基于TLR4/MyD88信號通路探究miR-326對抑郁模型腦組織的保護作用

劉 威

(河北省衡水市人民醫院精神心理科,河北 衡水 053000)

抑郁癥是最常見的精神疾病之一,癥狀包括情緒低落、興趣下降,嚴重者有自殺傾向[1]。抑郁癥的發病率逐年上升。然而,目前的傳統抗抑郁藥物可能需要數周至數月才能產生有效的反應,約三分之一患者對現有的治療策略沒有反應[2]。抑郁癥最有可能是由遺傳傾向和環境因素(如早期生活經歷、生活事件和慢性壓力)之間的復雜相互作用引起的[3]。在抑郁個體的大腦和抑郁的動物模型中已經一致地描述了神經可塑性變化[4-5]。表觀遺傳機制可能提供了環境壓力因素和基因表達之間的聯系[6],微小RNA(miRNAs)是由22～25個核苷酸序列組成的非編碼RNA,已被確定為生物過程的調節物。miRNAs可以特異性地與其靶mRNA的3'非翻譯區(untranslated regions,UTR)結合,以促進mRNA的降解或抑制其翻譯[7]。MiRNAs在腦組織中大量存在,并在調節腦功能中發揮許多關鍵作用,特別是在神經再生、神經可塑性和神經元功能方面[8]。TLR4信號通路參與先天免疫反應和適應性免疫反應的調節,并與抑郁癥的免疫炎癥過程密切相關[9],是慢性不可預測輕度應激抑郁小鼠海馬炎癥的主要參與者[10]。TLR4通過胞內白細胞介素 1β(interlenkin 1β,1L-1β)同源結構域激活,利用下游信號分子MyD88,介導效應分子核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)的活化,NF-κB轉位入核磷酸化,調節免疫炎癥因子的表達[11]。本研究旨在探究抑郁模型中參與腦組織保護的相關機制,建立CUMS大鼠模型,基于下游TLR4/MyD88篩選出上游靶向miR-326,通過干預miR-326來探究miR-326/TLR4/MyD88是否參與了抑郁模型腦組織的保護作用。

1 材料與方法

1.1實驗動物 雄性Sprague-Dawley大鼠(200～220 g,8周)由湖北貝恩特生物科技有限公司提供,許可證號SYXK(鄂)2021-0119。實驗動物被飼養在干凈的動物房中,并給予免費的食物和水,12 h的晝夜交替光照,溫度(23±1)℃,濕度(55±2)%。適應性喂養1周后進行實驗。

本研究按照《實驗動物護理和使用指南》進行,并經醫院實驗動物中心批準。

1.2慢性不可預測溫和應激(chronic unpredictable mild stress,CUMS)誘導抑郁模型 CUMS模型誘導大鼠抑郁[12]。應激方法有束縛、冰水游泳、禁食、禁水、晝夜顛倒、噪音刺激、夾尾等。大鼠每天至少接受一次應激刺激,避免連續4周使用相同的刺激。對照組大鼠(n=6)不接受任何刺激。觀察并記錄大鼠體重的變化,制備4周CUMS模型后,隨機選擇18只大鼠,采用蔗糖偏好測試(sucrose preference test,SPT)、曠場測試(open field test,OFT)、強迫游泳測試(forced swim test,FST)、高架十字迷宮(elevated plus maze,EPM)檢測大鼠的抑郁樣行為。

為了研究miR-326對抑郁大鼠的作用,將CUMS大鼠隨機分為CUMS組、CUMS+agomiR NC組和CUMS+agomiR 326組,每組6只。最后1次CUMS暴露后,進行側腦室注射[13]。具體步驟如下,首先使用戊巴比妥鈉(40 mg/kg)麻醉大鼠,將大鼠置于立體定位儀上。在顱骨上的皮膚上做一個切口,用微鉆在目標位置(雙側海馬)上方的顱骨上打2個小洞。使用微量注射器將20 μL miR-326 agomiR溶液(含有10 nmol miR-326 agomiR)或agomiR NC(含有10 nmol agomiR NC)(廣州市銳博生物科技有限公司,廣州,中國)雙向注射到海馬內[14]。注射時間超過5 min,允許緩慢擴散。對照組大鼠以同樣的方式注射相同數量的鹽水。在注射后1周進行行為測試,之后將大鼠安樂死,收集解剖其大腦并分離下丘腦、海馬組織用于生化分析。

