基于全基因組測序的貝萊斯芽胞桿菌Ba-0321抑菌機制分析及相關功能驗證

李小杰，邱 睿，劉 暢，姚晨虓，白靜科，陳玉國，李淑君

（河南省農業科學院煙草研究所/煙草行業黃淮煙區煙草病蟲害綠色防控重點實驗室，許昌 461000）

芽胞桿菌Bacillusspp.是一種嗜溫、好氧、產芽胞的桿狀細菌，能夠產生耐熱、耐旱、抗紫外線和有機溶劑的內生孢子、多種抗菌素和酶，具有廣譜抑菌活性和極強的抗逆能力[1,2]。貝萊斯芽胞桿菌是芽胞桿菌中新發現的1 個種，普遍存在于自然界植物組織、土壤、河水以及海洋中[3-5]。有研究表明，貝萊斯芽胞桿菌具有防治多種植物病害的潛力，同時具有促生、固氮和抗逆境等多種優良功能，是重要的生防資源。郗良卿等[6]從健康甜櫻桃中篩選出優質拮抗菌株——貝萊斯芽胞桿菌，能夠抑制匍枝根霉Rhizopusstolonifer的生長，對櫻桃軟腐病也有良好的防治效果；沙月霞等[7]明確了水稻內生菌貝萊斯芽胞桿菌B.velezensisE69是一種潛在的、預防效果明顯的生防菌株，具有預防稻瘟病兼防紋枯病等多種真菌病害的應用潛力；夏明聰等[8]明確了貝萊斯芽胞桿菌YB-145 是一株具有生防潛力的菌株，可用于小麥紋枯病的防控，同時能提高小麥根鮮質量、地上部鮮質量和地上部高度。

芽胞桿菌主要通過兩種途徑產生抑菌物質，一是通過核糖體途徑合成小分子物質如肽類物質、細菌素、硫肽類物質（thiopeptide）、萜烯類物質（terpene）等[9,10]，二是通過非核糖體途徑合成的脂肽類化合物、聚酮類化合物和多肽類化合物等[11,12]。芽胞桿菌分泌的有益次生代謝產物種類繁多，但傳統的試驗分析和鑒定方法很難全面地分析其中的抑菌活性物質且耗時耗力，同時難以充分挖掘其相關基因，揭示其生防作用機制。全基因組測序為進一步認識和利用生防菌株提供了重要基礎，尤其是隨著測序技術的不斷革新以及費用的大大降低，越來越多的芽胞桿菌基因組序列被公布。通過全基因組信息挖掘，研究者發現了大量已知或未知的抑菌物質合成基因簇。戴利銘等[13]對一株具有較強抑菌活性的內生解淀粉芽胞桿菌BS-3 進行全基因組測序分析，預測得到10 個次級代謝產物基因簇，其中包括6 類已知的具有抑菌活性的物質和4種功能未知的基因簇；高圣風等[14]從生防菌株B.velezensisZ 全基因組信息中發現編碼次生代謝產物合成的基因簇13 個，其中有5 個未知功能基因簇。這些研究結果不僅有助于解析芽胞桿菌次級代謝產物的合成途徑，同時能挖掘新的次級代謝產物，為新型生物藥物的開發提供重要資源。

本課題組前期在健康煙株根際土壤中篩選到一株高效生防貝萊斯芽胞桿菌Ba-0321，本研究測定了菌株Ba-0321 無菌濾液對尖孢鐮刀菌、疫霉菌等煙草主要病原真菌的抑制效果，同時利用第二代 illumina與第三代Nanopore 相結合的測序技術對該菌株進行全基因組測序，通過GO、COG、KEGG 和antiSMASH等數據庫進行基因功能注釋和次級代謝產物基因簇分析，并進行相關功能驗證，以期為全面深入解析其抑菌機制、挖掘次級代謝產物基因資源和菌株的高效開發利用提供生物信息學基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌株 貝萊斯芽胞桿菌Ba-0321 分離自河南省許昌市煙田健康煙株根際土壤，現保藏于中國典型培養物保藏中心（保藏號CCTCCM2020440）。

