飼用秸稈纖維素分解菌的分離與培養

汪 茜，周泉佚

（定西市種草飼料站，甘肅 定西 743000）

纖維素是地球上最豐富的天然有機物，也是一種極其豐富的可再生資源，廣泛存在于自然界中，占植物界總碳含量的50%以上。我國的秸稈資源非常豐富，據統計，我國每年秸稈產量超過8億t，占世界秸稈總產量的1/5[1]。但這些豐富的秸稈資源利用率非常低，主要原因是秸稈中含有大量的纖維素、木質素以及半纖維素等難以降解的成分，而且纖維素除了反芻動物可以利用部分外，豬、雞等單胃動物都無法利用。利用化學方式處理和加工秸稈是比較普遍的做法，主要是通過酸性或者堿性的化學物質對秸稈進行處理。酸堿處理對分解玉米秸稈纖維素具有一定效果，但處理后的玉米秸稈需進行沖洗或者中和酸堿后才能飼喂或者發酵，不僅浪費了水資源，而且產生的廢液也會造成環境污染。除了用酸堿處理秸稈外，生產中使用較多的化學處理方法還有氨化法，氨化后的秸稈木質纖維素被破壞，營養價值提高，但也有研究表明用尿素氨化后的秸稈殘氮量較低[2]，而且在生產中應用氨化法成本較高。因此，用生物方法分解秸稈纖維素已成為飼料工業研究和發展的方向之一。

目前，纖維素的利用方法主要包括傳統方法和酶解方法。傳統方法主要指堆肥、青貯等發酵方式[3-4]。酶解法雖然應用不廣泛，但卻是目前最成熟的生物降解方法，它利用某些微生物產生的纖維素酶將秸稈中的纖維素水解成纖維素二糖或葡萄糖[5-7]，使纖維素進一步分解，增加可溶性糖的含量，使其更容易被家畜消化。秸稈分解過程中需要多種酶，其中纖維素酶對促進秸稈降解起著重要作用，但是自然環境中的秸稈纖維素分解菌較少，其在土壤中產生的纖維素酶活性較低，無法完全降解自然環境中的秸稈纖維素，因此添加外源秸稈分解菌成為促進秸稈纖維素降解的有效途徑[8]。本研究旨在從自然腐殖土樣中篩選出分解秸稈能力強且可以應用于秸稈發酵的菌株，從而為飼用秸稈中纖維素的降解提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

土壤取樣：在枯枝落葉腐爛較嚴重處采集腐殖土，地點位于甘肅農業大學草業學院實驗基地，使用土鉆從地表0～20 cm處采集土壤樣品，取回的土樣放置于陰涼處風干，備用。

1.2 培養基

初選平板培養基為羧甲基纖維素鈉培養基[9]：羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）10 g，Na2HPO42.5 g，KH2PO41.5 g，蛋白2.5 g，酵母膏0.5 g，瓊脂18 g，去離子水1 000 mL。pH值為7.0～7.4。

復選平板培養基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）：去皮馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，去離子水1 000 mL。

以上培養基均在121 ℃高溫滅菌25 min后使用。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的分離與篩選 首先，配制羧甲基纖維素鈉培養基，將其倒入培養皿中，使用前倒置1 d。將采集的腐殖土樣稱量10 g，倒入裝有90 mL無菌水的三角瓶中，密封后將三角瓶置于搖床上振蕩15 min，靜置；將1 mL上清液加入裝有9 mL無菌水的1號試管中，混合均勻后，將1號試管中的溶液吸取1 mL加入裝有9 mL無菌水的2號試管中，依次處理3號試管，得到稀釋土壤樣品的濃度為10-2、10-3、10-4。將上述土壤樣品稀釋液均勻涂布于培養基上，每個梯度設置5個重復。接種完成后將所有培養皿倒置，并在25 ℃的培養箱中培養7 d。7 d后，將質量濃度為1 mg/mL的剛果紅（CR）溶液覆蓋在長出菌落的培養基上，15 min后將CR溶液倒出，再繼續加入質量濃度為1 mol/L的NaCl溶液，15 min后再將NaCl溶液倒出，此時產生纖維素酶的菌落周圍將會出現一個透明圈[10-13]。

菌株的初步篩選采用剛果紅染色法[14]。染色結束后，在纖維素分解菌分解的位置會形成透明的水解圈，通過測量菌落直徑以及透明圈直徑，從而計算水解圈R（D/d），對纖維素分解菌的分解能力進行初步篩選判斷。

水解圈R=透明圈直徑（D）/菌落直徑（d）（1）

式中，R值表示透明圈直徑與菌落直徑的比值，一般來講，纖維素分解菌的降解能力與R值呈正相關關系。R值作為纖維素降解能力的參數之一，可用于初步篩選菌株是否具有降解纖維素的能力。

1.3.2 菌株的純化 將篩選出的菌株轉接到裝有馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基的培養皿中，繼續培養7 d，重復多次進行純化，將得到的純菌株進行編號并保存[15]。

2 結果與分析

2.1 土樣初篩結果

利用羧甲基纖維素固體培養基從腐殖土中初步分離出纖維素分解菌，經過多代分離純化和篩選比較，得到2株具有纖維素分解能力的菌株，分別標記為F-1和F-2，2個菌株在羧甲基纖維素鈉培養基上的生長速率見表1。