1.3SPT SPT是一種廣泛接受的類似抑郁行為的測量方法[15]。在測試之前,大鼠保持禁食水,并且用2瓶1%蔗糖溶液使大鼠適應環境。在接下來的24 h內,用自來水替換其中一瓶1%蔗糖溶液。測試當天,給大鼠200 mL自來水和200 mL 1%蔗糖溶液。12 h后,將瓶子交換1次。24 h后,收集瓶子。蔗糖消耗/總水消耗表示為蔗糖偏好。

1.4OFT OFT被用來評估動物的運動。該裝置是一個120 cm×90 cm×35 cm的不透明開口盒,周圍是黑色的。盒子的底部被白線分成25個正方形。外圍的16個方塊被認為是外圍站點,中間的9個方塊被認為是中心區域。在安靜的環境中,將大鼠單獨放置在裝置的角落中,并允許其自由探索5 min。測試前30 min,動物被放入實驗室以適應環境。每次測試后,用70%的乙醇徹底清洗該裝置。通過VideoTrack動物行為分析系統(VideoTrack 3.0,Viewpoint,French)收集和分析大鼠活動數據。

1.5EPM 使用EPM檢測大鼠的焦慮樣行為[16]。大鼠被放置在EPM裝置的中間,用攝像機記錄其行為5 min。大鼠在張開的雙臂中度過的時間百分比用作評價焦慮樣行為的指標。每次測試后,將迷宮清理干凈。

1.6FST FST是評估動物絕望行為的經典方法,可以顯示嚙齒類動物的抑郁程度[15]。將大鼠置于水溫為(25±1)℃、深度為30 cm的垂直有機玻璃圓筒(45 cm×20 cm)中。在5 min內記錄大鼠的靜止時間。

1.7酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 定量ELISA試劑盒(ZK-R3347,ZK-R3052和ZK-r 3397;深圳子科生物科技有限公司,深圳,中國)用于測定下丘腦中去甲腎上腺素(norepinephrine,NE)、多巴胺(dopamine,DA)、5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的含量。所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.8實時熒光定量聚合酶鏈反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR) 將大鼠海馬組織磨碎并加入細胞裂解物中。使用RrimeScript從細胞中提取總RNARTreagen試劑盒(TaKaRa,大連,中國)。用紫外分光光度計檢測總RNA純度,以A260/A280≥1.80為合格標準。根據DBI-2220 Bestar的說明,將來自每個樣品的1 μg RNA逆轉錄成cDNA銩qPCR RT試劑盒(TaKaRa)。使用SYBR進行實時PCR Premix Ex Taq試劑盒(TaKaRa)和iQ5實時PCR檢測系統(Bio-Rad Laboratories,California,USA)。PCR反應條件為:95 ℃ 3 min,95 ℃ 30 s,52 ℃ 30 s,73 ℃ 30 s,連續循環38次。引物序列見表1,U6用作內參。采用2-δδCt方法。

表1 qRT-PCR引物序列

1.9雙熒光素酶實驗 為了闡明miR-326的靶向作用,進行了體外熒光素酶實驗,測試miR-326與TLR4 3'UTR之間的相互作用。Targetscan生物信息學網站(https://www.targetscan.org/vert_72/)顯示,TLR4是miR-326的潛在目標。銳博生物科技有限公司構建并合成了4種不同的重組載體:pmirGLO-TLR4-WT、pmirGLO-TLR4-MUT。使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)將報告載體與miR-326 mimic(或miR-NC)共同轉染到HEK293T細胞(中國科學院細胞庫,上海,中國)。