植物病原真菌：煙草尖孢鐮刀菌F.oxysporum、煙草疫霉菌P.nicotianae均分離自河南煙田發病煙株并保存于本實驗室。

1.1.2 主要試劑和儀器 細菌基因組DNA 提取試劑盒，布魯克(北京)科技有限公司；DL2000 DNA Marker，北京天根生化科技有限公司。PCR 儀，Applied Biosystems 公司；電泳儀，北京六一生物科技有限公司；NanoDrop 2000，賽默飛世爾科技公司。

1.1.3 所用培養基 貝萊斯芽胞桿菌Ba-0321 培養用LB 培養基：蛋白胨10.0 g，酵母提取物5.0 g，NaCl 10.0 g，蒸餾水1000 mL；尖孢鐮刀菌培養用PDA 培養基：馬鈴薯200.0 g、葡萄糖20.0 g，蒸餾水1000 mL；疫霉菌培養用OA 培養基：燕麥片30 g，蒸餾水1000 mL。固體培養基均添加瓊脂粉15 g/L。121 ℃高壓滅菌20 min。

酪蛋白培養基：干酪素10.0 g，瓊脂20.0 g，pH 7.2；纖維素水解培養基：蛋白胨10.0 g，KH2PO41.0 g，酵母浸粉10.0 g，NaCl 5.0 g，羧甲基纖維素鈉 10.0 g，瓊脂15.0 g，pH 7.2；幾丁質培養基：膠體狀幾丁質10.0 g，KCl 0.2 g，NH4H2PO41.0 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，瓊脂 20.0 g，超純水1000 mL。

1.2 方法

1.2.1 菌株Ba-0321 無菌濾液的抑菌能力測定 采用菌絲生長速率法，將菌株Ba-0321 接種于LB 液體培養基中，28 ℃、180 r/min 條件下恒溫振蕩培養3 d，5000 r/mim 離心10 min，取上清液用0.22 μmol/L 過濾器進行過濾除菌。分別按1%、5%和10%的比例將發酵濾液加入PDA 或OA 培養基后倒平板，將直徑為5 mm 的尖孢鐮刀菌和疫霉菌菌塊分別置于上述含有不同發酵濾液的平板中間，以不加濾液處理為對照，每個處理重復3 次，25 ℃恒溫箱中培養5 d，采用十字交叉法測量病原菌菌落直徑并拍照，計算抑菌率，抑菌率（%）=（對照組菌落生長直徑-處理組菌落生長直徑）/對照組菌落生長直徑×100。

1.2.2 菌株Ba-0321 全基因組測序 采用SDS 提取結合純化柱（OMEGA）法，提取基因組DNA。利用Nanodrop、Qubit 和0.35%瓊脂糖凝膠電泳進行純度、濃度和完整性質檢，然后進行文庫構建。采用二代illumina 與三代Nanopore 相結合的測序技術進行測序。本次測序委托北京擎科生物科技有限公司完成。

1.2.3 基因功能注釋 將預測得到的基因序列與GO（Gene Ontology）、COG（Cluster of Orthologous Groups of proteins）、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）等數據庫做 BLAST+(2.9.0+)比對，得到基因功能注釋結果。

1.2.4 抑菌代謝產物分析 采用antiSMASH 程序（version 5.2.0）對菌株Ba-0321 中次級代謝產物合成基因簇進行預測。結合基因注釋結果和NCBI 數據庫BLAST 比對分析結果，挖掘菌株Ba-0321 可能具有抑菌活性的次級代謝產物及編碼基因簇。

1.2.5 抗菌脂肽合成基因及防御機制相關基因的PCR 擴增 根據相似度高的已知芽胞桿菌基因組中Surfactin、Macrolactin、Fengycin、Difficidin、Bacillibactin、Bacillaene 和Bacilysin 脂肽抗生素合成基因（表1）及Ba-0321 菌株基因組中預測的防御機制相關基因（表2）設計引物，以Ba-0321 基因組DNA 為模板進行PCR擴增。PCR 反應體系：2×TaqPCR Mix 12.5 μL，10 μmol/L 正、反向引物各1 μL，基因組DNA 1 μL（50 ng）為模板，超純水補足至25 μL。PCR 擴增條件為：95 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 45 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，30 個循環；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR 反應結束后，取5 μL 擴增產物于1.5%的瓊脂糖凝膠中電泳，在BIO-RAD 凝膠成像系統上觀察、拍照。將獲得預期大小的PCR 擴增產物送測序，測序所獲得的序列在NCBI 中進行BLAST 比對分析。

