清液，加入PBS 液500 μL，振蕩混勻，應用FACS Calibur 流式細胞儀上機檢測，同時建立無標記抗體的陰性對照。在運行機器之前，使用標準熒光微球調整儀調節對應的變異系數。測試后，使用Cell quest 軟件進行檢測。TLR2 的表達率計算方式為：CD14 和TLR2 抗體染色的雙陽性細胞百分比。

1.4 INS 患兒血清學指標檢測方法 采集所有患兒清晨空腹靜脈血5 mL，使用低溫離心機進行離心，轉速2500 r/min，離心半徑15 cm，離心10 min，吸取其上清液，然后將其放于-80 ℃冰箱中保存待測。

應用羅氏cobas6000 C501 全自動生化儀，采用免疫比濁法測定血漿高敏C-反應蛋白（High sensitive c-reactive protein，hs-CRP）、免疫球蛋白G（Immunoglobulin G，IgG）、免疫球蛋白M（Immunoglobulin M，IgM）水平；采用ELISA 檢測法測定血清白介素-7（Interleukin-7，IL-7）、白介素-6（Interleukin-6，IL-6）、白介素-8（Interleukin-8，IL-8）及腫瘤壞死因子-α（Tumer necrosis factor-alpha，TNF-α）水平，操作過程嚴格按照試劑盒說明進行。

1.5 統計學處理 采用SPSS 22.0 軟件對所得數據進行分析，滿足正態分布的計量資料均以（）表示，采用t 檢驗分析比較兩組間差異性；計數資料均以率(%)表示，分類資料之間比較采用χ2檢驗；采用Pearson 相關性分析INS 患兒外周血CD14 單核細 胞TLR2 的表達及其與IL-7、hs-CRP、IgG、IgM 表達水平的相關性；繪制受試者工作特征曲線（Receiver operating characteristic curve，ROC），計算ROC 曲線下面積（Area under curve，AUC），評估TLR2、IL-7 對INS 患兒發病的預測價值，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 觀察組和對照組血清hs-CRP、IgG、IgM 水平比較 兩組血清hs-CRP、IgG、IgM 水平比較具有統計學差異（P＜0.05），見表1。

表1 兩組血清hs-CRP、IgG、IgM 水平比較

2.2 兩組TLR2、IL-7、IL-6、IL-8、TNF-α 表達水平比較 觀察組外周血CD14 單核細胞TLR2、IL-7、IL-6、IL-8、TNF-α 表達水平均顯著高于對照組（P＜0.05），見表2。

表2 兩組TLR2、IL-7、IL-6、IL-8、TNF-α 表達水平比較

2.3 INS 患兒TLR2 與IL-7 表達水平的相關性分析 INS 患兒外周血CD14 單核細胞TLR2 與IL-7表達水平呈正相關（r=0.479，P＜0.001），見圖1。

圖1 INS 患兒TLR2 與IL-7 表達水平的相關性分析

2.4 INS 患兒TLR2、IL-7 與hs-CRP、IgG、IgM、IL-6、IL-8、TNF-α 相關性分析 INS 患兒外周血CD14 單核細胞TLR2 與hs-CRP、IL-6、IL-8、TNFα 呈正相關（P＜0.05）；血清IL-7 與IgG 呈負相關，與hs-CRP、IL-6、IL-8、TNF-α 呈正相關（P＜0.05）；而TLR2、IL-7 與IgM 均無相關性（P＞0.05）。見表3。

