Box-Behnken設計—響應面法優化地參總三萜酸純化工藝

李金金 葉明燕 姚歡 吳應梅 周濃

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.011

摘要：【目的】建立響應面模型優化合適樹脂下地參總三萜酸的純化工藝，為研究地參總三萜酸活性提供技術參考?！痉椒ā窟\用Box-Behnken設計方法，采用大孔樹脂吸附純化地參總三萜酸，以吸附率和解吸率為指標，測定5種大孔樹脂（AB-8、D101、HPD600、DA201和S-8型）對地參總三萜酸的純化效果。以上樣濃度、上樣流速、洗脫濃度和洗脫流速為自變量，回收率為因變量，運用響應面法優化地參總三萜酸純化工藝參數?！窘Y果】最佳顯色條件：顯色溫度60℃，5%香草醛—冰乙酸0.2 mL，高氯酸0.4 mL，檢測波長545 nm。AB-8型樹脂對地參總三萜酸的吸附和解吸效果最佳，解吸率為88.61%，吸附率為70.54%。上樣體積在40 mL，80%乙醇100 mL為最佳洗脫體積。建立的回歸方程：Y=0.6887+0.0196A-0.0085B-0.0287C+0.0052D+0.0299AB-0.0107AC-0.0122AD+0.0128BC+0.0211BD+0.026A2-0.0765B2-0.0877C2-0.0932D2（A為上樣濃度，B為上樣流速，C為洗脫濃度，D為洗脫流速，Y為總三萜酸回收率）。由Box-Behnken方差分析結果可得，上樣濃度和洗脫濃度2個因素，以及上樣濃度與上樣流速的交互作用、洗脫濃度與洗脫流速的交互作用對地參總三萜酸回收率影響極顯著（P<0.01），上樣流速與洗脫流速的交互作用對總三萜酸回收率影響顯著（P<0.05），4個因素對地參總三萜酸回收率影響順序為洗脫濃度>上樣濃度>上樣流速>洗脫流速。優化后的地參總三萜酸純化工藝：上樣濃度0.66 mg/mL、上樣流速2 BV/h、洗脫濃度80%、洗脫流速2 BV/h，在此條件下，總三萜酸平均回收率為67.37%?！窘Y論】建立的回歸模型可用于地參總三萜酸純化工藝的預測；AB-8型大孔樹脂對地參總三萜酸的分離純化效果較好，適用于總三萜酸物質的純化。

關鍵詞：地參；總三萜酸；大孔樹脂；純化工藝；響應面法

中圖分類號：S567.239? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2023）06-1697-14

Purification process of total triterpenic acids from Lycopus lucidus Turcz. by Box-Behnken design-response surface methodology

LI Jin-jin1，2， YE Ming-yan1，2， YAO Huan1，2， WU Ying-mei1， ZHOU Nong1，2*

（1College of Biological and Food Engineering，Chongqing Three Gorges University，Chongqing? 404120，China；

2Chongqing Engineering Laboratory for Green Planting and Deep Processing of Genuine Medicinal Materials in

Three Gorges Reservoir Area，Chongqing 404120，China）

Abstract：【Objective】A response surface model was established to optimize the purification process of total triterpenic acids from Lycopus lucidus Turcz. with suitable resin，so as to provide technical reference for further study on the activity of total triterpenic acids from L. lucidus. 【Method】Using the Box-Behnken design method， the total triterpenic acids of L. lucidus was purified by macroporous resin adsorption. The purification effects of macroporous resins （AB-8 type， D101 type， HPD600 type， DA201 type and S-8 type） on total triterpenic acids of L. lucidus were determined by using the adsorption rate and desorption rate as indexes. The sample concentration，sample loading speed， eluent concentration and eluentvelocity were the independent variables， and recovery rate was the dependent variable. The purification process parameters of total triterpenic acids from L. lucidus were optimized by response surface methodology. 【Result】Optimum color development conditions were： color development temperature of 60 ℃， 5% vanillin-glacial acetic acid of 0.2 mL， perchloric acid of 0.4 mL， and detection wavelength of 545 nm. The results showed that AB-8 type macroporous resin had the best adsorption and desorption effectsontotal triterpenic acids of L. lucidus， withthe desorption rate of 88.61% and the adsorption rate of 70.54%. The loading volume was 40 mL， and 80% ethanol 100 mL was the best eluent volume. A regression equation was set up：Y=0.6887+0.0196A-0.0085B-0.0287C+0.0052D+0.0299AB-0.0107AC-0.0122AD+0.0128BC+0.0211BD+0.026A2-0.0765B2-0.0877C2-0.0932D2（A：sample concentration，B：sample loading speed，C：eluent concentration，D：eluent velocity，Y：recovery rate of total triterpenic acids）. According to Box-Behnken variance analysis，sample concentration， eluent concentration，the interaction between sample concentration and sample loading speed，and the interac-tion between eluent concentration and eluent velocity had extremely significant effects on the recovery rate of total triterpenic acids from L. lucidus（P<0.01）， while the interaction between sample loading speed and eluent velocity had significant effects on the recovery rate of total triterpenic acids from L. lucidus（P<0.05）. The four single factors affected the recovery rate of total triterpenic acids of L. lucidus in the order of eluent concentration>sample concentration>sample loading speed>eluent velocity from L. lucidus. The optimized purification process for total triterpenic acids of L. lucidus was： sample concentration of 0.66 mg/mL， sample loading speed of 2 BV/h， eluent concentration of 80% and from L. lucidus of 2 BV/h. Under these conditions， the average recovery rate of total triterpenic acids was 67.37%. 【Conclusion】The established regression model can be used to predict the purification process of total triterpenic acids from L. lucidus； the AB-8 type macroporous resin has a relatively good effect on the separation and purification of total triterpenic acids from L. lucidus， which is suitable for the purification of total triterpenic acids.

