Rufibacter hautae NBS58-1胞外多糖的抗氧化活性及其在草莓保鮮中的應用

李春雨,屈建航,周 佳,趙 帥,羅 宇

河南工業大學 生物工程學院,河南 鄭州 450001

微生物胞外多糖(exopolysaccharides,EPS)是微生物在生長代謝過程中產生的對其本身有保護作用的生物高聚物,具有獲取成本較低、制備方法簡便、天然、無毒、可生物降解等優點。近年來,大量研究表明微生物EPS具有乳化、絮凝、抗氧化、抗腫瘤、免疫調節、抗炎和降血糖等多種活性[1],在醫藥、食品、化工等領域具有較高的經濟價值和廣闊的應用前景。

微生物EPS具有較好的抗氧化能力,能減輕自由基等對機體造成的氧化損傷。臧文晶等[2]發現腸膜明串珠菌LeuconostocmesenteroidesHDE1的胞外多糖具有較高的抗氧化活性并與質量濃度呈正相關。喬少婷等[3]報道嗜熱鏈球菌StreptococcusthermophilusMGB80-7胞外多糖質量濃度為0～1 mg/mL時,EPS對超氧陰離子的清除能力優于陽性對照(Vc)。劉哲[4]發現兩種微藻胞外多糖分別與殼聚糖復配后用于圣女果保鮮,比單一使用殼聚糖分別增加了4、6 d的貨架期。Yuan等[5]在研究中發現強雄腐霉胞外多糖PEPS-2具有較好的體外抗氧化能力,可顯著提高草莓采后的生理品質,有效延緩草莓腐爛、延長貨架期。

抗氧化劑能有效防止或延緩氧化,但人工合成抗氧化劑往往毒副作用較大、應用范圍窄,因此尋找新型抗氧化劑成為當前的研究趨勢。微生物胞外多糖有望成為天然抗氧化劑開發的重要對象,在食品、醫藥等行業備受國內外研究者的關注。作者對紅桿菌RufibacterhautaeNBS58-1的胞外多糖進行提取純化,分析其單糖組成和分子量,并對抗氧化活性及應用進行探究,為微生物胞外多糖的菌物資源開發及其相關應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

菌株：RufibacterhautaeNBS58-1,為河南工業大學環境微生物技術團隊自太湖淤泥中分離篩選和鑒定[6]。

R2A培養基[6]：葡萄糖0.5 g/L、酵母浸粉0.5 g/L、酸水解酪蛋白0.5 g/L、胰蛋白胨0.5 g/L、可溶性淀粉0.5 g/L、K2HPO4·3H2O 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、丙酮酸鈉0.3 g/L,pH 7.0。固體培養基加入瓊脂粉15 g/L,115 ℃滅菌30 min。

產糖培養基[7]：經優化后的產糖培養基成分為蔗糖14.13 g/L、酵母浸粉1 g/L、可溶性淀粉0.5 g/L、K2HPO4·3H2O 0.3 g/L、MgSO4·7H2O 0.05 g/L、丙酮酸鈉0.3 g/L、pH 7.5,115 ℃滅菌30 min。

草莓：從當地水果超市購買大小、形狀和成熟度相似且無視覺缺陷的新鮮草莓。

1.2 試劑與儀器

蔗糖、酵母浸粉、可溶性淀粉、丙酮酸鈉、無水乙醇、瓊脂粉、正丁醇、三氯化鐵：分析純,天津市科密歐化學試劑有限公司;抗壞血酸：分析純,北京奧博星生物技術有限公司;三氟乙酸、磷酸、DPPH、ABTS、鐵氰化鉀：生工生物工程(上海)有限公司;硫代巴比妥酸、1,10-菲羅啉：北京索萊寶科技有限公司;氯仿：鄭州軒之成化工科技有限公司。

TGL-16G高速離心機：上海安亭科學儀器廠;旋轉蒸發儀：鄭州長城科貿有限公司;UV-2450紫外可見分光光度計、LC-20AD高效液相色譜儀、LC20AT高效液相色譜泵、RID-20示差折光檢測器：日本Shimadzu(島津)公司;酶標儀：美國Bio Tek公司;WYT手持式折射儀：成都豪創光電儀器有限公司;Sepharose CL-6B 柱：上海聯碩生物科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株培養

