基于高通量測序的明日葉不同組織內生菌群落結構分析

劉雯雯 張旭 黃奇 胡連清 陳露 周萬海 魏琴 馮瑞章 趙鑫

DOI：10.3969/j.issn.2095-1191.2023.06.004

摘要：【目的】分析明日葉不同組織內生菌的群落結構和多樣性，為探究明日葉和內生菌互作機制及功能菌株篩選提供參考?！痉椒ā恳运拇ㄒ速e栽培的藥食兼用型明日葉為試材，采用Illumina MiSeq高通量測序技術確定根、莖、葉和果實組織內生真菌和內生細菌群落多樣性?！窘Y果】根據97%的序列相似性水平，將內生真菌和細菌的reads分別歸類為1023和1871個操作分類單元（OTU）。韋恩圖和熱圖顯示明日葉各組織內生真菌和內生細菌群落結構差異性較高，種群豐度存在一定的差異。α多樣性分析發現明日葉的葉內生真菌種類數最多，根內生真菌群落多樣性最低，果實內生真菌群落豐富度最低；而根含有內生細菌種類數最多，莖內生細菌群落多樣性最低，果實內生細菌群落豐富度最低。β多樣性分析表明，組織特征對明日葉內生真菌或內生細菌群落結構有顯著影響。明日葉4個不同組織中的優勢真菌門和細菌門分別為子囊菌門（Ascomycota）和變形菌門（Proteobacteria）。根、莖、葉和果實中內生真菌優勢屬分別為Serendipita、Paramycosphaerella、多臂菌屬（Trichomerium）和Apiotrichum，內生細菌優勢屬分別為羅爾斯通菌屬（Ralstonia）、羅爾斯通菌屬、甲基桿菌屬（Methylobacterium）和弧菌屬（Vibrio）。線性判別分析（LEfSe）表明，除根外，明日葉的莖、葉和果實中內生真菌重要差異指示種分別是Paramycosphaerella、蒼白尾孢屬（Pallidocercospora）和橫斷孢屬（Strelitziana）；莖、葉和果實中內生細菌重要差異指示種分別是羅爾斯通菌屬、甲基桿菌屬和亮桿菌屬（Leucobacter）。經FUNGuild和COG功能預測發現，不同組織內生菌群功能豐富，除具有固氮、促生和抑菌等功能的菌群外，還存在較大比例未知功能菌群?！窘Y論】明日葉中蘊含豐富多樣的內生菌群，在不同組織中的群落結構、多樣性、優勢菌屬及差異指示種存在保守性與差異性，組織特征差異是影響內生菌群的重要因素；不同組織內生菌群生態功能亦差異較大，且大量為未鑒定出種屬和未定義的功能菌群。

關鍵詞：明日葉；內生真菌；內生細菌；多樣性；功能預測

中圖分類號：S567.239? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼：A 文章編號：2095-1191（2023）06-1622-11

Community structure analysis of the endophyte in different

tissues of Angelica keiskei （Miq.） Koidz. based on

high-throughput sequencing

LIU Wen-wen1，2， ZHANG Xu3， HUANG Qi2， HU Lian-qing2， CHEN Lu2，

ZHOU Wan-hai1，2*， WEI Qin1， FENG Rui-zhang1*， ZHAO Xin1

（1Sichuan Cinnamomum longepaniculatum Engineering Technology Research Center， Yibin University，Yibin，

Sichuan? 644007， China； 2Faculty of Agriculture，Forestry and Food Engineering，Yibin University，Yibin，

Sichuan? 644007，China； 3School of Life Science， Hainan University，Haikou， Hainan? 570228，China）

Abstract：【Objective】The community structure and diversity of endophyte in different tissues of Angelica keiskei （Miq.）Koidz. was analyzed， to provide a theoretical basis to explore the interaction mechanism and functional strain screening of A. keiskei and endophyte. 【Method】The medicinal and edible plant A. keiskei， which was cultivated in Yibin， Sichuan， was taken as the object. The diversity of endophytic fungi and bacteria in the root， stem， leave and fruit tissues was examined by high-throughput sequencing using Illumina MiSeq. 【Result】According to the 97% sequence similarity， endophytic fungal and endophytic bacterial reads could be indentified into 1023 and 1871 operational taxonomic units（OTU）， respectively. A Venn diagram and a heatmap showed that there were fairly high community structure difference between endophytic fungi or endophytic bacteria in the four different parts of tissues of A. keiskei， and the abundances of populations differed. According to α diversity analysis， the variety of endophytic fungi in the leaves of A. keiskei was the most， the diversity of endophytic fungal community in the roots was the lowest， and the abundance of endophytic fungal community in the fruits was the lowest. The variety of endophytic bacteria in the roots of A. keiskei was the most， the diversity of endophytic bacterial community in the stems was the lowest， and the abundance of endophytic bacterial community in the fruits was the lowest. β diversity analysis showed that the characteristics of tissues had a significant effect on the community structure of the endophytic fungi or endophytic bacteria in A. keiskei. Ascomycota and Proteobacteria were the dominant fungal phylum and bacterial phylum in the four different parts of tissues of A. keiskei respectively. The dominant genera of endophytic fungi in the roots， stems， leaves and fruits were Serendipita， Paramycosphaerella， Trichomerium and Apiotrichum respectively， and the dominant genera of endophytic bacteria were Ralstonia， Methylobacterium and Vibrio respectively. Linear discriminant analysis showed that， the most important biomarkers of the endophytic fungi in the stems， leaves and fruits were Paramycosphaerella， Pallidocercospora and Strelitziana respectively. The most important biomarkers of endophytic bacteria in stems， leaves and fruits were Ralstonia， Methylobacterium and Leucobacter respectively. FUNGuild and COG functional predictions showed that the function of endophyte in different tissues was abundant， and there was a large proportion of unknown functional endophyte in addition to those that could fix nitrogen， promote growth and inhibit bacteria. 【Conclusion】There are abundant and diverse endophytes in A. keiskei. The community structure， diversity， dominant genera and biomarkers in different tissues are conservative and different， and the difference of tissue characteristics is an important factor affecting the endophyte. The ecological functions of endophyte in different tissues are also quite different， and a large number of species and functional endophyte are not identified.