Key words： Lycopus lucidus Turcz.； total triterpenic acids； macroporous resin； purification process； response surface methodology

Foundation items：Chongqing Natural Science Foundation（cstc2019jcyj-msxmX0770）；Science and Technology Research Project of Chongqing Education Commission（KJQN202201231， KJQN202002712）

0 引言

【研究意義】地參（Lycopus lucidus Turcz.）又名澤蘭，是一年生草本唇形科植物，以地下部分入藥，多分布于我國東北、西北及西南地區。其野生資源環境適應性強，不僅生命力頑強，蟲害也極易防治，栽種資源豐富（羅孟禹和董開居，2006）?？側扑嵋蚓哂锌鼓[瘤、抗炎、調節血糖血脂和提高免疫力等功效而受到大眾的關注（Fukushima et al.，2006；Zhu et al.，2016；Biswas and Dwivedi，2019），但總三萜酸類物質在動植物體內含量較少，且存在形態復雜，對植物資源中總三萜酸進行提取分離純化是使其發揮更好功效的必要前提。采用醇提法對地參總三萜酸初步提取，所得總三萜酸成分為粗提物。由于粗提物中總三萜酸純度較低，地參中成分復雜，其中含有總三萜酸、多糖、多酚和黃酮等生物活性成分，且提取液中多糖成分較多，不易儲存（許泳吉等，2003；Lu et al.，2015），因而純化地參粗提液尤為重要?！厩叭搜芯窟M展】目前純化三萜酸最常見的方法是大孔樹脂吸附法（姚干等，2007；劉娜，2016），不同極性的樹脂對不同種類化合物的選擇性有所不同。杜暉和王春雨（2007）研究表明X-5型樹脂能有效富集純化夏枯草中2種五環三萜酸成分，產品中目標組分的純度和回收率較高，工藝流程簡單易行；袁懷波等（2007，2008）采用大孔樹脂對山楂和木瓜提取液進行分離純化，在上樣pH為6、洗脫液70%的條件下洗脫出山楂和木瓜總三萜酸純化物，產品的純度遠高于粗提液；樊君等（2008）利用大孔吸附樹脂對棗渣中三萜酸進行分離純化，其回收率在65%以上，純度也達80%以上；桑詠梅和丁振鐸（2011）通過D101型樹脂檢測中藥復方金匱腎氣丸中總三萜類成分，分別對總三萜酸單體及總三萜酸的吸附性能和洗脫參數進行優化，進而證明樹脂能有效吸附和解吸總三萜酸單體和總三萜酸；梁卓然（2021）對女貞果實中齊墩果酸進行提取，采用HPD300型樹脂純化后，其齊墩果酸含量可達86.53%，經高效液相色譜（HPLC）檢測，分離純化后齊墩果酸能與雜質有效分離。研究報道，非極性或弱性的樹脂可用于分離總三萜酸，AB-8型樹脂適用于黃酮、生物堿和多糖類等物質的提取分離和純化（諶江城等，2014；閔玉濤等，2015）。蒙瑞波等（2012）利用AB-8型樹脂對白花蛇舌草中總三萜酸進行提取純化，其純化參數為上樣流速2 BV/h、洗脫流速2 BV/h、洗脫乙醇體積分數80%，在該條件下，總三萜酸的純度可提升4倍，說明AB-8型樹脂對總三萜酸提取效果極大提高；王苗苗等（2020）采用AB-8型樹脂富集羅漢果莖中三萜酸，經大孔樹脂富集后三萜酸含量明顯增加；柯春山等（2021）篩選出AB-8型樹脂為純化裸花紫珠的最適樹脂，純化后溶液由渾濁變為澄清?！颈狙芯壳腥朦c】大孔吸附樹脂用于中藥材有效成分的篩選也有明顯效果（黃燕秋等，2018）。劉娜（2016）對比多種型號樹脂對澤蘭地上部分分離純化的效果，其中AB-8型樹脂對澤蘭地上部分純化的吸附量、解吸率和吸附率分別為11.82 mg/g、81.82%和55.47%。但目前針對澤蘭地下部分中總三萜酸成分純化的研究報道少有，尤其是利用大孔吸附樹脂進行純化?！緮M解決的關鍵問題】對地參總三萜酸顯色條件及純化工藝進行優化，篩選出最佳顯色條件及最優樹脂，再以最優大孔樹脂對地參總三萜酸粗提物進行純化，以回收率為考察指標，運用響應面模型優化純化工藝參數，為研究地參總三萜酸活性提供技術參考。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