表1 抗菌脂肽合成基因的引物序列Table 1 Primer sequence of antibacterial lipopeptide synthesis gene

表2 防御機制相關基因的引物序列Table 2 Primer sequences of resistance related genes

1.2.6 菌株Ba-0321 產酶能力測定 將菌株Ba-0321 在LB 培養基上進行活化并劃線培養，挑取單菌落接種于LB 液體培養基中28 ℃、160 r/min 振蕩培養至OD600≈1.0，吸取5 μL 菌液分別點接于酪蛋白培養基、纖維素水解培養基和幾丁質培養基上，28 ℃恒溫培養3～5 d，觀察上述培養基是否產生水解圈，以檢測菌株是否具有蛋白酶、纖維素酶和幾丁質酶活性。對照滴加等量LB 培養液，每個處理3 次重復。

2 結果與分析

2.1 貝萊斯芽胞桿菌Ba-0321 無菌濾液對煙草尖孢鐮刀菌和疫霉菌的抑菌能力

試驗結果表明，菌株Ba-0321 無菌發酵濾液對尖孢鐮刀菌和疫霉菌均具有抑制效果，但不同添加量對病原菌的抑制效果不同。在相同體積的培養基中，無菌濾液所占比例越高，抑菌效果越明顯。其中10%無菌濾液處理對兩種病原菌菌絲生長的抑制率較高，分別可達57.38%和34.30%，極顯著高于1%和5%無菌濾液處理。5%無菌濾液處理對尖孢鐮刀菌菌絲生長的抑制率極顯著高于1%無菌濾液的抑菌率；而5%無菌濾液處理對疫霉菌菌絲生長的抑制率與1%無菌濾液處理無顯著差異。以上結果表明，菌株Ba-0321 能夠產生具有抑菌活性的次生代謝產物，且抑菌活性與代謝產物的含量呈正相關（圖1）。

圖1 菌株Ba-0321 無菌濾液不同添加量對煙草疫霉菌和尖孢鐮刀菌的抑制效果Fig.1 Antifungal effects of strain Ba-0321 against P.nicotianae and F.oxysporum

2.2 貝萊斯芽胞桿菌Ba-0321 全基因組組成

菌株Ba-0321 全基因組大小為4099109 bp，平均GC 含量為46.31%；含有基因4103 個，其中編碼基因3897 個，平均長度932 bp；含有tRNA 基因86 個，23S rRNA、16S rRNA 和5S rRNA 各9 個，tmRNA基因1 個，miscRNA 92 個。預測出基因島10 個；前噬菌體2 個；重復序列202 個，覆蓋率為0.45%。Ba-0321基因組測序數據提交至GenBank，登錄號為CP101904，基因組圈圖見圖2。

圖2 貝萊斯芽胞桿菌Ba-0321 基因組圈圖Fig.2 Genome circle map of B.velezensis Ba-0321

2.3 菌株Ba-0321 基因組的GO 功能注釋

將菌株Ba-0321 氨基酸序列與GO 數據庫進行比對，共得到2992 個注釋編碼基因，占基因總數的72.92%，分別按照生物學過程（Biological Process）、細胞組分（Cellular Component）和分子功能（Molecular Function）3 個方面進行注釋（圖3）。分類統計結果顯示，在生物學過程方面，其中有56 個基因被注釋到抗生素生物合成過程分類中；在分子功能方面，其中有68 個基因被注釋到水解酶活性分類中。另外，菌株Ba-0321 含有纖維素酶、幾丁質結合蛋白等拮抗活性相關基因和脂多糖生物合成、水楊酸生物合成、乙酰乳酸脫羧酶、乙酰乳酸合酶等誘導抗病性相關基因。以上結果表明，菌株Ba-0321 可通過產抗生素、酶類和誘導植物產生抗病性等途徑起作用。