Key words： Angelica keiskei（Miq.） Koidz.； endophytic fungi； endophytic bacteria； diversity； function prediction

Foundation items：Sichuan National Natural Science Foundation （2022NSFSC0176）；Application Project of Sichuan Science and Technology Department（2018JY0495）；High-level Innovation and Entrepreneurship Team Project of Yibin Science and Technology Bureau（2021YGC03）

0 引言

【研究意義】明日葉［Angelica keiskei （Miq.） Koidz.］屬傘形科當歸屬草本植物，是一種經濟價值極高的藥食兩用植物（Gong et al.，2020）。藥用植物的次生產物積累、藥用品質和抗病等與組織內微生物有復雜的作用關系，內生菌能對宿主植物物質循環和能量轉換過程中的信號識別、信號轉導和基因表達等產生顯著影響，從而促進植物對營養成分的吸收和代謝（蔡媛等，2021），部分內生菌還可代謝產生與宿主相同或相似作用的天然活性成分，此特征已成為挖掘新型藥物的重要來源（郭文秀等，2022）。因此，開展特色藥食兩用植物明日葉不同組織的內生菌群落結構及多樣性研究，有助于揭示明日葉不同組織內生菌群落結構特征，且對挖掘可提高其有效成分含量的內生菌資源及開發促進明日葉生長、生物轉化和品質提升的方法具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】目前已對蛇足石衫、黃精和白蘞等多種藥用植物內生菌群落結構、多樣性和組織分布特征等開展了相關研究（Fan et al.，2020；李鑒濱等，2022），亦對內生菌響應宿主植物內環境因子及調節宿主植物生長、活性次生代謝物積累和分布進行了分析（黃雪珍和趙龍飛，2023），發現內生菌分布于植物器官或組織中，每個植物器官均代表內生細菌群落特有的生態位。Dong等（2018）對中草藥三七不同部位的內生細菌進行多樣性分析，得出根部的慢生型大豆根瘤菌、鞘氨醇單胞菌和苯基桿菌等內生細菌數量均高于莖部和葉部。許國琪等（2021）發現青藏高原冰川棘豆不同組織間形成了保守性內生細菌和特異性內生真菌共存的群落結構，為其不同組織適應極端環境提供幫助。陳美琪等（2023）發現對虎耳草不同組織內生真菌的多樣性指數均高于多數已報道的其他藥用植物，且根部內生真菌的多樣性明顯高于莖部和葉部。張麗芳等（2023）發現火棘根中內生細菌物種最豐富，參與各種代謝調控的細菌豐度最高。關于明日葉的研究主要集中在栽培技術、活性物質提取與鑒定及中藥藥性探析等方面。關于內生菌，本課題組前期采用純培養法篩選明日葉不同器官可培養的內生真菌和產黃酮菌株，淺析了明日葉不同組織內生真菌群落結構和多樣性，但分離的菌株數量和類型較少，多樣性較低（劉雯雯等，2022）。大量研究表明傳統的平板分離法并不能真正反映內生菌群落特征，高通量測序技術能提供更加可靠和深入的分析（陳美琪等，2023）?！颈狙芯壳腥朦c】有關明日葉內生細菌的群落結構及組織差異尚缺乏系統的認識?！緮M解決的關鍵問題】收集四川宜賓栽培的藥食兼用型明日葉的根、莖、葉和果實組織，基于高通量測序技術分析明日葉不同組織中內生真菌和內生細菌群落組成和多樣性，并比較內生真菌和內生細菌群落結構差異，探究明日葉中特有的微生物資源及其功能，為探尋功能微生物資源和明日葉的功能開發應用，挖掘能合成或促進植物活性產物的菌株資源提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1. 1 試驗區概況

明日葉采樣點位于四川省宜賓市宜賓學院試驗農場（東經104°59′76″，北緯28°47′77″）。屬中亞熱帶季風濕潤氣候，氣候溫和，熱量豐足，雨量充沛，光照適宜，冬暖春早，無霜期為347 d，年平均溫度17.5 ℃，年均降水量1070.4 mm。

1. 2 樣品采集和處理

在采集地選擇不同位點的5株3年生且長勢良好的明日葉植株，將整棵植株挖出，盡量保持根系完整，立即放入內置冰袋的冰盒內運送至實驗室，用大量無菌水對明日葉植株表面和根系附著泥土進行沖洗后，用無菌剪刀將不同位品按根、莖、葉和果實組織分開。將不同位點每株明日葉不同組織的混合樣品作為一個生物學重復，共設3個重復。稱取50 g的各組織樣品于超凈工作臺中無菌水沖洗多次，再依次用75%乙醇（40 s）、3% NaClO（3 min）、75%乙醇（40 s）無菌化處理，最后無菌水洗滌3次，無菌濾紙吸干表面水分，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于明日葉內生菌群落結構分析。