表3 INS 患兒TLR2、IL-7 與hs-CRP、IgG、IgM、IL-6、IL-8、TNF-α 相關性分析

2.5 ROC 曲線分析TLR2、IL-7 對INS 患兒發病的預測價值 TLR2、IL-7 及聯合檢測預測INS 患兒發病的AUC 分別為0.714、0.674、0.908。見圖2、表4。

圖2 TLR2、IL-7 對INS 患兒發病的預測價值ROC 曲線圖

表4 TLR2、IL-7 及聯合指標的ROC 曲線分析

3 討論

INS 是兒童常見的腎小球疾病，其主要原因是腎小球毛細血管及基底膜的通透性增加，大量血漿蛋白經尿流失，肝臟合成脂蛋白增加，這些因素綜合導致了兒童腎衰竭的發生[10]。目前，INS 的病因和發病機制尚未完全清楚。已有研究顯示，機體細胞和體液免疫功能異?？赡苁菍е掳l病主要原因，且TLRs 對INS 的發生、發展起重要作用[11]。本研究分析了INS 患兒的一般資料，發現血清hs-CRP、IgM 水平高于對照組，IgG 水平低于對照組。已有研究顯示，hs-CRP 是一種非常敏感的炎癥標志物。當機體發生炎癥感染，或者遭體液介導的免疫應答導致的組織損傷時，血液中的CPR 在很長一段時間內保持在高水平[12]。而IgM 是一種高分子蛋白，其不容易通過腎小球濾過膜，當機體發生炎癥反應時其濃度上調。所以IgM 的增加也可能與INS 患兒的繼發感染有關。IgG 降低可能與INS 患兒加速分解、尿中丟失增加、淋巴細胞合成的減少和免疫抑制劑的應用相關[13-14]。結合本研究說明，hs-CRP、IgM 及IgG 可以分別以不同的方式參與兒童INS 的發病，并在發病中起到一定作用。

TLR2 是特異的I 型跨膜受體和病原模式識別受體，在炎癥反應、細胞信號的傳達、衰亡中扮演著重要的角色[15]。IL-7 是趨化因子家族中的成員之一，是骨髓基質細胞分泌的糖蛋白細胞因子，分子量為25KD，能夠促進趨化因子分泌、募集炎癥因子[16]。既往研究顯示，IL-7 可以加速INS 患兒CD14單核細胞炎癥細胞因子的分泌。IL-7 刺激的CD14單核細胞均可通過直接或接觸的方式，誘導IL-6分泌從而使INS 患兒CD4+T 細胞活化[17]。本研究結果顯示，INS 患兒外周血CD14 單核細胞TLR2、IL-7、IL-6、IL-8、TNF-α 表達水平均顯著高于對 照組，且TLR2 與IL-7 表達水平呈正相關性。分析原因，這可能是由于INS 患兒機體TLR2 識別了某些內源性抗原，通過細胞內信號轉導途徑誘導人單核細胞激活NF-кβ，核內的相關基因被啟動，傳導出相應的mRNA，從而合成IL-7、IL-6、IL-8、TNFα 等細胞因子并釋放到胞外，引起炎癥反應。既往研究顯示，TLR2 與其配體結合以后，激活下游信號轉導分子，引起炎性因子的釋放，使腎小球基底膜通透性增強，導致大量蛋白尿的產生[18]。結合本研究說明，外周血CD14+單核細胞TLR2、IL-7 與INS 的發生有密切關系，TLR2 可以通過炎性反應這一途徑參與并調控腎組織的損傷過程。

本研究結果還顯示，INS 患兒外周血CD14 單核細胞TLR2 與hs-CRP、IL-6、IL-8、TNF-α 呈正相關；血清IL-7 與IgG 呈負相關，與hs-CRP、IL-6、IL-8、TNF-α 呈正相關。既往研究顯示，TLRs 還可以刺激和調節B 淋巴細胞表面標志物的表達，促進B 淋巴細胞增殖、細胞因子分泌和Ig 分泌功能[19]。結合本研究說明，T 淋巴細胞亞群和細胞炎癥因子均可能參與INS 的發生和發展。T 淋巴細胞分泌的細胞因子在INS 患兒機體內會出現異常表達，其表達結果與健康兒童不同，同時還會介導相關細胞的免疫應答過程，在兒童體內進而引發超敏反應。通過ROC 曲線分析發現，TLR2、IL-7 聯合檢測INS 患兒發病的靈敏度、特異度最高，AUC 面積最大，且有較好的靈敏度和特異性，具有較大預測價值，提示外周血CD14 單核細胞TLR2、IL-7 在INS 發病中均起到一定作用。

綜上所述，INS 患兒外周血CD14 單核細胞TLR2、IL-7 表達水平均明顯上調，且兩者具有正相關性，TLR2、IL-7 聯合檢測對判定INS 發病具有較高的預測價值。但本文還存在一定的不足之處，可進一步探討INS 患兒外周血CD14 單核細胞TLR2調控的信號通路，以期為臨床診斷和治療INS 患兒提供可靠依據。