圖3 GO 功能分類Fig.3 Gene ontology classification

2.4 菌株Ba-0321 基因組的COG 功能注釋

對菌株Ba-0321 基因組中具有生物學功能的蛋白編碼基因進行COG 注釋，結果發現共有2540 個蛋白編碼基因被注釋（圖4），占基因總數的61.91%，可分為A～Z 共24 類。其中注釋到氨基酸轉運及代謝（Amino Acid Transport and Metabolism）的基因最多，共306 個，占總注釋基因數的12.04%；其次為翻譯、核糖體結構和生物合成的注釋基因數為204 個，占比為8.03%；碳水化合物轉運和代謝、轉錄及未知功能基因分別有191 個、188 個和185 個。值得注意的是，有62 個參與防御機制（defence machainsm）的基因被注釋，其中編碼ABC 型多藥轉運系統基因最多，有21 個；其次，編碼多藥轉運蛋白基因6 個，編碼ABC 型抗菌肽轉運系統基因和肽酶基因各5 個；編碼焦磷酸酶水解酶基因3 個，編碼參與碲酸鹽抗性的非特征性保守蛋白基因2 個。推測這些基因可能參與了菌株Ba-0321 的抑菌功能。

圖4 COG 結果分類圖Fig.4 Classification diagram of COG results

2.5 菌株Ba-0321 基因組的KEGG 功能注釋

將菌株Ba-0321 與KEGG 數據庫進行比對分析，對應到KEGG Pathway 的基因有1168 個，占基因總數的28.47%，參與28 條代謝通路，其中基因數超過50 的代謝通路有15 條（圖5）。KEGG 富集分析結果表明，碳水化合物代謝（Carbohydrate metabolism）、Global and overview maps 和氨基酸代謝（Amino acid metabolism）是最主要的3 種代謝通路，分別有377、289 和289 個基因被注釋。另外，有35 個基因被注釋到其他次級代謝產物生物合成途徑，有56 個基因被注釋到萜類化合物和聚酮化合物代謝途徑，推測這些基因與Ba-0321 抑菌活性物質的產生具有密切關系。

圖5 KEGG pathway 結果分類圖Fig.5 Classification diagram of KEGG pathway results

2.6 次級代謝產物預測分析

利用anti-SMASH 對菌株Ba-0321 基因組進行次級代謝產物分析，結果發現該菌株共編碼13 個次生代謝產物合成基因簇，其中能夠找到完全相同或相似度達90%以上的已知基因簇7 個，相似度在20%以下的有2 個基因簇，另外有4 個基因簇未能找到與之相似的已知基因簇（表3）。發現有7 種抗菌活性物質，分別為表面活性素（Surfactin）、大環內酯類抗生素（Macrolactin H）、多烯類（Bacillaene）、豐原素（Fengycin）、聚酮類化合物difficidin、兒茶酚型嗜鐵素（Bacillibactin）和溶桿菌素（Bacilysin），除Surfactin 與已知菌株BGC0000433 來源的Surfactin 合成基因簇相似性為91%，其他6 種抗菌素合成基因簇與已知菌株來源的與之對應的基因簇相似性均達100%。Cluster 1 與已知菌株BGC0000926 來源的rhizocticin A 合成基因簇相似性較小，為22%，Cluster 3 與已知菌株BGC0000693 來源的butirosin A/B 合成基因簇相似性最小，僅為7%。比對還發現該菌基因組中存在4 種未知功能的基因簇（Cluster 4、8、9、12），其中萜類（Terpene）2 種，T3PKS（Type III PKS）類1 種、非核糖體肽合成酶（NRPS）1 種。以上結果表明，菌株Ba-0321中存在多種產生抑菌次生代謝產物的基因簇，同時也存在合成新抑菌物質的基因簇，具有較大的生防應用潛力。

表3 菌株Ba-0321 次級代謝產物合成基因簇Table 3 Gene clusters of secondary metabolite of Ba-0321

2.7 菌株Ba-0321 基因組中抗菌脂肽合成基因和防御機制相關基因的擴增

根據菌株Ba-0321 全基因組序列中編碼Surfactin、Macrolactin、Fengycin、Difficidin、Bacillibactin、Bacillaene 和Bacilysin 脂肽合成酶基因（表1）及防御機制相關基因（表2）所設計的特異引物，以Ba-0321基因組DNA 為模板進行PCR 擴增，均能擴增出明亮且單一的條帶，且片段大小與預期一致（圖6）。序列分析結果表明，擴增獲得的PCR 產物序列與設計的目標基因片段序列同源性均為100%，與數據庫中其他B.velezensis菌株基因組中相對應的基因序列同源性在91%～100%，進一步證實了菌株Ba-0321 基因組中確實存在抑菌活性物質合成基因簇及防御機制相關基因。