1.10Western Blot 總蛋白提取試劑盒(Beyotime,北京,中國)用于從海馬組織中提取總蛋白。使用增強型BCA蛋白檢測試劑盒(Beyotime)測量蛋白濃度。裝載總共50 μg蛋白質,并通過SDS-PAGE分離。然后,將蛋白質轉移到聚偏二氟乙烯膜(Immobilon,Millipore,MA)上。室溫下用含5%脫脂牛奶的TBST封閉膜2 h。然后,將膜與第一抗體在4 ℃孵育過夜。一抗具體信息如下:TLR4(1∶1 000,ab217274,135 000)、MyD88(1∶1 000,ab219413,33 000)、β-actin(1∶1 000,ab8227,42 000)。用TBST洗滌后,將膜與HRP綴合的山羊抗兔第二抗體在室溫孵育2 h。然后,使用增強化學發光試劑顯影該膜。所有抗體購自abcam(Cambridge,MA,USA)用NIH Image J 7.0分析每個條帶的灰度值。

1.11統計學方法 應用SPSS 21.0統計學軟件處理數據。計量資料比較采用獨立樣本t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1CUMS導致大鼠抑郁樣行為 慢性低強度應激是抑郁癥的主要原因之一,CUMS通過每天給予模型動物不同的刺激來誘導抑郁。CUMS組大鼠體重、蔗糖消耗量、OFT中心區域停留時間及張開手臂時間低于對照組,FST靜止時間明顯高于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。表明,CUMS導致大鼠抑郁樣行為。

表2 慢性不可預測的輕度應激導致大鼠抑郁樣行為

2.2過表達miR-326抑制大鼠抑郁樣行為 qRT-PCR顯示,暴露于CUMS后,CUMS組大鼠海馬組織中miR-326表達顯著低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05),為了研究miR-326對CUMS大鼠的作用,將miR-326 agomir注射到大鼠海馬中,CUMS+agomiR 326組大鼠海馬組織中miR-326表達高于CUMS+agomiR NC組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表3。體重及行為測試顯示,CUMS+agomiR 326組大鼠體重、蔗糖消耗量、OFT中心區域停留時間及開放臂停留時間顯著高于CUMS+agomiR NC組,FST靜止時間明顯低于CUMS+agomiR NC組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表4。

表3 qRT-PCR檢測大鼠海馬組織miR-326表達水平

表4 過表達miR-326抑制大鼠抑郁樣行為

2.3過表達miR-326保護抑郁大鼠腦組織 根據神經激素假說,抑郁癥與DA和/或5-HT代謝調節活動有關。檢測下丘腦中的神經遞質含量,結果顯示,CUMS組NE、DA和5-HT水平顯著低于對照組,而上調miR-326的表達后,CUMS+agomiR 326組NE、DA和5-HT水平顯著高于CUMS+agomiR NC組,差異有統計學意義(P<0.01)。見表5。表明,海馬組織中過表達miR-326保護抑郁大鼠腦組織。

表5 過表達miR-326保護抑郁大鼠腦組織

2.4miR-326靶向調控TLR4/MyD88信號通路發揮對抑郁大鼠的保護作用 為了進一步研究miR-326對抑郁大鼠的潛在作用機制,通過TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_72/)預測了miR-326的下游靶基因,并在其中關注到了TLR4。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLRs)是先天免疫的識別蛋白,發現于腦室周圍器官和脈絡叢。因此推測miR-326通過TLR4對抑郁大鼠發揮保護作用。TargetScan網站預測miR-326與TLR4的結合位點(圖1),然后在HEK293T中進行了雙熒光素酶報告實驗來驗證其靶向結合關系,見表6。Western blot檢測各組大鼠海馬組織TLR4結果顯示,經過CUMS誘導后,CUMS組大鼠TLR4蛋白和MyD88蛋白水平顯著高于對照組,而在過表達miR-326后,CUMS+agomiR 326組大鼠TLR4蛋白和MyD88蛋白水平顯著降低,差異有統計學意義(P<0.05),見表7。表明,miR-326靶向miR-326靶向調控TLR4/MyD88信號通路發揮對抑郁大鼠的保護作用。

