響應面法優化貝萊斯芽胞桿菌YC11的液體發酵培養基

劉 芳，黎妍妍，陳 偉，曹春霞，溫少華，饒 犇*，黃大野*

（1.湖北省生物農藥工程研究中心，武漢 430064；2.湖北省煙草科學研究院，武漢 430030）

煙草黑脛病又稱煙草疫病，又稱為黑根、黑稈瘋、烏頭病[1]。是由煙草疫霉Phytophthoraparasiticavar.nicotianae引起的一種廣泛分布、毀滅性危害煙草的土傳性真菌病害[2]。在中國已報道的煙草60 余種侵染性病害中，煙草黑脛病是中國煙草生產中危害嚴重的病害之一，每年因煙草黑脛病造成的產值損失多達1.23 億元，僅次于煙草病毒病[3]。目前該病害的防治主要依靠化學殺菌劑，防治黑脛病當前使用較多的內吸性藥劑主要有甲霜靈、烯酰嗎啉、惡唑菌酮、惡霜靈等[4]?；瘜W農藥大量使用造成環境污染、生態平衡破壞以及病原菌對化學藥劑產生抗藥性[5-7]。生物防治具有相對安全、長效且不易使病原菌產生抗藥性等特點，因此，開發環境友好型高效生防菌劑對煙草重要土傳性病害進行生物防治，促進煙葉綠色生產具有重大意義[8]。

不同微生物有不同營養需求，進行微生物工業化大生產之前，需對其發酵培養基及培養條件進行小試優化。發酵培養基的優化方法，包括單因素試驗[9,10]、正交設計[11-16]、均勻設計[17]、Plackett-Burman 設計[16-21]、Box-Behnken 設計[19,21]及中心組合設計[16,18,20,22]等，都可用在不同微生物發酵培養基及發酵條件優化中，而利用Plackett-Burman 設計、Box-Behnken 設計或中心組合設計，再結合響應面分析能夠快速有效地確定其最佳培養基或培養條件。

本實驗室從煙草根際土壤中分離到1 株貝萊斯芽胞桿菌BacillusvelezensisYC11，該菌株室內生測結果表明對煙草黑脛病具有良好防效，具有一定的微生物農藥產品開發價值。本文以貝萊斯芽胞桿菌YC11為研究對象，對其產胞發酵培養基搖瓶配方進行Plackett-Burman 試驗，篩選出顯著影響因子，然后結合最陡爬坡試驗、Box-Behnken（BB）響應面法擬合顯著因子與芽胞產量的非線性方程求解，優化得到菌株最佳發酵產胞培養基搖瓶配方，并在500 L 罐中進行發酵驗證，為該菌株的擴大生產及產業化提供支撐。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

貝萊斯芽胞桿菌YC11 由湖北省生物農藥工程研究中心自主分離獲得，并保存于武漢大學中國典型培養物保藏中心，菌種保藏編號為CCTCC M20211651。

1.2 供試培養基

供試培養基配方如下：（1）LB 瓊脂培養基：胰蛋白胨 10 g，氯化鈉 5 g，酵母提取物5 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水1 L，pH 值7.0；（2）種子液培養基：不加瓊脂的LB 液體培養基；（3）初始發酵培養基：淀粉15 g，豆粕20 g，硫酸鎂0.3 g，磷酸二氫鉀0.1 g，超純水1 L，pH 值7.5，500 mL 三角瓶裝液量為50 mL[18]；（4）搖瓶發酵培養基：按下文中PB、最陡爬坡、BB 試驗設計要求配制，pH 值7.5，500 mL三角瓶裝液量為50 mL。

1.3 試驗方法

1.3.1 搖瓶培養 斜面菌種YC11 30 ℃活化后，接種一環入裝有100 mL LB 液體培養基的三角瓶（500 mL）中，30 ℃、180 r/min 培養16 h，作為搖瓶發酵的種子液。種子液按1%（v/v）接種量接至搖瓶發酵培養基中，30 ℃、180 r/min 培養至芽胞脫落20%時即發酵結束[18]。