1. 3 明日葉微生物DNA提取與測序

明日葉不同組織樣本的總基因組DNA使用FastDNA?SPIN Kit for Soil試劑盒進行提取，借助1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000超微量分光光度計分別測定DNA提取質量和DNA濃度、純度。PCR使用引物ITS1F（5'-CTTGGTCATTTAGAGGA AGTAA-3'）和ITS2R（5'-GCTGCGTTCTTCATCGAT GC-3'）對內生真菌ITS1區進行擴增；使用引物799F（5'-AACMGGATTAGATACCCKG-3'）和1193R（5'-AC GTCATCCCCACCTTCC-3'）對內生細菌16S rDNA的V5～V7區進行擴增。利用凝膠回收試劑盒（Gel Extraction Kit）對擴增目標片段切膠回收，2%瓊脂糖凝膠電泳和Quantus?熒光儀對產物檢測并定量，使用NEXTflexTM DNA-Seq Kit建庫。最后利用Illumina公司Miseq PE300平臺進行測序。上述工作均委托上海美吉生物醫藥科技有限公司完成。

1. 4 測序數據處理

將測序獲得的數據過濾去除引物和接頭序列、非特異性擴增序列和嵌合體，得到有效序列用于進一步分析。按照97%相似水平進行操作分類單元（Operation taxonomic unit，OTU）聚類，利用R軟件繪制韋恩圖后展開OTU聚類分析。α多樣性指數包括Shannon指數（反映內生菌群落多樣性）和Chao1指數（反映內生菌群落豐富度）。通過對OTU數據分析，利用柱狀圖統計樣本中內生真菌和內生細菌在門和屬水平上群落結構的分類學組成，確定優勢菌門和優勢菌屬?；谥饕狾TU豐度信息繪制熱圖，反映不同樣本間物種分布的相似性和差異性。在ANOSIM組間差異檢驗下進行NMDS分析，用于判斷分組是否有意義。根據分類學組成對樣本進行線性判別分析（LEfSe），找出對樣本劃分產生顯著性差異影響的群落或物種。使用FUNGuild和EggNOG數據庫分別預測內生真菌和內生細菌的功能，統計內生真菌Trophic Mode（營養方式）和Guild（功能分組）豐度結果，比對內生細菌OTU的COG家族信息。

1. 5 統計分析

試驗數據采用SPSS 22.0和Excel 2007進行統計分析。利用上海美吉生物醫藥科技有限公司的I-sanger云數據分析平臺進行在線數據分析。

2 結果與分析

2. 1 明日葉植物內生菌OTU數量

明日葉內生真菌OTUs總數為1023個，其中根、莖、葉和果實分別含有210、210、426和177個，4個組織共有內生真菌OTUs 29個；葉部特有OTUs數量最多，為249個，莖部次之，果實特有OTUs數量最少，僅54個（圖1-A）。明日葉各組織內生細菌共獲得1871個OTUs，其中根、莖、葉和果實分別含有1114、243、298和216個，4個組織共有內生細菌OTUs 55個；根特有OTUs數量最多，為884個，其次是葉116個，莖最少，僅41個（圖1-B）。

2. 2 明日葉植物內生菌α和β多樣性

2. 2. 1 內生真菌α多樣性 測序共獲得247037條內生真菌有效序列，平均測序覆蓋率達99.962%。由Shannon指數箱式圖（圖2-A）可知，明日葉的根與莖、根與葉差異極顯著（P<0.01，下同），其他組織間無顯著差異（P>0.05，下同），Shannon指數大小依次是葉>莖>果實>根；Chao1指數箱式圖（圖2-B）顯示葉與其他3個組織間均差異極顯著，Chao1指數大小依次為葉>莖>根>果實。說明葉部內生真菌群落多樣性和豐富度均最好。

2. 2. 2 內生細菌α多樣性 測序共獲得87178條內生細菌有效序列，平均測序覆蓋率為99.808%。結合Shannon指數和Chao1指數箱式圖（圖3）可知，明日葉根的Shannon指數與其他組織間均差異極顯著，而其他組織間無顯著性差異；果實的Chaol指數與根和葉間差異顯著（P<0.05，下同）。因此，在Shannon指數上各組織排序依次是根>葉>果實>莖，Chao1指數大小依次為根>葉>莖>果實。說明根部內生細菌的群落多樣性和豐富度均最好，葉部其次。

2. 2. 3 內生菌β多樣性 基于ANOSIM組間差異檢驗的NMDS分析表明，組織間內生真菌OTU（R=0.4815，P=0.007）和內生細菌OTU（R=0.7407，P=0.002）均存在極顯著差異（圖4）。Stress主要用于檢驗NMDS分析結果的優劣，通常認為Stress<0.1時，不同樣本具有一個好的排序，內生真菌NMDS分析Stress=0.090，內生細菌Stress=0.073，因此在內生真菌和內生細菌菌群結構的差異分析中，分組是一個好的排序。

