宮頸癌外照射對腸道菌群的影響

梁鈺霞,高 琨

(1.廣西壯族自治區人民醫院產科,廣西 南寧 530021;2.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院婦瘤科,廣西 南寧 530021)

微生物菌群出現菌群失調會增加有害代謝產物產生和有害的抗原微生物表達,通過促進黏膜炎癥或系統失調、或可能改變抗癌免疫治療,而腫瘤內、腫瘤附近和腫瘤遠處的微生物可以通過多種機制改變癌癥的易感性和進展,如調節炎癥、誘導DNA損傷和產生與腫瘤發生或腫瘤抑制相關的代謝物[1]。已有研究表明,宮頸癌患者和健康人的腸道菌群有顯著差異,腸道菌群的變化對婦科癌癥診療有影響[2]。目前關于16S基因測序對接受盆腔放射治療的宮頸癌患者腸道菌群變化的研究結論不一,且尚不清楚腸道菌群的變化與放射性腸炎、放射治療效果是否存在相關性。為避免宮頸癌內照射治療陰道及宮腔操作帶來的影響,本研究將前瞻性探討外照射對宮頸癌患者腸道菌群的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2019年5月—2021年12月期間廣西醫科大學附屬腫瘤醫院婦瘤科初診病理檢查證實為宮頸癌ⅡA2～Ⅳ期患者67例的糞便樣本,年齡31～77歲,平均(52.8±9.9)歲;所有患者入組前7 d未使用類固醇、抗菌藥物者,且治療過程中未使用抗菌藥物及免疫抑制劑。排除標準:合并高血壓、糖尿病、炎癥性腸病者及自身免疫性疾病者、曾有消化道手術史者;既往有盆腔放射治療或全身治療史者。所有患者均采用6 mVX線進行調強放射治療和后裝治療,每周順鉑(40 mg/m2)同期化療。

本研究經醫院倫理委員會審批通過,所有患者知情同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1樣本收集加工、基因測序 用引物341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)和806R(5′-GGACTACNNGGGTATCTAAT-3′)在2720熱循環儀(美國應用生物系統公司)上擴增出16SrRNA基因V3～V4高變區。PCR擴增程序為:98 ℃保溫2 min,98 ℃保溫30 s,50 ℃保溫30 s,72 ℃保溫1 min,共20個循環,最后在72 ℃孵育5 min。反應一式三份。反應混合物(共50 mL)由2×TransStart FastPfu Fly PCR SuperMix(25 mL)、每個引物(1 mL/10 mm)、無酶水(20 mL)和模板DNA(10 Ng)組成。PCR產物用VAHTS DNA清潔珠純化。使用特殊的索引引物,在不同條件下進行二次PCR。PCR擴增程序為:98 ℃ 30 s,98 ℃ 10 s,65 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共10個循環,72 ℃孵育5 min。反應混合物(共50 mL)包括Phusion DNA聚合酶(25 mL)、I5/I7指數引物(1 mL/2.5 mmol/L)、超純水(13 mL)和純化的PCR產物(10 mL)。在1.8%瓊脂糖凝膠上分析反應以確保擴增成功。不成功的反應在初始模板濃度稀釋10倍后重復,如果再次不成功,則從實驗中移除。從瓊脂糖凝膠中提取PCR產物,用AxyPrep DNA Gel Extract Kit(Axygen Biosciences,USA)進一步純化,并用Tris-HCl洗脫。用Image J(美國馬里蘭州貝塞斯達國立衛生研究院)對電泳結果進行量化。文庫以等摩爾濃度混合,在1.8%瓊脂糖凝膠上溶解,提取目標大小400～490 bp的條帶。在Illumina NovaSeq 6000平臺進行配對末端測序(2×250)[3]。

1.2.2臨床資料采集 收集所有患者臨床信息(姓名、年齡、卡氏(Karnofsky performance status)評分、病理類型、人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)狀態、分期、外照射開始和結束時間)、療效指標(治療前后血清腫瘤標志物水平、放射治療后胃腸道反應評分、MRI腫瘤大小、近期療效評價等),通過自身對照,將患者分為治療前組(T0組)與治療后組(T1組)。放射性腸炎診斷標準參考2018《放射性直腸炎診斷標準》。所有患者無出現3～4級放射性腸炎者,故將患者分為無放射性腸炎組(non-radioactive enteritis group,E0)和1～2級放射性腸炎組(radio-enteritis group,E1)。根據外照射前后MRI行近期療效評價,腫瘤消退率=(放射治療前腫瘤體積V1-外照射治療結束前腫瘤體積V2)/放射治療前腫瘤體積V1×100%;Nam等[4]發現宮頸癌經過外照射放射治療,腫瘤消退率≥75%是能區別除患者預后差異的最佳閾值。因此將腫瘤消退率≥75%視為有效組(the response to effective group,R1),腫瘤消退率<75%視為效果欠佳組(the response to ineffective group,R0)。