將-80 ℃存放的菌種于R2A固體培養基上進行活化。挑取NBS58-1新鮮菌落,接種至R2A液體培養基中培養(28 ℃,150 r/min)58 h作為種子液,將種子液以5%(V/V)的接種量接至產糖培養基中培養(23 ℃,150 r/min)2 d進行發酵產糖。

1.3.2 胞外多糖的提取純化

胞外多糖的提取純化方法參照Wang等[8]的方法并稍加修改。發酵液10 000 r/min離心10 min,取上清液通過旋轉蒸發儀(55 ℃,0.1 MPa)濃縮至原體積的1/5。加入Sevag試劑(V(氯仿)∶V(正丁醇)=4∶1)對濃縮液除蛋白,之后加入4倍體積無水乙醇,沉淀冷凍干燥得到粗多糖。蒸餾水溶解粗多糖,在蒸餾水中透析2 d,透析后的溶液使用0.22 μm濾膜過濾,經Sepharose CL-6B 柱(2.5 cm×60 cm)純化,收集餾分再次醇沉,凍干得到該菌的胞外多糖,命名為EPS-1。

1.3.3 胞外多糖單糖組成測定

以甘露糖、核糖、鼠李糖等制作混合標準對照溶液,衍生后經檢測繪制標準曲線。用三氟乙酸(2 mol/L)將樣品酸解(120 ℃,4 h),所得酸解產物經NaOH、PMP-甲醇衍生后,利用高效液相色譜測定并結合標準品出峰時間得到EPS-1單糖組成。

1.3.4 胞外多糖分子量測定

采用水相凝膠滲透色譜(Gel permeation chromatography,GPC)測定純化后EPS-1的分子量,流動相為0.1 mol/L NaNO3和0.05% NaN3,流速為0.6 mL/min,進樣量為20 μL。

1.3.5 胞外多糖體外抗氧化活性檢測

(1)參照Hu等[9]使用的方法測定EPS-1對羥基自由基的清除率,羥基自由基清除率=(D0-D1+D2)/D0×100%,其中,D1為加入EPS-1反應的吸光度,D0為用蒸餾水替代EPS-1的反應結果,D2為用蒸餾水替代H2O2的結果。同時,以抗壞血酸(Vc)作為陽性對照。

(2)參照Wang等[10]使用的方法測定EPS-1對ABTS自由基的清除率,ABTS清除率=(D0-D1+D2)/D0×100%。

(3)參照Tang等[11]使用的方法測定EPS-1對DPPH自由基的清除率,DPPH清除率=(D0-D1+D2)/D0×100%。

(4)參照Chen等[12]的方法測定EPS-1的總還原力。

1.3.6 胞外多糖在草莓保鮮中的應用

使用75%乙醇先對草莓表面進行噴霧消毒處理,自然風干后將所有草莓分為兩組：A組在8% EPS-1溶液中浸泡5 min,風干,然后室溫放置7 d;B組作為對照組,將草莓浸泡在超純水中,并與A組以相同的方式操作。

(1)采用Martínez等[13]使用的方法檢測草莓果實的質量損失率。每24 h測定1次草莓的質量,計算草莓質量損失率。質量損失率=(m1-m2)/m1×100%,其中,m1為樣品初始質量,g;m2為儲存后樣品質量,g。

(2)采用手持式折射儀WYT測定草莓中可溶性固形物含量(SSC)并以百分比表示。

(3)參照Jiang等[14]使用的方法測定草莓中MDA(丙二醛)含量。將1 g草莓樣品和5 mL預冷的5%三氯乙酸放置冰上研磨,研磨液于4 ℃離心15 min(10 000 r/min)。將2 mL上清液與2 mL 0.67%的硫代巴比妥酸混合,100 ℃水浴20 min后迅速冰浴5 min,4 ℃離心15 min(10 000 r/min)后分別測定上清液在450、532、600 nm處的吸光度。MDA含量=6.45×(D(532)-D(600))-0.56×D(450)。

(4)采用袁志香[15]使用的方法繪制抗壞血酸標準曲線并測定草莓中抗壞血酸含量。同1.3.6中(3)的方法研磨草莓并離心后,向上清液中加入5% 三氯乙酸、無水乙醇、0.4%磷酸、0.5% 1,10-菲羅啉和0.03%三氯化鐵溶液各1 mL,混合均勻后在30 ℃反應1 h并記錄在510 nm處的吸光度,對照標準曲線計算VC含量。