地參產自重慶市萬州區（人工栽培），由重慶三峽學院生物與食品工程學院周濃教授鑒定為地參，在自然條件下烘干，粉碎后過100目篩備用。熊果酸對照品（批號DST180606-019，HPLC≥98%）購自成都德思特生物技術有限公司；無水乙醇（AR）購自重慶川東化工（集團）有限公司；香草醛（香蘭素）（AR）、冰乙酸（AR）和高氯酸（AR）購自成都市科隆化學品有限公司；S-8型樹脂購自上海吉至生化科技有限公司；AB-8型樹脂購自上海麥克林生化科技股份有限公司；D101型、HPD600型和DA201型樹脂購自鄭州和成新材料科技有限公司。主要儀器設備：高速多功能粉碎機（浙江省永康市金穗機械制造廠）、玻璃砂芯層析柱（三維實驗室玻璃儀器公司）、A2004型電子天平（上海津平科學儀器有限公司）、精密天平（METTLER YOLEDO集團）、HSY-26型數顯恒溫水浴鍋（上海躍進醫療器械有限公司）、BUCHI R-300旋轉蒸發儀（北京海富達科技有限公司）和V-1100D型可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 樣品溶液制備 稱取地參1.000±0.002 g置于錐形瓶中，平行3次，醇提法提取，過濾，濃縮，以乙醇溶液定容至5 mL，移取0.1 mL稀釋至50 mL，搖勻后測定吸光值，重復3次取平均值。

1. 2. 2 標準曲線繪制 稱取減壓干燥至恒重的對照品適量，加乙醇溶解并制成濃度為0.0985 g/mL的對照品溶液。取對照品溶液1.0 mL，用乙醇定容至500 mL，逐級稀釋；再分別精密吸取對照品溶液0.1、0.3、0.5、0.7和0.9 mL，測定其吸光值。以對照品溶液濃度為橫坐標、吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。

1. 3 檢測波長測定及顯色條件優化

1. 3. 1 檢測波長確定 精密移取對照品溶液和供試品溶液，置于試管中揮干水分，加入配制的5%香草醛—冰乙酸0.4 mL和高氯酸0.5 mL，置于水浴鍋中恒溫加熱15 min，冷卻后加入冰乙酸3.0 mL，搖勻，待測。以空白及無水乙醇為對照組，采用紫外分光光度計在200～800 nm處全波長掃描，對照品及樣品溶液均在545 nm處有最大吸收，因此在檢測波長545 nm處測定總三萜酸總量。

1. 3. 2 5%香草醛—冰乙酸用量 移取已配制對照品溶液0.5 mL，平行5份，依次加入5%香草醛—冰乙酸溶液0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL，加入高氯酸溶液0.4 mL，然后加入3.0 mL冰乙酸，按1.3.1方法測定其吸光值。

1. 3. 3 高氯酸用量 移取已配制對照品溶液0.5 mL，平行5份，加入5%香草醛—冰乙酸溶液0.4 mL，依次加入高氯酸0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL，然后加入3.0 mL冰乙酸，按1.3.1方法測定其吸光值。

1. 3. 4 顯色溫度 顯色劑：移取5%香草醛—冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.4 mL，依次置于40、50、60、70和80 ℃水浴鍋中恒溫加熱15 min，然后加入冰乙酸3.0 mL，按1.3.1方法測定其吸光值。顯色劑+對照品：移取已配制對照品溶液0.5 mL，加入5%香草醛—冰乙酸溶液0.2 mL，高氯酸0.4 mL，依次置于40、50、60、70和80 ℃水浴鍋中恒溫加熱15 min，然后加入冰乙酸3.0 mL，按1.3.1方法測定其吸光值。

1. 4 方法學考察

1. 4. 1 精密度試驗 取對照品溶液0.5 mL，平行6份，按1.3.1方法測定吸光值，并計算相對標準偏差（RSD）。

1. 4. 2 重復性試驗 取樣品溶液6份，按1.3.1方法測定吸光值，并計算RSD。

1. 4. 3 穩定性試驗 取樣品溶液0.5 mL，每隔10 min測定一次吸光值，按1.3.1方法測定吸光值，并計算RSD。

1. 4. 4 加樣回收試驗 精密移取重復性考察中供試品溶液6份，每份溶液0.2 mL，再加入0.2 mL已知含量的對照品溶液，按1.3.1方法測定吸光值，并計算加樣回收率及其RSD。

1. 5 大孔樹脂純化工藝

1. 5. 1 大孔樹脂預處理 稱量一定質量的樹脂，取96%乙醇浸泡24 h，去除樹脂的雜質和不完整碎片，使樹脂充分溶脹，采用濕法裝柱，用96%乙醇反復沖洗至流出液不產生渾濁，再用蒸餾水洗至無醇味以平衡柱子，柱子中樹脂排列均勻、無氣泡，即預處理完成，備用。

1. 5. 2 大孔樹脂篩選 測定吸附率和解吸率，以篩選大孔樹脂。靜態飽和吸附率測定：分別選擇預處理過的AB-8、D101、HPD600、DA201和S-8型樹脂適量（相當于干重2 g）置于錐形瓶中，加入精密移取的10.0 mL地參總三萜酸濃縮液（0.7282 mg/mL），在搖床中150 r/min常溫振蕩24 h，至吸附平衡，過濾，所得濾液測定其吸光值A1，計算可得總三萜酸濃度和樹脂飽和吸附率。

解吸率測定：將充分吸附飽和的樹脂吸干表面水分，置于錐形瓶中，加入無水乙醇在搖床中150 r/min常溫振蕩24 h，測定其吸光值A2，計算可得解吸液中總三萜酸濃度和洗脫液解吸率。