圖6 抗菌脂肽和抗性相關基因的PCR 擴增結果Fig.6 PCR amplification results of antimicrobial lipopeptide and resistance related genes

2.8 菌株Ba-0321 產蛋白酶、纖維素酶和幾丁質酶的能力

酶活性測定結果表明，菌株Ba-0321 可使酪蛋白培養基、幾丁質培養基產生水解圈，顯色反應中使纖維素剛果紅培養基紅色消失，產生透明圈，說明該菌株具有產蛋白酶、幾丁質酶和纖維素酶的能力（圖7）。

圖7 蛋白酶、纖維素酶和幾丁質酶活性測定Fig.7 Determination of protease, cellulase and chitinase activities

3 討論

貝萊斯芽胞桿菌能分泌產生酶、抗菌蛋白、脂肽類抗生素、聚酮類抗生素、植物激素等多種生物活性物質，對抑制病原菌起著重要作用[9,15]。本研究通過共培養的方法明確了貝萊斯芽胞桿菌Ba-0321 無菌濾液對尖孢鐮刀菌和疫霉菌菌絲生長的抑制作用，說明該菌株可分泌胞外抑菌代謝產物，同時發現其胞外代謝產物的含量與抑制率的正相關性，但未明確其抑菌物質的種類。進一步通過全基因組測序及基因功能注釋，從分子生物學的角度推測出一些與其抑菌功能相關的基因，如編碼肽酶、水解酶、多藥轉運蛋白、纖維素酶、幾丁質結合蛋白、抗生素生物合成等基因，以及參與萜類化合物、聚酮化合物代謝途徑的基因等，同時推測出菌株Ba-0321 基因組中還含有誘導抗病性相關基因，表明菌株Ba-0321 可能通過多種途徑抑制病原菌的生長，這與前人的研究[9,15]基本一致。通過對該菌株基因組中抑菌相關基因的分子驗證和抗性相關酶活力測定[16]，進一步證實了該基因組測序結果的可靠性，初步明確了該菌株的抑菌機制。下一步將進行抑菌相關基因挖掘、胞外抑菌活性物質的分離提取及微生物農藥的研發與利用。

本研究采用antiSMASH 工具預測菌株Ba-0321 的次級代謝產物基因簇，得到脂肽類和聚酮類抗生素合成基因簇13 個，其中有7 個相似性很高的抗生素合成基因簇，如Surfactin、Macrolactin、Bacillaene、Fengycin、difficidin、Bacillibactin 和Bacilysin，這與前人研究基本一致[17-20]。其中，Macrolactin 是一類由聚酮鏈環化而成的新型化合物，到目前為止，一共鑒定出26 種大環內酯類化合物Macrolactin A-Z 及其衍生物，且大部分是從海洋芽胞桿菌中獲得[21,22]，多項研究證明大環內酯Macrolactin 對多種植物病原菌具有顯著的抑制作用[23-25]。本研究從貝萊斯芽胞桿菌Ba-0321 中預測出Macrolactin H 合成基因簇，并通過分子驗證了該抗生素合成基因簇確實存在于Ba-0321 基因組中，進一步豐富并證實了該物質可存在于多種芽胞桿菌中，但該物質是否對煙草尖孢鐮刀菌和疫霉菌等病原真菌具有抑制效果還需進一步研究。目前關于Rhizocticins和Butirosin 抗生素相關的研究還較少[26,27]。本研究中發現的Rhizocticin A 抗生素合成基因簇與BGC0000926來源的相似度僅為22%，Butirosin 抗生素合成基因簇與BGC0000693 來源的相似度僅為7%，說明這些基因簇可能合成了新的抑菌物質。菌株Ba-0321 基因組中還存在4 種未知的次生代謝產物合成基因簇，有待于今后進一步挖掘研究。該研究為新型微生物農藥的開發提供了很好的資源。