1.3生物信息學分析 將雙端測序數據加載到qiime2(version 2021-11)[5],用dada2(denoise-paired)進行數據處理。最終生成擴增子序列變體(amplicon sequence variants,ASV)豐度表和序列文件[6]。物種分類基于樸素貝葉斯方法(classify-sklearn)并以Greengenes數據庫參考序列(V201308)為訓練集。過濾掉只在一個樣本并且豐度小于10(reads)的ASV,同時也過濾掉比對到非細菌的ASV。利用MAFFT方法進行多序列比對,構建系統進化樹?；谶^濾后的ASV豐度表計算α多樣性和β多樣性。在PCoA中繪制了UniFrac距離矩陣,并使用R包“ADE4”進行統計與作圖。對于患病率>10%的分類群,在門、綱、目、科、屬、種水平上采用Wilcoxon秩和檢驗進行差異豐度分析。使用QIIME2(version 2021-11)進行計算出α多樣性指數(包括Simpson指數、Shannon-entropy指數、Pielou-evenness指數、Chao1指數、Faith-pd指數、Observed-features指數)、β多樣性指數(包括Bray-Curtis,jaccard、weighted UniFrac,unweighted UniFrac),其中,Observed species指數、Chao指數、Pielou-evenness指數、Faith-pd反映樣品中群落的豐富度,即簡單指群落中物種的數量,而不考慮群落中每個物種的豐度情況,shannon指數以及simpson指數反映群落的多樣性;除simpson指數指數外,其余指數越大,說明樣本中物種的多樣性越豐富。

圖8 放射治療前后R0與R1組間相對豐度存在顯著差異的腸道菌群A. p_Proteobacteria.c_Gammaproteobac-teria(P=0.002);B. o_Erysipe-lotrichales.f_Erysipelotrichaceae (P=0.040);C. o_Bacteroidales.f_Bacteroidace-ae(P=0.037);

1.4統計學方法 應用R統計學軟件分析數據。計量資料比較采用t檢驗和Kruskal-Wallis秩和檢驗,計數資料比較采用χ2檢驗或Fisher確切率概率法。采用Wilcoxon秩和檢驗計算Simpson指數、Shannon-entropy指數、Pielou-evenness指數、Chao1指數、Faith-pd指數、Observed-features指數。Bray-Curtis矩陣算法是考慮物種在組間的絕對豐度,其所反映的是物種間的距離;UniFrac矩陣算法則考慮進了物種間的進化關系,所對應的為距離矩陣的權重算法(weighted UniFrac)。對應矩陣的非權重算法(unweighted UniFrac)則是將原先算法的ASV豐度表的數值進行二進制轉化再進行計算,其只考慮了物種在各個樣本間否存在,而不考慮物種豐度。對Bray-Curtis,jaccard、weighted UniFrac,unweighted UniFrac進行ANOSIM分析檢測兩組樣品間是否有顯著性差異,找到組別中差異成分;使用線性分析效應對細菌群落組成的相似性即β多樣性指數進行計算,并確定治療前和治療結束后細菌屬的變化,選擇線性判別分析得分大于2的微生物群作為與放射治療相關的微生物群。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1患者臨床資料特征 根治性盆腔外照射治療患者72例,其中剔除信息不全者,共收集患者67例糞便樣本134個。宮頸癌臨床分期:Ⅱa2～Ⅲb期29例,Ⅲc1r～Ⅳb期38例;病理類型:鱗癌64例,腺癌3例;淋巴結轉移38例,高危型HPV感染57例。

2.2外照射治療前后的腸道菌群變化

2.2.1外照射治療前后腸道菌群豐富度與多樣性的比較 樣本中總共獲得了2 844個ASV。其中,放射治療前組檢出2 620例(92.1%),外照射治療后組檢出2 271例(79.9%),治療前組和治療后組均檢出2 047例(71.9%)。T0組與T1組α多樣性指數即Simpson指數、Shannon-entropy指數、Pielou-evenness指數、Chao1指數、Faith-pd指數、Observed-features指數差異無統計學意義(P>0.05)。即外照射治療前后腸道菌群豐富度差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 治療前后腸道菌群α-多樣性指數比較

2.2.2外照射治療前后腸道菌群結構的比較 經ANOSIM分析結果顯示,β多樣性Bray-Curtis指數主成分差異有統計學意義(R值=0.014,P=0.039),其主成分分析(PcoA-2D)(圖1),即外照射治療前后腸道菌群組成絕對豐度差異有統計學意義(P<0.05)。見表2。