吸附量=（C0-C1）V/M

吸附率（%）=（C0-C1）/C0×100

解吸率（%）=C2/（C0-C1）×100

回收率（%）=C2/C0×100

式中，M為樹脂質量（mg），V為吸附液體積（mg/L），C0為吸附液中總三萜酸濃度（mg/mL），C1為吸附后溶液總三萜酸濃度（mg/mL），C2為解吸液中總三萜酸濃度（mg/mL）。

1. 6 大孔樹脂靜態吸附動力學研究

1. 6. 1 靜態吸附動力學研究 對大孔樹脂的靜態吸附能力進行考察，以吸附時間為橫坐標、吸附量為縱坐標，繪制靜態吸附曲線。在室溫條件下，稱量預處理的AB-8型大孔樹脂適量，置于100 mL錐形瓶中，精密移取地參總三萜酸提取液（0.7282 mg/mL），置于150 r/min搖床中，振蕩以測定大孔樹脂的靜態吸附能力。以接觸零時刻開始，每隔60 min取出樣液測定1次總三萜酸含量，計算樹脂吸附量，繪制靜態吸附曲線。采用準一級速率方程和準二級速率方程2個動力學模型模擬吸附過程，進一步分析AB-8型樹脂對地參總三萜酸的吸附速率情況。

準一級速率方程：ln（Qe-Qt）=lnQe+K1t

準二級速率方程：t/Qt=1/K2Qe+t/Qe

式中，t為吸附時間（min），Qt為t時刻樹脂吸附量（mg/g），Qe為平衡時樹脂吸附量（mg/g），K1和K2分別為準一級速率方程速率常數和準二級速率方程速率常數（min-1）。

1. 6. 2 吸附等溫線測定 配制不同濃度的總三萜酸提取液，在室溫條件下，150 r/min搖床振蕩24 h后測定樣液中總三萜酸濃度，計算不同濃度樣液的吸附量。以樣液濃度為橫坐標、吸附量為縱坐標，繪制樹脂吸附地參總三萜酸的等溫曲線。等溫線的擬合能進一步了解樹脂對地參總三萜酸的吸附方式，因而選擇Langmuir和Freundlich 2種等溫吸附方程線性擬合等溫線模型。

Ce/Qe=Ce/Qm+1/KLQm

lnQe=lnKF+1/nlnCe

式中，Ce為溶液平衡時的濃度（mg/mL），Qe為平衡吸附量（mg/g），Qm為飽和吸附量（mg/g），KL為Langmuir方程常數（L/mg），n和KF為Freundlich方程常數，其中KF的單位為L/mg。

1. 7 大孔樹脂動態吸附—解吸性能試驗

1. 7. 1 大孔樹脂上樣液泄露曲線 量取預處理的AB-8型樹脂適量進行動態吸附，濕法裝柱，用已知濃度的地參總三萜酸溶液（0.7282 mg/mL）上柱，流速1 BV/h，分段收集流出液，每份5 mL，收集30份流出液。以收集管吸附液編號為橫坐標、總三萜酸含量為縱坐標，繪制總三萜酸上樣液泄露曲線。

1. 7. 2 上樣濃度選擇 取已測濃度的地參總三萜酸溶液，分別加水稀釋成0.50、0.55、0.60、0.65和0.70 mg/mL不同濃度梯度進行上柱，靜止1 h，依次用80%乙醇進行洗脫，控制流速為1 BV/h，收集洗脫液，測定總三萜酸吸光值，確定最佳上樣濃度。

1. 7. 3 上樣流速選擇 取已測濃度的地參總三萜酸溶液，分別以1、2、3、4和5 BV/h流速上柱，靜止1 h，依次用80%乙醇進行洗脫，控制流速為1 BV/h，收集洗脫液，測定總三萜酸含量，確定最佳上樣流速。

1. 7. 4 大孔樹脂洗脫曲線 量取預處理的AB-8型樹脂適量進行動態洗脫，濕法裝柱，以已測濃度的地參總三萜酸溶液上柱，流速為1 BV/h進行動態吸附，待樹脂吸附平衡后，用80%乙醇進行洗脫，分段收集洗脫液，每份5 mL，收集30份流出液。以收集管洗脫液編號為橫坐標、總三萜酸含量為縱坐標，繪制洗脫曲線。

1. 7. 5 洗脫濃度選擇 取已測濃度的地參總三萜酸溶液濕法裝柱，用蒸餾水洗滌平衡，待樹脂吸附至平衡后，用50%、60%、70%、80%和90%乙醇進行洗脫，控制洗脫流速為1 BV/h，測定總三萜酸含量，確定最佳洗脫濃度。

1. 7. 6 洗脫流速選擇 取已測濃度的地參總三萜酸溶液上柱，以1 BV/h流速通過后，用80%乙醇以1、2、3、4和5 BV/h進行洗脫，收集洗脫液，測定總三萜酸含量，確定最佳洗脫流速。

1. 8 響應面設計

根據單因素試驗結果，進一步設計響應面優化試驗。選取總三萜酸純化提取效果最好的因素水平，以上樣濃度、上樣流速、洗脫濃度和洗脫流速為自變量，總三萜酸純化回收率為響應值，采用4因素3水平設計Box-Behnken Design試驗，響應面因素水平見表1。