表1 菌株在羧甲基纖維素鈉培養基上的生長速率

從表1可以看出，F-1和F-2在羧甲基纖維素鈉培養基上都能較好地生長。土樣稀釋液濃度為10-3時，F-1和F-2在培養第3天時的菌落數量和菌落平均直徑差別不明顯，土樣稀釋液濃度為10-4時，F-1在培養第3天時的菌落數量比F-2多，且菌落平均直徑比F-2大。從培養第6天的菌落數量來看，無論土樣稀釋液濃度為10-3還是10-4，2種菌株的菌落數量均發生明顯變化，F-1的菌落數量明顯多于F-2，但2種菌株的菌落平均直徑大致相同。

2.2 剛果紅染色結果

剛果紅染色法基本原理是剛果紅可以與培養基中的纖維素形成紅色復合物，但當纖維素酶將纖維素分解后，剛果紅與纖維素的復合物就無法形成，會在培養基中出現以纖維素分解菌為中心的透明圈，因此是否產生透明圈可以作為纖維素分解菌的一個初篩標準。將剛果紅染液倒入含有纖維素的培養基中，再用NaCl漂洗，可以洗去結合不牢的剛果紅，從而留下大大小小的透明圈。剛果紅染色法處理后3個梯度的菌落及透明圈見圖1。

圖1 不同梯度的菌落透明圈

通過剛果紅染色發現，在稀釋濃度為10-3和10-4的平板培養皿中，可觀察到一些菌落周圍有清晰的透明圈。具有清晰透明圈的菌株有2種，分別挑取這2種菌落轉接于馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上進行進一步純化。由于稀釋濃度10-2過大，無法準確觀察到菌落周圍的透明圈，所以不作比較。結果表明，以腐殖土為材料的土壤稀釋液中可提取出2株纖維素分解菌，2株菌株在不同稀釋濃度下的菌落直徑及菌落周圍透明圈的直徑比較見表2。

表2 不同稀釋濃度下的菌落直徑及菌落周圍透明圈直徑

在用剛果紅染色法處理過的培養基上可以看到清晰的透明圈，通過測量不同梯度下2株菌株的菌落直徑以及菌落周圍的透明圈直徑，可以計算出不同梯度下透明圈與菌落直徑的比值，從而初步判斷2株菌株對纖維素的分解能力。結果顯示，在稀釋濃度為10-3和10-4時，F-2的透明圈直徑均比F-1的大，而且F-2的透明圈直徑與菌落直徑的比值也比F-1的大。綜合可知，在稀釋梯度為10-3和10-4時，F-2菌株對纖維素的分解能力要略強于F-1的分解能力。通過對2株菌株的比較，可以篩選出透明圈直徑大、透明圈直徑與菌落直徑比值大的菌株。稀釋梯度為10-2時，由于土壤樣品的稀釋濃度太大，培養出的菌落太多而連成片，不易分離和觀察，因此該稀釋梯度下的結果不作為考量。

3 討論

試驗結果表明通過培養基分離，純化土壤中的纖維素分解菌的方法是可行的，得到的2株纖維素分解菌分解纖維素的能力都較強。稀釋濃度為10-3時，F-1和F-2的透明圈直徑與菌落直徑的比值分別為8.06和10.30；稀釋濃度為10-4時，F-1和F-2的比值分別為5.22和6.10。2種菌株的纖維素分解能力不同，在不同稀釋濃度下F-2的分解能力均比F-1的強。

纖維素分解菌主要通過纖維素酶降解纖維素，但由于時間所限，纖維素酶的活力并未測定，因此對于纖維素分解菌對纖維素的分解能力只能通過試驗中測得的2種菌株的生長速率以及透明圈直徑與菌落直徑的比值進行初步判斷。此外，由于采集的腐殖土土樣過于單一，所以得到的具有分解纖維素能力的菌株并不多，且由于對土壤樣品的稀釋濃度把握不準確，導致稀釋濃度過大，部分菌落連成片地生長，對菌落分離、純化產生了一定影響，干擾了試驗的準確性。

分解纖維素微生物的分離純化方法有很多，但多以羧甲基纖維素固體培養基分離為主[16-17]。近年來的研究表明，羧甲基纖維素固體培養基和赫奇遜濾紙條液體培養基在分離纖維素分解菌的過程中應用較多，但2種培養基分離出的菌株及種類存在較大差異，因此一般在試驗中將2種培養基篩選方法結合應用[18]。本研究中，分離纖維素分解菌時，僅使用了羧甲基纖維素固體培養基，導致纖維素分解菌類型較少，因此在后續纖維素分解菌分離試驗中應將這2種培養基分離方法結合起來，以進一步提高分離效率及準確性。

4 結論

通過對腐殖土樣中的菌種進行培養、分離及多次轉接純化，并利用剛果紅染色法復篩，得到了2株具有纖維素降解能力的菌株；通過透明圈直徑與菌落直徑比值初步分析2株菌株的纖維素降解能力，發現本試驗中篩選到的F-2可以作為降解秸稈纖維素的待培養菌種資源，但其對秸稈纖維素的降解效果還需進一步研究。