1.3.2 發酵液芽胞產量的測定 發酵稀釋液于80 ℃水浴20 min 殺死其中的營養體，再利用稀釋涂布平板計數法測定[18]。

1.3.3 Plackett-Burman（PB）設計 以玉米粉為碳源，以魚粉、酵母粉和玉米漿為氮源，硫酸鎂及磷酸二氫鉀為無機鹽，共6 種營養因素（A：玉米粉，B：魚粉，C：酵母粉，D：玉米漿，E：硫酸鎂，F：磷酸二氫鉀）進行Plackett-Burman 試驗設計，6 因子2 水平的PB 試驗因素水平表以及試驗設計如表1 和表3所示，篩選影響菌株發酵芽胞產量的顯著影響因子。

表1 PB 試驗因素水平表Table 1 Factors and Levels of Plackett-Burman experiment

1.3.4 最陡爬坡試驗 根據PB 試驗所擬合方程的計算結果，以各顯著因子為中心起點，確定最陡爬坡試驗的方向與步長，通過爬坡試驗來快速逼近中心點[23]。試驗設計見表5。

1.3.5 Box-Behnken（BB）設計 根據最陡爬坡試驗結果設計3 因素3 水平的BB 實驗，每個因素設置低、中、高3 水平，分別以“-1”、“0”、“+1”代表[23]，以菌株發酵液芽胞產量為響應值Y，應用Minitab19軟件擬合二次函數方程，根據擬合的數學模型以及方差分析的結果，分析單獨因子及因子之間交互作用對響應值Y 的影響，繪制響應面分析曲面圖和等值線圖直觀地描繪其結果，同時利用擬合二次函數方程解析出最優結果，因素水平及試驗設計見表2 和表6。

We got home at midnight.By that time everyone else was in bed.

表2 BB 試驗因素水平表Table 2 Factors and level design of Box-Behnken experiment

1.3.6 搖瓶發酵驗證試驗 優化后的培養基配方按比例配制培養基進行搖瓶發酵，設3 個平行重復，溫度30 ℃、搖床轉速180 r/min 培養條件下培養至芽胞脫落20%。發酵結束后按1.3.2 方法，測定發酵液的芽胞產量。

1.3.7 500 L 發酵罐發酵驗證 斜面菌種30 ℃活化后，分別接種一環入30 瓶LB 液體培養基中，溫度30 ℃、搖床轉速180 r/min 條件下培養16 h 后合瓶，作為發酵罐的種子備用。按優化后的培養基配方稱取培養基，60%投料體積計料，消泡劑300 mL，121 ℃～123 ℃，1×105Pa 條件下保溫保壓滅菌30min。待罐溫降至32 ℃時壓差法接入1%（v/v）的種子液，通氣比1：0.5～1.2，罐壓0.5×105Pa，培養溫度30 ℃～32 ℃，攪拌常開，發酵24 h 后每隔2 h 取樣鏡檢，以芽胞脫落分離20%時為發酵終點，停止發酵，測定發酵液的芽胞產量。

1.3.8 貝萊斯芽胞桿菌YC11 優化發酵培養物對煙草黑脛病的防控效果 將煙草種子（云煙87）播種于裝有基質（草炭:蛭石3:1）育苗缽中，待生長至5～6 葉期備用。取上述優化后的發酵液，使用原液和稀釋5 倍發酵液進行灌根，對照藥劑為50%烯酰嗎啉可濕性粉劑（巴斯夫歐洲公司），稀釋500 倍。灌根量均為20mL/株，對照灌清水。每個處理3 次重復，每個重復15 株。24 h 后灌煙草疫霉孢子懸浮液（1×106孢子/mL），按照張潛等[24]方法制備孢子懸浮液。待對照充分發病統計病情指數，并計算防效。

煙草根莖病害分級標準參照《中華人民共和國國家標準農藥田間藥效實驗準則（二）GB/T 23222-2008》進行。煙草黑脛病分級標準：0 級，全株無??；1 級，莖部病斑不超過莖圍的1/3，或1/3 以下葉片凋萎；3級，莖部病斑環繞莖圍1/3～1/2，或1/3～/2 葉片輕度凋萎，或下部少數葉片出現病斑；5 級，莖部病斑超過莖圍的1/2，但未全部環繞莖圍，或1/2～2/3 葉片凋萎；7 級，莖部病斑全部環繞莖圍，或2/3 以上葉片凋萎；9 級：病株基本枯死[25]。病情指數=∑（各級植株數×級別）/（調查總株數×最高代表級別）×100。防治效果（%）=（對照病情指數-處理病情指數）/對照病情指數×100。