1. 9 統計分析

采用Excel 2019、Origin 2018和SPSS 26.0處理數據及繪圖，以Design-Expert 12作響應面設計及試驗分析。

2 結果與分析

2. 1 標準曲線線性關系考察結果

于545 nm處測定吸光值，以標準品溶液濃度為橫坐標（x）、吸光值為縱坐標（y）繪制標準曲線，如圖1所示。所得回歸方程：y=4.41878x+0.0152（R2=0.9996），繪制的標準曲線在0.00197～0.01773 mg/mL范圍內線性關系良好。

2. 2 方法學考察結果

2. 2. 1 精密度試驗結果 計算所得總三萜酸平均RSD為1.75%，小于10%，表明儀器精密度良好。

2. 2. 2 重復性試驗結果 地參總三萜酸平均RSD為2.19%，小于10%，表明醇提法提取地參總三萜酸的試驗方法重復性較好。

2. 2. 3 穩定性試驗結果 由表2可知，吸光值在20～40 min內較穩定，40 min穩定性開始下降，RSD為1.12%，表明地參樣液適合在20～40 min內測定吸光值。

2. 2. 4 加樣回收試驗結果 由表3可知，回收率為96.59%～106.65%，在90%～110%范圍內，表明醇提法提取地參總三萜酸的方法可靠。

2. 3 顯色條件優化結果

由表4可知，5%香草醛—冰乙酸用量越多，吸光值最低，影響樣品的顯色效果，因而用量在0.2 mL時最合適；高氯酸隨著加入量的增加，對樣品的顯色效果影響相對較小，當高氯酸加至0.4 mL時，顯色效果最佳，故選擇高氯酸用量為0.4 mL。加入顯色劑和顯色劑+對照品2組對比（表5）發現，顯色劑組吸光值隨溫度的升高而不斷增加，在60 ℃升至70 ℃時，吸光值增加明顯，說明顯色劑對顯色效果的影響較大，綜合考慮，選取60 ℃為顯色溫度。

2. 4 不同樹脂的吸附率與解吸率

由表6可知，AB-8、D101和HPD600型樹脂均為非極性樹脂，萜類成分與非極性樹脂極性類似，3種型號樹脂的解吸率和吸附率均較高，其中AB-8型樹脂最高，解吸率和吸附率分別為88.61%和70.54%。綜合考慮吸附量、解吸率和吸附率指標，選擇AB-8型樹脂作下一步研究。

2. 5 大孔樹脂靜態吸附動力學試驗結果

2. 5. 1 靜態吸附動力學 由圖2可知，隨著吸附時間的延長，AB-8型樹脂對總三萜酸的吸附量不斷增加，在1～3 h吸附量快速增加，在3～6 h吸附量增速有所減緩，6 h之后的吸附量（3.0098 mg/g）增速進一步減緩并接近平衡，表明地參總三萜酸在6 h基本吸附完全。動力學方程（表7）顯示，準二級速率方程特征系數更高（R2>0.9900），能描述AB-8型樹脂對地參總三萜酸的吸附過程。

2. 5. 2 大孔樹脂吸附等溫線測定 地參總三萜酸經AB-8型樹脂吸附的線性等溫線和吸附等溫曲線如圖3所示，Langmuir和Freundlich方程如表8所示。Langmuir和Freundlich吸附等溫曲線模型擬合回歸方程的R2均在0.9800以上，2種模型均能描述AB-8型樹脂對地參總三萜酸的吸附作用，且Freundlich方程的R2更高。KF和n分別為Freundlich方程的模型參數和特征常數，在方程中，n>1時表明該物質易被吸附（Yildirim et al.，2001），本研究中n=3.1085>1，說明地參總三萜酸易被AB-8型樹脂吸附。

2. 6 大孔樹脂動態吸附—解吸性能試驗結果

2. 6. 1 大孔樹脂泄露曲線 由圖4可知，上樣液體積越大，流出的總三萜酸濃度逐漸增加，當上樣液體積小于55 mL時，總三萜酸濃度增加趨勢緩慢，大于55 mL時，總三萜酸濃度增加趨勢明顯。隨著上樣體積的繼續增加，AB-8型吸附逐漸趨于飽和，上樣體積大于85 mL流出的總三萜酸濃度接近于初始樣液濃度。當上樣體積為45 mL時，流出液中的濃度達初始上樣液總三萜酸濃度的10%，為大孔樹脂AB-8型的泄漏點，為保證樣品液不泄露，避免浪費，上樣體積應控制在40 mL最合適。

2. 6. 2 上樣濃度的選擇 由圖5可知，當上樣濃度小于0.65 mg/mL時，地參總三萜酸純化回收率呈上升趨勢，在上樣濃度為0.65 mg/mL時總三萜酸純化回收率達最大值，上樣濃度超0.65 mg/mL后，回收率略有下降，說明濃度過高反而影響地參總三萜酸的純化工藝。因此，最佳上樣濃度為0.65 mg/mL，選取0.60、0.65和0.70 mg/mL進行響應面試驗。

2. 6. 3 上樣流速的選擇 由圖6可知，上樣流速對地參總三萜酸純化回收率影響明顯，上樣流速過慢使得吸附時間長，從而影響總三萜酸純化，當上樣流速增至2 BV/h時吸附時間合適，對總三萜酸的純化效果最佳，地參總三萜酸純化回收率達最大值；隨著上樣流速的繼續增加，大孔樹脂層吸附萜類化合物時間短，吸附效果差。因此，最佳上樣流速為2 BV/h，選取1、2和3 BV/h進行響應面試驗。