2. 3 明日葉植物內生菌組成分析

在門、屬分類水平上對明日葉不同組織內生菌進行群落組成和相對豐度分析，由于許多物種占比小，未有代表意義，因此將相對豐度<1%的物種歸于其他類（others）。

2. 3. 1 內生真菌組成 700個內生真菌OTUs比對到7個門和228個屬。在門水平上，根部菌門數最多，為6個（表1）。由圖5可知，子囊菌門（Ascomycota）在根、莖、葉和果實組織中均占主要優勢，其中在葉部占比最高；而其他類門（p_others）和擔子菌門（Basidiomycota）在果實占比均高于根、莖和葉，未知真菌門（p_unclassified Fungi）在莖中相對占比最多。在屬分類水平上，根有81個菌屬，未知真菌屬（g_unclassified Fungi）、g_unclassified Dictyosporiaceae、Serendipita、Campylospora、Codinaea、子囊菌門未分類菌屬（g_unclassified Ascomycota）和g_unclassified Tremellodendropsidales 等7個菌屬的相對豐度占比大于3.00%，其他類屬（g_others）占比5.51%；莖有93個菌屬，未知真菌屬、Paramycosphaerella、g_unclassified Trichomeriaceae、多臂菌屬（Trichomerium）、子囊菌門未分類菌屬、橫斷孢屬（Strelitziana）和枝孢屬（Cladosporium）等7個菌屬的相對豐度占比大于3.00%，其他類屬占比11.79%；葉有156個菌屬，g_unclassified Trichomeriaceae、多臂菌屬、橫斷孢屬、枝孢屬和未知真菌屬等5個菌屬的相對豐度占比大于3.00%，其他類屬占比11.99%；果實有81個菌屬，Apiotrichum、g_unclassified Trichomeriaceae、橫斷孢屬、多臂菌屬、鏈格孢屬（Alternaria）、枝孢屬和未知真菌屬等7個菌屬的相對豐度占比大于3.00%，其他類屬占比9.78%。4個組織共有內生真菌屬32個，占總屬類的14.03%（圖6）。

2. 3. 2 內生細菌組成 1393個內生細菌OTUs比對到30個門和550個屬（表2）。由圖7可知，在門分類水平上，變形菌門（Proteobacteria）在根、莖、葉和果實中占主要優勢。擬桿菌門（Bacteroidetes）、衣原體門（Chlamydiae）、綠彎菌門（Chloroflexi）、Dependentiae及其他類菌門在根中相對占比均最高；放線菌門（Actinobacteria）、異常球菌—棲熱菌門（Deinococcus-Thermus）在葉中相對占比最多；厚壁菌門（Firmicutes）在果實的相對占比均高于其他組織；而酸桿菌門（Acidobacteria）在莖中相對占比最高。在屬分類水平上，根有454個菌屬，僅羅爾斯通菌屬（Ralstonia）和短根瘤菌屬（Bradyrhizobium）2個菌屬相對豐度占比大于3.00%，其他類屬占比52.66%；莖有172個菌屬，羅爾斯通菌屬、弧菌屬（Vibrio）、紅球菌屬（Rhodococcus）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、伯克氏科未分類菌屬（g_unclassified Burkholderiaceae）、Aureimonas和鞘脂單胞菌屬（Sphingomonas）等8個菌屬的相對豐度占比大于3.00%，其他類屬占比18.54%；葉有169個菌屬，甲基桿菌屬、鞘脂單胞菌屬、異常球菌屬（Deinococcus）、胺桿菌屬（Amnibacterium）、紅球菌屬和馬賽菌屬（Massilia）6個菌屬相對豐度占比大于3.00%，其他類屬占比10.50%；果實有147個菌屬，弧菌屬、Ruegeria、甲基桿菌屬、羅爾斯通菌屬、亮桿菌屬（Leucobacter）和紅球菌屬等6個菌屬相對豐度占比大于3.00%，其他類屬占比11.81%。4個組織共有內生細菌屬58個，占總屬類的10.55%（圖8）。

2. 3. 3 內生菌群落結構熱圖分析 對明日葉不同組織內生真菌和內生細菌測序所得的OTU結果在屬水平上進行分類，并利用相對豐度信息繪制熱圖，選取在屬水平上前30的物種進行聚類分析（圖9），在內生真菌方面，葉和果實聚為一類，而對于內生細菌，莖和果實聚為一類。根與其他3個組織的菌群物種組成和物種豐度差距均最大。

2. 4 明日葉不同組織內生菌群落差異性

采用LEfSe分析方法進行明日葉不同組織內生菌差異顯著分析，尋找具有差異的生物標識（Biomarker）。設置LDA閾值為4，從圖10-A可看出，除根外，Paramycosphaerella是莖中起重要作用的內生真菌類群；散囊菌綱（Eurotiomycetes）、刺盾炱目（Chaetothyriales）、Trichomeriaceae、蒼白尾孢屬（Pallidocercospora）、多臂菌屬、擲孢酵母屬、莖點霉屬、亞隔孢殼科未分類菌屬（g_unclassified Didymellaceae）、煤炱目未分類菌科（f_unclassified Capnodiales）和煤炱目未分類菌屬（g_unclassified Capnodiales）是葉中起重要作用的內生真菌類群；橫斷孢屬和刺盾炱目的fam_Incertae_sedis科是果中起重要作用的內生真菌類群。從圖10-B可知，根中起重要作用的內生細菌類群是擬桿菌綱（Bacteroidia）、擬桿菌門、黃單胞菌目（Xanthomonadales）、黃單胞菌科（Xanthomonadaceae）、生絲微菌科（Hyphomicrobiaceae）和Gaiellaceae；莖中起重要作用的內生真菌類群是γ-變形菌綱（Gammaproteobacteria）、羅爾斯通菌屬、假單胞菌目（Pseudomonadales）、假單胞菌科（Pseudomonadaceae）、假單胞菌屬和黃桿菌目（Flavobacteriales）；葉中起重要作用的內生細菌類群是甲基桿菌屬、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales）、鞘脂單胞菌科（Sphingomonadaceae）和鞘脂單胞菌屬；果實中起重要作用的內生細菌類群是微球菌目（Micrococcales）和亮桿菌屬。