1.4 數據統計與分析

上述PB 試驗、BB 試驗及響應面分析均利用Minitab19 軟件進行設計和分析及繪圖。試驗結果利用SPSS 22.0 軟件進行統計分析，采用最小顯著差異法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 Plackett-Burman 試驗結果

Plackett-Burman 試驗結果與方差分析如表3 和表4 所示，應用Minitab19 軟件分析可以得到各營養因子與響應值Y（發酵液芽胞產量）的一次回歸方程為：Y=62.65－16.08A-5.65B+9.22C－1.72D+14.18E+2.68F；培養基成份中的玉米粉（A）、酵母粉（C）和硫酸鎂（E）為顯著影響因子，玉米粉（A）系數為負數，說明其與響應值Y（發酵液芽胞產量）負相關，酵母粉（C）和硫酸鎂（E）系數為正數，說明它們與響應值Y（發酵液芽胞產量）正相關，決定系數R2=0.9151，表明模型線性方程能夠解釋91.51%的原因，僅8.49%的變異不能由此模型解釋，校正決定系數Adj R2=0.8133，表明模型可解釋81.33%的變異。

表3 六因素PB 試驗設計及結果Table 3 The design and result of Plackett-Burman experiment with 6 factors

表4 PB 試驗方差分析結果Table 4 Analysis of variance and results of Plackett-Burman experiment

2.2 最陡爬坡試驗結果與分析

對PB 試驗結果分析得到的玉米粉（A）、酵母粉（C）、硫酸鎂（E）三個顯著因子進行最陡爬坡實驗，選擇PB 設計中三個因素的中間水平，即玉米粉25.00 g/L、酵母粉10.00 g/L、硫酸鎂0.38 g/L 為初始起點，最陡爬坡試驗結果見表5。響應值Y（發酵液芽胞產量）最高值出現在處理3，選擇處理3 的條件作為下一步Box-Behnken（BB）試驗設計各因素水平的中心點，即玉米粉15.00 g/L、酵母粉15.00 g/L 和硫酸鎂0.62 g/L。

表5 最陡爬坡試驗設計表Table 5 Design of steepest ascent experiment

2.3 Box-Behnken (BB)試驗結果與分析

BB 試驗結果與方差分析如表6 和表7 所示，回歸模型P=0.004（＜0.01）顯著性較高，模型多元相關性系數R2=0.9646，說明只有3.54%的變異不能由此模型解釋，失擬項P值為 0.236（＞0.05）影響不顯著，說明模型不存在失擬現象。并且模型線性P值=0.004（＜0.01）影響顯著、平方的影響P值=0.002（＜0.01）影響顯著，雙因子之間交互作用P值為0.595（＞0.05）影響不顯著。以YC11 搖瓶發酵液芽胞產量（Y）為因變量，玉米粉（A）、酵母粉（C）和硫酸鎂（E）添加濃度為自變量，應用Minitab19 軟件擬合得到非線性回歸方程：Y=113.33-5.625A+1.675C-1.300E-10.77A2-2.87C2-1.92 E2-0.10AC-1.65 AE+0.35CE。

表6 3 因素BB 試驗設計及結果Table 6 The design and results of Box-Behnken experiment

表7 BB 試驗方差分析結果Table 7 Analysis of variance of the results of Box-Behnken experiment

利用Minitab 19 軟件對回歸模型進行響應面分析，繪制響應面分析曲面圖和等值線圖（圖1）。由圖及軟件可直觀分析出此模型具有最大值，運用Minitab 19 軟件響應優化器計算得到，各顯著營養因子在發酵培養基中最佳濃度為：玉米粉13.74 g/L、酵母粉15.73 g/L 和硫酸鎂0.59 g/L，在此條件下理論預測YC11菌株的芽胞產量可達114.4×108cfu/mL。

圖1 芽胞桿菌YC11 芽胞產量與不同營養成份的響應面優化Fig.1 Response surface optimization of the spore production by YC11 strain with different nutrients