2. 6. 4 洗脫濃度的選擇 由圖7可知，隨著洗脫濃度的增加，地參總三萜酸純化回收率逐漸提高，在洗脫濃度為80%時總三萜酸回收率達最大值，顯著高于50%和60%的回收率（P<0.05，下同），當洗脫濃度大于80%時，回收率呈下降趨勢，說明洗脫濃度越大對地參總三萜酸的純化效果越好，但達一定濃度后效果下降。因此，選擇最佳洗脫濃度為80%，并選取70%、80%和90%進行響應面試驗。

2. 6. 5 洗脫流速的選擇 由圖8可知，洗脫流速對地參總三萜酸純化回收率有明顯影響，當洗脫流速為2 BV/h時，回收率達最大值；當洗脫流速大于2 BV/h時，總三萜酸回收率顯著降低，說明流速過快對總三萜酸的洗脫效果越來越差。因此，最佳洗脫流速為2 BV/h，選取1、2和3 BV/h進行響應面試驗。

2. 6. 6 大孔樹脂洗脫曲線 由圖9可知，隨著洗脫液體積增大，地參總三萜酸濃度不斷增加，洗脫液體積對總三萜酸的洗脫效果有明顯影響；當洗脫液體積在65 mL時，總三萜酸濃度達最大值，當洗脫液體積繼續增加，總三萜酸濃度呈下降趨勢，直至洗脫液體積在100 mL時，總三萜酸濃度為0.01 mg/mL，說明此時已將總三萜酸成分洗脫完畢。因此，考慮洗脫液體積及總三萜酸洗脫效果，以80%乙醇100 mL可將地參總三萜酸成分洗脫完全。

2. 7 響應面試驗結果

2. 7. 1 響應面模型的建立 單因素試驗結果顯示，上樣濃度0.65 mg/mL、上樣流速2 BV/h、洗脫濃度80%和洗脫流速2 BV/h為最佳水平條件。在單因素試驗的基礎上，采用4因素3水平、最佳水平條件為0水平的響應面中心試驗（表9），運用Design-Expert 12進行二次多項式擬合。以地參總三萜酸純化回收率為響應值（Y），由回歸模型可得回收率與4個變量（上樣濃度、上樣流速、洗脫濃度和洗脫流速）之間的線性關系，所得二次回歸方程：Y=0.6887+0.0196A-0.0085B-0.0287C+0.0052D+0.0299AB-0.0107AC-0.0122AD+0.0128BC+0.0211BD+0.026A2-0.0765B2-0.0877C2-0.0932D2。

2. 7. 2 顯著性檢驗 由方差分析結果（表10）可知，模型F=33.10，P<0.01，為極顯著，失擬項F=1.22，P=0.4587>0.05，為不顯著，表明所選用的二次多項模型的擬合程度良好，模型成立。模型相關系數R2=0.9707，表明該回歸方程有很好的相關性，校正決定系數[R2Adj]=0.9414，表明有94.14%的響應值變化。在影響地參總三萜酸純化回收率的因素中，A、C、AB、CD、A2、B2、C2和D2影響極顯著（P<0.01，下同），BD影響顯著，而B、D、AC、AD和BC影響不顯著（P>0.05，下同）。選取的4個因素對地參總三萜酸純化回收率影響順序為C>A>B>D，即洗脫濃度對地參總三萜酸純化回收率的影響最大，洗脫流速的影響最小。

2. 8 兩因素間交互作用分析結果

由圖10可知，當上樣流速不變時，隨著上樣濃度的增加，地參總三萜酸的回收率逐漸增大，當上樣濃度為0.65 mg/mL時，回收率達峰值；上樣濃度繼續增加，回收率逐漸減小。等高線的橢圓度較大，說明上樣流速與上樣濃度的交互作用對地參總三萜酸回收率影響極顯著，與方差分析結果（表10）一致。

由圖11可知，當洗脫濃度不變時，隨著上樣濃度的增加，地參總三萜酸的回收率逐漸增大，當上樣濃度為0.65 mg/mL時，回收率達最大值；之后繼續增加上樣濃度，回收率則逐漸減小。同時，當上樣濃度不變時，隨著洗脫濃度的增加，地參總三萜酸的回收率逐漸增大，當洗脫濃度為80%時，回收率達峰值；隨著洗脫濃度繼續增大，回收率逐漸減小。等高線趨近于圓形，說明洗脫濃度與上樣濃度的交互作用對地參總三萜酸回收率的影響不顯著，與方差分析結果（表10）一致。

由圖12可知，當洗脫流速不變時，隨著上樣濃度的增加，地參總三萜酸的回收率逐漸增大，當上樣濃度為0.65 mg/mL時，回收率達峰值；隨著上樣濃度的不斷增加，回收率則逐漸減小。同時，當上樣濃度不變時，隨著洗脫流速的增加，地參總三萜酸的回收率逐漸增大，當洗脫流速為2 BV/h時，回收率達峰值；隨著洗脫流速的繼續增加，回收率逐漸減小。等高線趨近于圓形，說明洗脫流速與上樣濃度的交互作用對地參總三萜酸回收率的影響不顯著，與方差分析結果（表10）一致。