2. 5 明日葉內生菌菌群功能組成

2. 5. 1 內生真菌 通過FUNGuild數據庫內生真菌群落功能預測（圖11）可知，從營養類型看，腐生型（57.67%）、未知（29.79%）和共生型（10.42%）在根組織中占比較大；莖中未知型（35.36%）、腐生—病理寄生型（30.89%）和共生型（13.01%）占優勢；葉中共生型（52.33%）、病理寄生型（14.49%）和腐生—共生—病理寄生型（9.17%）占比較高；果實中共生型（28.04%）、腐生型（26.19%）、病理寄生型（16.96%）和腐生—共生—病理寄生型（12.21%）具有優勢。根據Guild分類，又分為植物病原菌、附生真菌、植物內生菌、土壤腐生菌、蘭花類菌根真菌、植物腐生菌—木腐菌等17種。除未知腐生菌和未定義功能外，根中菌根真菌（15.05%），莖中植物病原菌—未定義腐生菌（24.14%）和附生真菌（12.55%），葉中植物病原菌（14.48）、附生真菌（32.99%）和內生菌（19.27%），以及果實中植物病原菌（16.36%）、附生真菌（16.78%）和土壤腐生菌（21.55%）功能菌群在各組織Guild分類中的占比均超過10.00%。

2. 5. 2 內生細菌 通過比對EggNOG數據庫得到24種COG功能，包括RNA加工和修飾（A），染色質結構和動態變化（B），能量產生與轉換（C），細胞循環調控、細胞分裂、染色體分裂（D），氨基酸轉運和代謝（E），核苷酸轉運與代謝（F），碳水化合物的運輸和代謝（G），輔酶轉運與代謝（H），脂質轉運和代謝（I），翻譯、核糖體結構和生物合成（J），翻譯（K），復制、重建和修復（L），細胞壁/細胞膜/膜結構的生物合成（M），細胞活力（N），翻譯后修飾、蛋白質周轉、伴侶（O），無機離子轉運與代謝（P），次生代謝產物的合成、轉運和代謝（Q），一般功能預測（R），未知功能基因家族（S），信號轉導機制（T）、細胞內轉運、分泌和液泡運輸（U）、防御機制（V）、細胞外結構（W），以及細胞骨架（Z），其豐度隨組織的不同而異。明日葉不同組織內生細菌COG功能組成分析顯示，根中排名前10的COG功能分布是S>E>R>C>K>M>T>P>G>L，莖中S>E>R>C>K>P>T>M>G>J，葉中S>E>R>C>K>P>G>M>T>I，果實中S>E>R>K>C>G>P>M>J>T。在明日葉根（2.58%）、莖（2.59%）、葉（2.94%）、果實（2.29%）組織中Q相關基因均有表達。

3 討論

3. 1 不同組織中內生菌多樣性和豐富度的差異分析

相關研究認為，宿主植物群落多樣性受植物種類及同種植物不同組織的結構、功能和特有化學成分等因素影響（Deng et al.，2019）。通過對冰川棘豆內生菌多樣性研究可知，內生真菌和內生細菌群落結構和多樣性存在差異（許國琪等，2021）；對蛇足石杉內生真菌的研究（Fan et al.，2020）發現，其葉部具有相對莖和根組織更為豐富的內生菌群落組成。本研究中，明日葉4個不同組織均定殖豐富的內生真菌和內生細菌，但其分布存在器官組織差異性，葉中也表現出較高的內生真菌群落多樣性和豐富度，根部最低，而根中內生細菌群落多樣性和豐富度最高。究其原因，可能葉部除來源于莖部真菌外，較大的表面積利于來自空氣、水分或其他生物的真菌附著并進入植物體，植物光合作用產生的豐富營養物質也為真菌共生創造優越條件。但也有研究發現根中具有最高的內生真菌豐富度和多樣性（Wang et al.， 2022），可能與宿主種類、生長環境不同有關，還應做進一步研究。有報道得出中藥石蓮根部內生細菌的多樣性和豐富度顯著高于葉和莖（Huo et al.，2020），可能由于內生細菌常以根際土壤微生物為起點，經根部表面和內部開始定殖，隨著蒸騰作用沿著維管束向莖部和葉部遷移，且微生物對根部浸染程度強于地面部分，從而導致根部內生細菌群落多樣性高于其他組織。

3. 2 不同組織中內生菌的群落組成分析

通過聚類熱圖分析，明日葉的根、莖、葉和果實微生物菌群組成差異較大，但莖、葉和果實組織內生真菌和內生細菌群落結構相近，由于三者發育來源均屬于地面組織，可能是三者內生菌結構更為類似的原因，說明明日葉組織是影響其內生菌種群結構與多樣性變化因素之一。

白蘞、蛇足石杉等藥用植物的內生菌中子囊菌門為優勢類群（Fan et al.，2020；李鑒濱等，2022），子囊菌門是真菌中種類最多的類群，占真菌總數的40%，可能與奠基者效應及其遺傳特性有關（張淼等，2020），且在根際土壤、藏茶、葡萄表皮等中均占比較高。本研究中子囊菌門亦為不同組織內生真菌優勢菌門，該門類中大多數為腐生菌，具有較強的物質分解和合成能力，在養分循環中起著重要作用（張愛梅等， 2021），是最易與植物互惠共生的門類，因此該菌門對明日葉不同組織的養分循環和代謝具有意義。高通量測序的明日葉不同組織優勢菌屬與純培養內生真菌結果有較大差異（劉雯雯等，2022），說明傳統培養法解析植物內生真菌群落多樣性的深度與高通量技術有較大差別。此外，莖、葉和果實共有的多臂菌屬具有促進宿主植物產生藥用價值物質的作用（Nassal et al.，2018）。僅存在于根中的Serendipita能產生促進宿主互作的效應分子（Mahdi et al.，2022）。Campylospora、橫斷孢屬和Apiotrichum等菌屬可合成有用的生物活性物質或對寄主植物具有重要的生態效應。本研究中仍有一些OTU序列在不同的分類水平上未被注釋分類，表明明日葉體內還蘊含有大量未知的內生真菌，有待深入研究。