圖1 TargetScan網站預測miR-326與TLR4靶向結合位點

表6 雙熒光素酶實驗檢測miR-326與TLR4靶向結合

表7 Western blot檢測各組海馬組織TLR4/MyD88蛋白的表達

3 討 論

抑郁癥是一種常見的精神疾病,其具有一系列對身體、認知、情感和社會活動過程產生影響的癥狀。它的特點主要是情緒低落,易悲傷,易失眠,且對學習、工作、生活缺乏興趣等等。作為造成全球社會負擔的主要原因之一,抑郁癥的主要治療方法依賴于藥物和心理干預[17-18]。雖然這些療法具有一定的良性效果,但仍有三分之一接受這些抗抑郁藥物干預的患者并未產生正反饋,而其他即使產生藥物良性反饋的患者由于藥物本身的許多不良反應而癥狀沒有得到完全緩解或時常復發[19-20]。因此,探究抑郁癥的相關具體調控分子機制,顯得尤為重要。臨床證據已經表明了神經炎癥在抑郁癥等腦部疾病中起到的重要作用[21],臨床研究和基于嚙齒類動物的研究表明,反復暴露于社會和環境的刺激中會引起體內免疫相關的劇烈變化,例如:血液和大腦中促炎細胞因子的大量積累和抗炎細胞因子的減少[22-24],而作為大腦中先天免疫系統中第一道防線的主要細胞成分,小膠質細胞在神經炎癥的發生發展中發揮了至關重要的作用[25]?；罨男∧z質細胞可以釋放促炎細胞因子,如白細胞介素(interleukin,IL)-1、IL-6、腫瘤壞死因子α 和一氧化氮,以及抗炎細胞因子,如IL-4和IL-10。已經有研究明確表明,人類在急性心理應激的刺激下會持續增加循環的炎癥因子[26]。CUMS是一種為了模擬社會和環境應激源下心理變化的實驗方法[27],已被證實可以引起海馬小膠質細胞激活[28-29]。本研究通過CUMS誘導建立抑郁樣大鼠模型,并通過各種行為學實驗來證實模型的成功建立。

MicroRNA作為一種非編碼RNA已經被證明富含于腦組織中,并與多種腦部疾病相關聯。miR-139-5p是大腦中富含的神經元miRNA,對抑郁大鼠的神經元起保護作用[30];Li等[31]的研究表明,miR-26a-3p在抑郁大鼠的海馬組織中顯著下調,其可增強自噬/溶酶體活性,促進突觸的可塑性最終抑制神經元凋亡。還有一項研究表明,miR-326低表達可能與抑郁有潛在的聯系[32],本研究通過檢測CUMS誘導的抑郁大鼠模型海馬組織中miR-326發現其呈低表達,進一步,通過miR-326 agomiR上調其在海馬中的表達發現其可能對抑郁樣行為起抑制作用。

TLR4/MyD88參與了抑郁癥的發展[33],本研究通過TargetScan數據庫篩選出TLR4上游靶向調控miR-324,并進一步檢測到當調控miR-324時,下游TLR4/MyD88通路隨之發生變化,這預示著TLR4/MyD88通路可能參與miR-326調控的大鼠抑郁樣行為。

總之,在CUMS誘導的抑郁大鼠中,調控miR-326可能通過TLR4/MyD 88對抑郁樣行為及大鼠海馬區產生影響。雖然僅探究了單一一條分子機制,但未來隨著分子機制的一一解析,現在的成果終將成為攻克該病的基石。