由圖13可知，當洗脫濃度不變時，隨著上樣流速的增加，地參總三萜酸的回收率逐漸增大，當上樣流速為2 BV/h時，回收率達峰值；之后隨著上樣流速的繼續增加，回收率則逐漸減小。同時，當上樣流速不變時，隨著洗脫濃度的增加，地參總三萜酸的回收率逐漸增大，當洗脫濃度為80%時，回收率達峰值；隨著洗脫濃度的繼續增加，回收率則逐漸減小。等高線趨近于圓形，說明洗脫濃度與上樣流速的交互作用對地參總三萜酸回收率的影響不顯著，與方差分析結果（表10）一致。

由圖14可知，當洗脫流速不變時，隨著上樣流速的增加，地參總三萜酸的回收率逐漸增大，當上樣流速為2 BV/h時，回收率達峰值；之后隨著上樣流速的不斷增加，回收率逐漸減小。同時，當上樣流速不變時，隨著洗脫流速的增加，地參總三萜酸的回收率逐漸增大，當洗脫流速為2 BV/h時，回收率達峰值；隨著洗脫流速的繼續增大，回收率則逐漸減小。等高線趨近于橢圓，說明洗脫流速與上樣流速的交互作用對地參總三萜酸回收率的影響顯著，與方差分析結果（表10）一致。

由圖15可知，當洗脫流速不變時，隨著洗脫濃度的增加，地參總三萜酸的回收率逐漸增大，當洗脫濃度為80%時，回收率達峰值；之后隨著洗脫濃度的繼續增加，回收率逐漸減小。同時，當洗脫濃度不變時，隨著洗脫流速的增加，地參總三萜酸的回收率逐漸增大，當洗脫流速為2 BV/h時，回收率達峰值；之后隨著洗脫流速的繼續增大，回收率則逐漸減小。等高線的橢圓度較大，說明洗脫流速與洗脫濃度的交互作用對地參總三萜酸回收率的影響極顯著，與方差分析結果（表10）一致。

響應面圖可直觀反映出兩因素對地參總三萜酸純化回收率效果的影響。由圖10～圖15可知，圖10和圖15等高線中的橢圓度大，坡度較陡，說明兩因素間的交互作用明顯，達極顯著水平；圖14等高線中的橢圓程度較大，兩因素間交互作用相對較弱，達顯著水平。圖11～圖13中，固定一個因素，地參總三萜酸回收率均隨著另一個因素的增大而減小，等高線趨近于圓形，從而表明兩因素間交互作用不明顯，與方差分析結果（表10）一致。通過Design-Expert 12的模型模擬，預測選取的4因素最佳組合：上樣濃度0.66 mg/mL、上樣流速1.97 BV/h、洗脫濃度78.34%、洗脫流速1.99 BV/h，地參總三萜酸的回收率為69.30%。

2. 9 驗證試驗結果

取地參總三萜酸濃縮液3份各10.0 mL，在模型擬合適宜試驗操作的條件（上樣濃度0.66 mg/mL、上樣流速2 BV/h、洗脫濃度80%、洗脫流速2 BV/h）下，驗證響應面法所得最佳純化工藝可實施性，收集洗脫液，測得地參總三萜酸純化的回收率分別為66.94%、67.31%和67.85%，平均回收率為67.37%，RSD為0.67%，表明AB-8型樹脂純化地參總三萜酸的優化工藝可行。

3 討論

3. 1 顯色條件分析

紫外分光光度法是分析檢測常用的方法，常以香草醛—高氯酸分光光度法對總三萜類含量進行測定（李崇陽，2016），影響該測定方法的因素較多，顯色條件的優化能更好地測定不同物種資源的萜類成分含量。在強酸條件下，可將萜類化合物結構成分氧化為羧基，形成共軛體系而顯色，進而對萜類含量進行分析測定。本研究中，地參總三萜酸在545 nm處有最大吸收峰，通過不同顯色條件的篩選，進而可得5%香草醛—冰乙酸和高氯酸的最佳加入量及顯色溫度。根據方法學中穩定性檢測結果可得比色法對地參總三萜酸的檢測在40 min內較穩定，對地參總三萜酸的測定效果較好。由于比色法操作簡便，因而作為測定總三萜酸的常用方法，但試劑用量、試驗操作時的反應時間及反應溫度等因素均對總三萜酸的測定影響較顯著，因此在優化顯色條件中，分別對5%香草醛—冰乙酸用量、高氯酸用量、顯色試劑和顯色溫度進行優化，得到5%香草醛—冰乙酸用量在0.2 mL時最合適，高氯酸用量為0.4 mL合適，5%香草醛—冰乙酸與高氯酸加入量比例為1∶2，與陶鋒等（2011）分離純化連錢草總三萜酸中顯色條件比例相同；60 ℃顯色溫度下總三萜酸的測定效果好，所得最優顯色溫度與韓偉和劉曦（2014）在枇杷葉總三萜酸的大孔樹脂分離純化工藝中顯色條件相同。由結果可知，地參總三萜酸可采用5%香草醛—高氯酸分光光度法進行測定，該操作可行，可為地參總三萜酸的相關研究提供質量控制技術。