明日葉4個組織中優勢細菌門類為變形菌門。變形菌門是植物內部存在的最廣泛的細菌門類，物種和遺傳多樣性豐富，具有生物固氮、病蟲害防治和土壤修復等輔助作用，莼菜嫩芽、莖和葉（張秋玉等， 2022）及甜櫻桃（趙柏霞和閆建芳，2022）不同組織內生細菌分析均發現，優勢細菌門類為變形菌門，且變形菌門豐度越高，組織內碳氮養分及有機質含量就越多。放線菌門、厚壁菌門和擬桿菌門是促進生物進化、挖掘農用抗生素菌群的重要種質資源來源，其在明日葉中占比也較高。此外，本研究利用高通量測序結果注釋到的一些具有不同功能的優勢菌或核心種，如假單胞菌屬的某些菌株可分泌生長素和抗生素，作為生物防治菌（王紅瑩等， 2021）。羅爾斯通菌屬具有碳固定和能量利用的代謝特點。馬賽菌屬廣泛存在于水體、植物根際和葉際等環境中，具有分泌生長素和酶、增強植物抗逆性、耐受重金屬等功能（陳翔，2021）。分布于根中的短根瘤菌屬具有固氮作用；葉中甲基桿菌屬和鞘脂單胞菌屬具有促生和抑制病原體的作用，表明組織特征是影響明日葉內生菌群落結構的重要因素，明日葉不同組織內生菌的種類、豐度和功能有較大差異。同時，明日葉組織中還存在大量未被注釋的微生物類群，可為挖掘促生、抗逆及醫藥等有重要應用價值的新種提供基礎。

3. 3 不同組織內生菌功能預測分析

內生真菌與植物宿主的演化選擇過程中，為應對植物不同時期、不同組織的生理狀態，具備共生、腐生和寄生生存策略，并發揮自生重要的生態作用，而內生細菌通過與宿主植物間基因的橫向轉移，參與宿主關鍵的生命活動（孫紅敏等，2016）。本研究利用FUNGuild對內生真菌群落營養模式和功能分析發現，不同組織中未知營養型和功能型均占比較大，說明FUNGuild數據庫解析不全面，也反映出明日葉存在大量待挖掘的內生真菌資源。根中腐生型功能群較高，可能因為根接觸土壤，根際土壤中腐生真菌種類多，腐生真菌進入根中成為內生真菌的概率更高，同時腐生真菌可產生氧化酶和水解酶，利于碳水化合物的分級，與養分循環密切相關（寧琪等，2022）。莖中病理腐生型功能群較多，葉和果實中共生型功能群占比較高，可能由于植物內生真菌在不同組織中發揮不同功能，導致不同組織優勢功能類群分布不同。針對內生細菌功能，氨基酸運輸與代謝和能量產生與轉換的相關基因在各組織中均占比較高，為各組織提供基礎保障；葉組織無機離子運輸與代謝相關基因比其他組織高，可能與葉活動功能代謝快有關。次生代謝產物是內生菌發揮功能作用的物質基礎（李盼盼等，2018），明日葉不同組織中均存在一定比例的次生代謝產物生物合成、分解代謝相關基因，為微生物參與宿主植物代謝提供可能。

4 結論

明日葉中蘊含豐富多樣的內生菌群，在不同組織中的群落結構、多樣性、優勢菌屬及差異指示種存在保守性與差異性，組織特征差異是影響內生菌群的重要因素；不同組織內生菌群生態功能亦差異較大，且大量為未鑒定出種屬和未定義的功能菌群。

參考文獻：

蔡媛，劉浩，孔文平，鐘燦，謝景，王勇慶，黃建華，張水寒. 2021. 多花黃精內生菌群落結構多樣性及其與有效成分含量相關性研究［J］. 中草藥，52（13）：4023-4030. ［Cai Y，Liu H，Kong W P，Zhong C，Xie J，Wang Y Q，Huang J H，Zhang S H. 2021. Study on community and diversity of endophyte and its correlation with active ingredient content in Polygonatum cyrtonema［J］. Chinese Traditional and Herbal Drugs，52（13）：4023-4030.］ doi：10.7501/j.issn.0253-2670.2021.13.025.

陳美琪，王興，黎俊彥，譚綺雯，李鑒濱，姚華雄，張玉鑫，謝思韻，鄧祖軍. 2023. 基于高通量測序和組織分離法的虎耳草內生真菌多樣性分析及其抗氧化活性研究［J］. 中草藥，54（6）：1924-1934. ［Chen M Q，Wang X，Li J Y，Tan Q W，Li J B，Yao H X，Zhang Y X，Xie S Y，Deng Z J. 2023. Study of endophytic fungi diversity of Saxifraga stolonifera based on high-throughput sequencing method and tissue isolation method and their antioxidant activities［J］. Chinese Traditional and Herbal Drugs，54（6）：1924-1934.］ doi：10.7501/j.issn.0253-2670.2023.06.025.