1.4 數據處理

所有試驗設置3個平行,結果以“平均值±標準差”表示。使用Excel 2019分析數據、SPSS 26分析差異顯著性、Origin 2021b制圖。

2 結果與分析

2.1 單糖組成與分子量分析

如圖1所示,該多糖由葡萄糖、甘露糖、核糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、巖藻糖和葡萄糖醛酸組成,摩爾比為80.33∶11∶2.84∶2.74∶1.79∶0.61∶0.26∶0.17∶0.15∶0.1。GPC檢測結果顯示EPS-1分子量為4 652。

圖1 胞外多糖EPS-1高效液相色譜圖Fig.1 HPLC spectrum of exopolysaccharide EPS-1

2.2 胞外多糖抗氧化活性分析

EPS-1對ABTS自由基的清除能力如圖2(a)所示,在0～5 mg/mL范圍內,其清除率隨著質量濃度的增加顯著增大,但在同一質量濃度下,EPS-1的清除率均顯著低于陽性對照Vc。EPS-1質量濃度為5 mg/mL時對ABTS自由基的清除率達到(81.48±2.09)%,與發酵乳桿菌CECT 5716 EPS(8 mg/mL)的清除率(35.37±1.24)%相比,具有一定優勢[16]。

DPPH是一種很穩定的自由基,EPS可提供電子或氫將DPPH自由基還原為非自由基形式(DPPH-H),從而發揮抗氧化作用[17]。如圖2(b)所示,EPS-1、Vc對DPPH自由基的清除能力均與質量濃度呈正相關,在質量濃度為5 mg/mL時,清除率分別為(41.47±0.37)%、100%,說明此濃度范圍內EPS-1對DPPH的清除能力有限,在實際應用中可考慮增加其使用濃度以提高清除率。

羥基自由基很容易穿過細胞膜,形成斷裂的DNA鏈,并具有引發癌癥、突變和細胞毒性的能力,是生物系統中最活躍的自由基[18]。如圖2(c)所示,EPS-1與Vc均表現出羥基自由基清除活性,且呈劑量依賴。EPS-1質量濃度為5 mg/mL時對羥基自由基的清除率達到(91.59±0.73)%,此時的清除率仍顯著低于Vc,但高于丁濤等[19]報道的乳酸芽孢桿菌胞外多糖的清除率,表明EPS-1在羥自由基清除方面具有一定的優勢。

總還原力是評價樣品抗氧化活性的重要指標,具有還原力的物質可以提供氫原子來阻斷過氧化物的形成,進而破壞自由基反應鏈,展現抗氧化能力[2]。如圖2(d)所示,在0～5 mg/mL范圍內,EPS-1的總還原力隨著質量濃度的增大而增大,5 mg/mL時的D(700)為0.29,表明EPS-1具有一定的還原能力。

方偉等[16]報道的發酵乳桿菌(Lactobacillusfermentium)CECT 5716的EPS在質量濃度為8 mg/mL時,對DPPH和ABTS自由基的清除率分別為(84.17±1.30)%和(35.37±1.24)%。王琪[20]從羅漢果內生菌篩選出產胞外多糖菌株,命名為Bacillussp.LHG-3,所產EPS-A(10 mg/mL)和EPS-B(10 mg/mL)對羥基自由基的清除率分別為(70.12±1.12)%和(68.51±0.58)%,對DPPH自由基的清除率分別為(60.57±0.43)%和(65.72±0.24)%,對ABTS自由基的清除率分別為(78.67±0.16)%和(80.51±0.15)%。鄺嘉華等[21]研究解淀粉芽孢桿菌DMBA-K4所產EPS的抗氧化活性,當EPS質量濃度為5 mg/mL時,對DPPH自由基清除率高達78.60%,對羥基自由基清除率為75.47%,表明該EPS具有較強的抗氧化活性。本研究中RufibacterhautaeNBS58-1的胞外多糖EPS-1在質量濃度為5 mg/mL時對ABTS、DPPH和羥基自由基的清除率分別為(81.48±2.09)%、(41.47±0.37)%和(91.59±0.73)%。相比較之下,R.hautaeNBS58-1 EPS-1能更有效清除羥基、ABTS和DPPH自由基。