2.4 最優培養基的搖瓶發酵驗證

YC11 菌株在上述優化培養基中進行了3 次重復搖瓶發酵驗證。發酵液芽胞產量平均值為（116.6±2.1）×108cfu/mL，與預測值（114.4×108cfu/mL）相當，較優化前芽胞產量（70.8±3.1×108cfu/mL）提高了64.7%。

2.5 500 L 發酵罐發酵驗證

貝萊斯芽胞桿菌YC11 菌株在500 L 罐發酵驗證中，發酵28 h 取樣涂片鏡檢，芽胞形成率為98%，菌體大小整齊。發酵38 h 取樣涂片鏡檢，約20%芽胞脫落，且芽胞整齊，未發現營養體。28 與38 h 鏡檢圖片見圖2 和圖3。停止發酵，測得發酵液芽胞產量為（150.2±3.9）×108cfu/mL，較搖瓶發酵提升了25%以上。

圖2 500 L 發酵罐28 h 培養物鏡檢Fig.2 Microscopic examination of fermentation culture of YC11 in 500-L fermenter 28 h after inoculation

圖3 500 L 發酵罐38 h 培養物鏡檢Fig.3 Microscopic examination of fermentation culture of YC11 in 500-L fermenter 38 h after inoculation

2.6 YC11 發酵液對煙草黑脛病防效

盆栽試驗結果表明，YC11 發酵液對煙草黑脛病具有良好的防控效果，能有效降低病情指數。YC11發酵原液和5 倍發酵稀釋液對煙草黑脛病防效分別為100%和84.06%，其中原液防效顯著高于對照藥劑烯酰嗎啉（表8）。

3 討論

通過優化發酵培養基的組成提高微生物菌株的發酵水平，是芽胞桿菌生防菌劑產業化開發中的一項重要工作。響應面實驗是優化培養基配方、培養條件及發酵參數等普遍采用的方法[18,20,22,26]。一般培養基的優化多基于芽胞或活菌的產量[15,18]、發酵液的抑菌活性[14,19,22,26]或目標產物的產量[20]進行優化。由于目前基于芽胞桿菌的生物殺菌劑多以芽胞數作為質量控制指標，因此，在開展本研究時，以發酵液芽胞產量作為考核指標對搖瓶發酵培養基進行優化。

前人有關貝萊斯芽胞桿菌培養基優化的研究多集中于采用可溶性培養基成分。一株抗金銀花白粉病菌貝萊斯芽孢桿菌HC-8 更喜好蛋白胨、麥芽糖及酵母膏[11]，而抗煙草花葉病毒的貝萊斯芽胞桿菌Z5 菌株的最適碳源和氮源分別為葡萄糖和酵母膏[27]。而對煙草黑脛病菌具有拮抗活性的貝萊斯芽胞桿菌MC2-1菌株的最適培養基成分為牛肉浸膏、酵母浸粉及麥芽糖[13]。采用農副產品，成本較低，易于獲得，易于后續的產業化開發。本文對從茶園分離的貝萊斯芽胞桿菌CY30 的發酵培養基優化的結果表明，甘薯粉及酵母膏對其芽胞的形成影響最大[18]。本研究中，對YC11 菌株芽胞產量影響最為顯著的營養成分為玉米粉、酵母粉和硫酸鎂，說明即使是同一種芽胞桿菌的不同分離株的營養需求也存在差異。

不同的貝萊斯芽胞桿菌菌株產胞水平存在較大的差異。在本研究中，僅對YC11 菌株的發酵培養基進行了優化，使該菌株的芽胞產量達到了116.6 億芽胞/mL，而進一步在500 L 發酵罐中驗證，發酵水平達到了150 億芽胞/mL 以上。李姝江等[26]通過優化發酵參數，使ZJ20 菌株在可溶性培養基的產芽胞水平達到了76.9 億芽胞/mL。而貝萊斯芽胞桿菌CY30 菌株在優化培養基中的產芽胞水平為97.5 億芽胞/mL[18]。由于不同研究者所用的菌株的研發目的不同，而且所選擇的培養基的成分也不相同，很難比較不同菌株之間的發酵水平及活性差異。但在多項以可溶性營養成分進行培養基優化的研究中，不同貝萊斯芽胞桿菌菌株的產芽胞水平相對較低[15,21,26]，是否與可溶性營養成分含量較低有關還需深入研究。