陳翔. 2021. 人工濕地污水處理系統馬賽菌（Massilia）組成、分布特征及影響因素研究［D］. 青島：青島理工大學. ［Chen X. 2021. Study on the composition distribution characteristics and influencing factors of Massilia in constructed wetland wastewater treatment system［D］. Qingdao：Qingdao Technological University.］

郭文秀，巨鳳，沈芋蓉，譚璐，李新愛，郭大樂，鄧赟. 2022. 川芎內生菌Pseudeurotium ovale代謝產物研究［J］. 天然產物研究與開發，34（2）：239-244. ［Guo W X，Ju F，Shen Y R，Tan L，Li X A，Guo D L，Deng Y. 2022. Study on metabolites of Pseudeurotium ovale isolated from Ligusticum chuanxiong［J］. Natural Product Research and Deve lopment，34（2）：239-244.］ doi：10.16333/j.1001-6880. 2022.2.009.

黃雪珍，趙龍飛. 2023. 藥用植物內生菌對宿主植物促生作用機制研究進展［J］. 微生物學通報，50（4）：1653-1665. ［Huang X Z，Zhao L F. 2023. Mechanism of endophytes of medicinal plants in promoting the growth of host plants［J］. Microbiology China，50（4）：1653-1665.］ doi：10.13344/j.microbiol.china.221120.

李鑒濱，張增峰，譚綺雯，陳美琪，姚華雄，鄧祖軍. 2022. 基于高通量解析和可培養技術的白蘞內生真菌類群分析及分離菌株的抗痤瘡致病菌活性［J/OL］. 微生物學通報. 2022-11-24. https：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.1996.q.20221122.1551.003.html. ［Li J B，Zhang Z F，Tan Q W，Chen M Q，Yao H X，Deng Z J. 2022. Taxonomic analysis of fungal endophytes from Ampelopsis japonica （Thunb.） Makino by high-throughput sequencing and culture-dependent methods and the activity of the isolated strains against acne-associated pathogens［J/OL］. Microbiology China. 2022-11-24. https：//kns.cnki.net/kcms/detail/11.1996.q.20221122.1551.003.html.］

李盼盼，袁曉龍，李金海，申國明，高林，李青誠，高加明，張鵬. 2018. 湖北煙草內生真菌生物多樣性和種群結構分析［J］. 微生物學報，58（10）：1853-1863. ［Li P P，Yuan X L，Li J H，Shen G M，Gao L，Li Q C，Gao J M，Zhang P. 2018.? Biodiversity and community structure of endophy tic fungi isolated from Nicotiana tabacum L.［J］. Acta Microbiologica Sinica，58（10）：1853-1863.］ doi：10.13343/j.cnki.wsxb.20180125.

劉雯雯，馮瑞章，魏琴，周萬海，王虹，杜永華. 2022. 明日葉可培養內生真菌分離鑒定及功能性篩選［J］. 食品與發酵工業，48（15）：137-144. ［Liu W W，Feng R Z，Wei Q，Zhou W H，Wang H，Du Y H. 2022. Isolation，identification and functional screening of culturable endophytic fungi from Angelica keiskei［J］. Food and Fermentation Industries，48（15）：137-144.］ doi：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.029994.

寧琪，陳林，李芳，張叢志，馬東豪，蔡澤江，張佳寶. 2022. 被孢霉對土壤養分有效性和秸稈降解的影響［J］. 土壤學報，59（1）：206-217. ［Ning Q，Chen L，Li F，Zhang C Z，Ma D H，Cai Z J，Zhang J B. 2022. Effects of Mortierella on nutrient availability and straw decomposition in soil［J］. Acta Pedologica Sinica，59（1）：206-217.］ doi：10. 11766/trxb202006020213.

孫紅敏，魏玉珍，方曉梅，余利巖，張玉琴. 2016. 蛇足石杉內生細菌多樣性［J］. 微生物學報，56（4）：614-628. ［Sun H M，Wei Y Z，Fang X M，Yu L Y，Zhang Y Q. 2016. Diversity of endophytic bacteria isolated from Huperzia serrata［J］. Acta Microbiologica Sinica，56（4）：614-628.］ doi：10.13343/j.cnki.wsxb.20150275.

王紅瑩，李春燕，宋發軍，林愛華，孟艷艷. 2021. 一株白及內生細菌的分離鑒定及抑菌機理初步研究［J］. 中南民族大學學報（自然科學版），40（2）：246-251. ［Wang H Y，Li C Y，Song F J，Lin A H，Meng Y Y. 2021. Isolation and identification of an endophytic bacterium from Bletilla striata and preliminary study of antibacterial mechanism［J］. Journal of South-central Minzu University（Na tural Science Edition），40（2）：246-251.］ doi：10.12130/znmdzk.20210305.

許國琪，劉怡萱，曹鵬熙，姬亞麗，李敬科，李小燕，劉星. 2021. 基于Illumina MiSeq測序技術對冰川棘豆（Oxytropis glacialis）不同組織內生菌多樣性的研究［J］. 生態學報，41（12）：4993-5003. ［Xu G Q，Liu Y X，Cao P X，Ji Y L，Li J K，Li X Y，Liu X. 2021. Endophytes diversity of Oxytropis glacialis at different tissues based on Illumina MiSeq sequencing［J］. Acta Ecologica Sinica，41（12）：4993-5003.］ doi：10.5846/stxb202005081148.

張愛梅，殷一然，孔維寶，朱學泰，楊穎麗. 2021. 西藏沙棘5種不同組織內生細菌多樣性［J］. 生物多樣性，29（9）：1236-1244. ［Zhang A M，Yin Y R，Kong W B，Zhu X T，Yang Y L. 2021. Diversity of endophytic bacteria in five types of tissues of Hippophae tibetana［J］. Biodiversity Science，29（9）：1236-1244.］ doi：10.17520/biods.2021034.