2.3 草莓質量損失率分析

草莓的質量損失率是反映草莓儲藏過程中呼吸速率和水分蒸發的重要參數。如圖3所示,EPS組和對照組草莓果實質量損失率隨著儲藏時間的增加均不斷增大,同一時期,二者質量損失率差異均不顯著,但EPS組的質量損失率均小于對照組。存放7 d時,對照組的質量損失率為(59.41±3.02)%,而EPS處理組的質量損失率為(55.58±0.89)%,說明經EPS-1處理后能在一定程度上減少草莓水分的蒸發,降低草莓的質量損失率。

圖3 草莓果實質量損失率Fig.3 Mass loss rate of strawberry fruit

2.4 SSC含量分析

水果中的可溶性固形物主要是糖和有機酸,測定SSC含量可以反映果實中營養物質的保留情況[22]?？扇苄怨绦挝锖康鸵馕吨麑嵦鸲葧S之降低[23]。兩組草莓果實中SSC含量變化如圖4所示,0～7 d,二者SSC含量均呈現出先增大后減小的趨勢,可能是因為草莓原始代謝過程中碳水化合物轉化為糖和其他可溶性化合物,從而使SSC含量增加;之后呼吸過程中又快速消耗SSC,導致其含量下降[14]。在第2天時,EPS組和對照組草莓中SSC含量達到最大且兩組間差異不顯著,分別為(9.17±0.12)%和(8.93±0.15)%,第2天后,SSC含量開始下降。儲藏7 d,EPS組SSC含量為(7.03±0.12)%,顯著高于對照組SSC含量(6.27±0.21)%。表明EPS-1的使用減少草莓呼吸過程中對SSC的消耗,更有利于保持可溶性固形物含量、維持草莓的品質和風味,從而提高草莓的儲藏保鮮效果。

圖4 草莓果實中SSC含量變化Fig.4 Change of SSC content in strawberry fruit

2.5 MDA含量分析

MDA是膜脂過氧化最重要的產物之一,它的產生會加劇膜的損傷,測定MDA的含量可了解草莓膜脂過氧化的程度[24]。如圖5所示,隨著儲藏時間的增加,MDA的含量也隨之增加,2～7 d,對照組MDA含量均顯著高于EPS組,在第7天時,EPS組和對照組的MDA含量分別達到4.07 μmol/L和4.39 μmol/L?？赡苁荅PS-1涂層限制水果組織中的氧氣供應,從而減少脂質過氧化,還可作為抗氧化劑,減少草莓組織中的氧化應激[25]。結果表明,EPS-1可有效降低MDA含量,減緩草莓氧化損傷程度。

圖5 草莓果實中MDA含量變化Fig.5 Change of MDA content in strawberry fruit

2.6 Vc含量分析

抗壞血酸標準曲線回歸方程：Y=0.021 3X+0.116(R2=0.997 2)?？箟难嵩谒w內主要起清除自由基和延緩細胞衰老的作用[26],如圖6所示,不同處理后草莓果實中Vc含量先升后降,EPS組在第2天時Vc含量達到最大,為(35.6±0.43) μg/g,對照組在第1天時Vc含量達到最大,為(33.56±0.58) μg/g。第6天后,兩組草莓中的Vc含量開始顯著下降,在第7天時,EPS組Vc含量下降到(23.63±0.67) μg/g,但仍顯著高于對照組(P<0.05),表明EPS-1可以減緩Vc氧化的速率,延長草莓果實的存放時間。

圖6 草莓果實中Vc含量變化Fig.6 Variation of Vc content in strawberry fruit

3 結論

本研究從RufibacterhautaeNBS58-1發酵液中分離純化得到胞外多糖EPS-1,為一種主要含葡萄糖和甘露糖的小分子量雜多糖,能有效清除羥基、ABTS和DPPH自由基,其中對羥基自由基清除效果最好,并具有良好的還原能力。草莓經EPS-1涂膜后,能顯著降低果實的MDA含量,延緩可溶性固形物的降解和Vc的氧化,有利于提升采摘后草莓的質量,延長草莓貨架期。EPS-1展現出較好的抗氧化活性,后續需進一步對EPS-1的結構進行深度的解析,并探究抗氧化活性與結構的構效關系,以進一步明確其應用潛力。