3. 2 大孔樹脂選擇分析

大孔樹脂現已廣泛應用于天然植物中活性成分的分離純化。根據不同樹脂極性性質可分為非極性、中性和極性3類，不同樹脂型號的極性不同，吸附性能有明顯差異，因樹脂易再生、吸附富集效果好等優點在萜類化合物的純化中應用較多，且樹脂對生物活性成分純化可最大限度地提高目標物的回收率（白奪龍和楊開華，2007；李廣林，2014；王曉婷等，2022）。樹脂吸附原理是靠化合物分子之間的化學作用力，為達到純化、分離等目的可通過合適的溶劑將目標化合物洗脫出來。非極性或弱極性吸附樹脂表面的疏水性強，由不帶任何功能基團的單體聚合而成，有助于極性溶劑中非極性物質的吸附。本研究選取的AB-8、D101、HPD600、DA201和S-8型樹脂具有不同極性，以吸附量、吸附率和解吸率作為評價地參總三萜酸純化效果的指標，對5種樹脂進行篩選。因萜類成分是非極性化合物，非極性或弱極性樹脂能很好地將地參總三萜酸成分洗脫下來。AB-8和D101型樹脂均為非極性樹脂，地參中的總三萜酸所含有的五環三萜類（白樺脂酸、熊果酸和齊墩果酸）分子量較大，AB-8型樹脂的孔徑在480～520 nm，大于D101型樹脂的孔徑，能較好地吸附總三萜酸成分，達到純化效果。本研究結果表明，AB-8型樹脂與D101型樹脂對地參中的總三萜酸成分吸附效果好，其中AB-8型綜合指標更優，與李廣林（2014）對樺褐孔菌三萜提取分離試驗結果類似。此外，還考察樹脂的性能，包括樹脂的靜態吸附動力學和等溫曲線；根據動力學方程得出準二級速率方程能更好地展示樹脂的吸附過程，由動力學曲線可知AB-8型樹脂在6 h已接近飽和的吸附狀態。蔡天嬌（2017）篩選所得D101型樹脂純化紅棗三萜酸效果優于AB-8型樹脂，本研究與之對比，說明不同物種資源中同種生物活性成分的樹脂選擇及吸附能力均有一定差異；將等溫曲線進行Freundlich方程擬合，得到特征常數n>1，說明地參總三萜酸易被AB-8型樹脂吸附，吸附效果明顯。根據試驗結果可得，AB-8型樹脂吸附地參總三萜酸的方法可靠，可為樹脂大批量純化地參總三萜酸提供數據支撐。

3. 3 純化工藝分析

藥食同源植物中生物活性成分的研究有助于功能性食品資源的開發利用。地參作為菜藥兼備的植物資源，不僅營養豐富，還含有多種藥理活性成分，其中總三萜酸是藥理活性成分之一。由于地參中成分復雜多樣，對目標化合物的提取會受到其他化合物成分的影響，有效成分的分離純化可為后續該化合物的成分鑒定及體內體外功能研究打下重要基礎。本研究利用響應面模型優化上樣濃度、上樣流速、洗脫濃度和洗脫流速4個因素的工藝條件，采用最佳工藝優化出的因素參數對地參總三萜酸進行純化，回收率可達66.00%以上。陳建中等（2015）采用響應面法純化茼蒿中總黃酮，通過D101型樹脂測得黃酮回收率為87.36%，其上樣濃度達0.86 mg/mL，濃度差異可能會影響目標產物的回收率；純化工藝優化參數中的洗脫流速與陳建中等（2015）對茼蒿總黃酮分離純化的洗脫流速類似，均在2 mL/min左右。劉娜（2017）對澤蘭地上部分的總三萜酸成分進行分離純化，得出X-5型樹脂的純化效果最佳，總三萜酸的純度可達74%；本研究對澤蘭地下部分（地參）進行分離純化，因澤蘭地上部分總三萜酸含量約為地下部分的3倍，所得純化的效果均有一定差異，說明樹脂對萜類純化效果顯著，能極大提高目標化合物的純度。鄧思節（2016）對屈曲花種子總黃酮純化工藝進行優化，并分析其抗氧化活性，發現純化后的總黃酮抗氧化活性高于粗提總黃酮，說明純化物的抗氧化活性更強。不同物種資源的不同化合物采用大孔樹脂純化效果不盡相同，因而對地參總三萜酸樹脂進行純化工藝優化很有必要。地參總三萜酸在上樣濃度0.66 mg/mL、上樣流速2 BV/h、洗脫濃度80%、洗脫流速2 BV/h時純化效果最佳，與蒙瑞波等（2012）提取純化白花蛇舌草中總三萜酸的上樣流速、洗脫流速及洗脫濃度優化條件結果相同，說明該優化條件穩定可行、重復性好。本研究僅對地參總三萜酸活性成分進行純化，所得的目標產物為多種萜類成分共存，需進一步分離以測定地參中總三萜酸的單體成分，從而能進一步證明樹脂純化地參總三萜酸的效果。

4 結論

建立的回歸模型可用于地參總三萜酸純化工藝的預測；AB-8型大孔樹脂對地參總三萜酸的分離純化效果較好，適用于總三萜酸物質的純化。

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（責任編輯 羅 麗）

收稿日期：2022-09-09

基金項目：重慶市自然科學基金項目（cstc2019jcyj-msxmX0770）；重慶市教委科學技術研究項目（KJQN202201231，KJQN202002712）

通訊作者：周濃（1978-），https：//orcid.org/0000-0003-1236-8585，教授，主要從事中藥炮制與資源研究工作，E-mail：erhaizn@126.com

第一作者：李金金（1995-），https：//orcid.org/0000-0002-6663-4044，研究方向為藥食同源植物資源開發及利用，E-mail：ljjlbh1995 @163.com