張麗芳，胡海林，桂騰茸，高秀，徐晴芳，朱鈴，徐啟賀，蔡建. 2023. 火棘不同組織內生細菌群落多樣性［J/OL］. 廣西植物. 2023-04-13. https：//kns.cnki.net/kcms/detail/45.1134. q.20230411.1651.014.html. ［Zhang L F，Hu H L，Gui T R，Gao X，Xu Q F，Zhu L，Xu Q H，Cai J. 2023. Diversity of endophytic bacterial community in different Pyracantha fortuneana tissues［J/OL］. Guihaia. 2023-04-13. https：//kns.cnki.net/kcms/detail/45.1134.q.20230411. 1651.014.html.］

張淼，陳裕鳳，陳龍，黃飄玲，韋露玲. 2020. 不同地區藥用植物兩面針根際土壤真菌種群多樣性差異分析［J］. 生物技術通報，36（9）：167-179. ［Zhang M，Chen Y F，Chen L，Huang P L，Wei L L. 2020. Difference analysis of the community diversity of fungi in the rhizosphere soil of Zanthoxylum nitidum（Roxb.）DC in different regions［J］. Biotechnology Bulletin，36（9）：167-179.］ doi：10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2020-0667.

張秋玉，陳晶，周雪妹，龔漢雨，余光輝. 2022. 莼菜不同組織內生細菌多樣性的比較分析［J］. 中南民族大學學報（自然科學版），41（3）：285-291. ［Zhang Q Y，Chen J，Zhou X M，Gong H Y，Yu G H. 2022. Diversity of entophytic bacteria in different tissues of Brasenia schreberi［J］. Journal of South-central Minzu University（Natural Scien ce Edition），41（3）：285-291.］ doi：10.12130/znmdzk. 20220305.

趙柏霞，閆建芳. 2022. 高通量技術分析‘砂蜜豆’甜櫻桃不同組織內生細菌多樣性［J］. 中國農業科技導報，25（3）：66-77. ［Zhao B X，Yan J F. 2022. Diversity analysis of endophytic bacterial community in different tissues of ‘Summit’ sweet cherry using high-throughput sequencing［J］. Journal of Agricultural Science and Technology，25（3）：66-77.］ doi：10.13304/j.nykjdb.2021.0647.

Deng Z S，Liu X D，Zhang B C，Jiao S，Qi X Y，Sun Z H，He X L，Liu Y Z，Li J，Chen K K，Lin Z X，Jiang Y Y. 2019. The root endophytic fungi community structure of Pennisetum sinese from four representative provinces in China［J］. Microorganisms，7（9）：332. doi：10.3390/microorganisms7090332.

Dong L L，Cheng R Y，Xiao L N，Wei F G，Wei G F，Xu J，Wang Y，Guo X T，Chen Z J，Chen S L. 2018. Diversity and composition of bacterial endophytes among plant parts of Panax notoginseng［J］. Chinese Medicine，13（1）：41. doi：10.1186/s13020-018-0198-5.

Fan S P，Miao L Y，Li H D，Lin A H，Song F J，Zhang P. 2020. Illumina-based analysis yields new insights into the diversity and composition of endophytic fungi in cultivated Huperzia serrata［J］. PLoS One，15（11）：e0242258. doi：10.1371/journal.pone.0242258.

Gong S X，Xu B，Gu X Z，Li W H，Yu Y，Zhang Wei，Wang Z W. 2020. Study on the effects of sugar alcohols and Angelica keiskei flour on cookie quality，antioxidant，and nutrition［J］. Cereal Chemistry，97（3）：714-722. doi：10. 1002/cche.10287.

Huo X W，Wang Y，Zhang D W，Gao T，Liu M M. 2020. Characteristics and diversity of endophytic bacteria in endangered Chinese herb Glehnia littoralis based on illumina sequencing［J］. Polish Journal of Microbiology，69（3）：283-291. doi：10.33073/pjm-2020-031.

Mahdi L K，Miyauchi S，Uhlmann C，Garrido-Oter R，Langen G，Wawra S，Niu Y L，Guan R，Robertson-Albertyn S，Bulgarelli D，Parker J E，Zuccaro A. 2022. The fungal root endophyte Serendipita vermifera displays inter-kingdom synergistic beneficial effects with the microbiota in Arabidopsis thaliana and barley［J］. ISME Journal，16（3）：876-889. doi：10.1038/s41396-021-01138-y.

Nassal D，Spohn M，Eltlbany N，Jacquiod S，Smalla K，Marhan S，Kandeler E. 2018. Effects of phosphorus-mobilizing bacteria on tomato growth and soil microbial activity［J］. Plant and Soil，427（1-2）：17-37. doi：10.1007/s11104-017-3528-y.

Wang R，Zhang Q，Ju M，Yan S，Zhang Q，Gu P. 2022. The endophytic fungi diversity，community structure，and ecological function prediction of Sophora alopecuroides in Ningxia，China［J］. Microorganisms，10（11）：2099. doi：10.3390/microorganisms10112099.

（責任編輯 鄧慧靈）

收稿日期：2023-04-15

基金項目：四川省自然科學基金項目（2022NSFSC0176）；四川省科學技術廳應用基礎項目（2018JY0495）；宜賓市科技局高端創新創業團隊項目（2021YGC03）

通訊作者：周萬海（1979-），https：//orcid.org/0000-0002-8013-0029，博士，副教授，主要從事農業資源開發利用研究工作，E-mail：wanhaizhou@126.com；馮瑞章（1978-），https：//orcid.org/0000-0002-1601-5843，博士，教授，主要從事微生物資源開發利用研究工作，E-mail：ruizhangfeng@126.com

第一作者：劉雯雯（1991-），https：//orcid.org/0000-0002-8659-430X，主要從事微生物學研究工作，E-mail：965501606@qq.com