圖1 放療前后腸道菌群Bray-Curtis指數的PCoA 2D圖

表2 治療前后腸道菌群β-多樣性指數比較

2.2.3放射治療對患者的腸道菌群成分的影響 將ASV與數據庫比對,進行物種分類,分別在門、綱、目、科、屬、種幾個分類等級對各個樣品作物種profiling面積圖和柱狀圖,在門水平做出所有物種的柱狀圖,從綱水平開始,將物種豐度在所有樣品均低于0.5%的物種全部合并成其他物種,結果顯示,在放射治療前后腸道微生物菌群在“屬”水平上物種豐度更高(圖2)。放射治療前后之間不同富集的特定細菌門、綱、目、科和屬,顯示了放射治療期間腸道微生物群的組成變化(顯著差異是對數線性判別分析得分>2和Kruskal-WallisP值<0.05)(圖3)。其中發生最顯著的菌群相對豐度改變的細菌包括梭桿菌門、變形桿菌門;變形桿菌門、γ-變形菌綱、腸桿菌目、腸桿菌科的相對豐度降低,而梭狀芽胞桿菌類成員包括梭桿菌門、梭桿菌綱、梭桿菌目、梭桿菌科以及毛螺菌科的Dorea屬、韋榮球菌科的Anaerosinus屬、腸桿菌科的變形桿菌屬的相對豐度顯著升高。共篩選出7種菌群豐度差異有統計學意義,分別為A變形菌門-γ變形菌綱(p-Proteobacteria.c-Gammaproteobacteria)(P=0.009)、B腸桿菌科-變形桿菌屬(f-Enterobacteriaceae.g-Proteus)(P=0.048)、C毛螺菌科-Dorea屬(f-Lachnospiraceae.g-Dorea)(P=0.044)、D韋榮球菌科-Anaerosinus屬(f-Veillonellaceae.g-Anaerosinus)(P=0.024)、E變形桿菌門(k-Bacteria.p-Proteobacteria)(P=0.007)、F腸桿菌目-腸桿菌科(o-Enterobacteriales.f-Enterobacteriaceae)(P=0.004)、G梭形桿菌目-梭桿菌科(o-Fusobacteriales.f-Fusobacteriaceae)(P=0.035),結果示差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4。

圖2 在外照射治療前后的糞便樣本中“屬”水平菌群分布

圖3 放射治療前后腸道菌群變化及差異

圖4 放射治療前后腸道中相對豐度存在顯著差異的菌群 A.p-Proteobacteria.c-Gammaproteobacteria(P=0.009);B.f-Enterobacteriaceae.g- Proteus(P=0.048);C.f-Lachnospiraceae.g-Dorea(P=0.044);D.f-Veillonellaceae.g-Anaerosinus(P=0.024);E.k-Bacteria.p- Proteobacteria(P=0.007);F.o-Enter-obacteriales.f- Enterobacteriaceae(P=0.004);G.o-Fusobacteriales.f- Fusobacteriace-ae(P=0.035)Figure 4 The intestinal flora with significant difference in relative abundance before and after external irradiation

2.3分層分析

2.3.1放射性腸炎與腸道菌群的關系

2.3.1.1放射性腸炎與腸道菌群豐富度及多樣性變化的關系 分別對E0組(n=42)、E1組(n=25)放射治療前后進行對比分析,細菌群落豐富度由觀察到的ASVs確定,α多樣性分析結果顯示,E0與E1組在治療前后α多樣性指數差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 E0與E1組間在T0、T1時α多樣性指數比較

2.3.1.2E0、E1組間腸道菌群結構的差異 采用Bray-curtis、Jaccard、Unweighted Unifrac和Weighted Unifrac四種距離矩陣Anosim分析方法,對E0、E1兩組放射治療前后β多樣性指數進行顯著性分析,結果顯示,E0、E1組治療前后各組間β多樣性指數差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 E0與E1組間在T0、T1時β多樣性指數比較

2.3.1.3E0、E1組腸道菌群組成及差異分析 利用LEfSe確定了患者腸道微生物群的組成變化(顯著差異是對數線性判別分析得分>2和Kruskal-WallisP值<0.05),見圖5。圖6中顯示了放射治療期間E0和E1組間主要菌群相對豐度的變化,兩組共篩選出9種菌群豐度差異有統計學意義,在放射治療前,E1組中厚壁菌門(P=0.029)、γ變形菌綱的氣單胞菌(P=0.033)、糞芽孢菌屬(P=0.046)的相對豐度最高,E0組中未發現相對豐度差異有統計學意義的菌群;在放射治療后,E0組中放線菌目微球菌科(P=0.029)、羅氏菌屬(P=0.038),E1組中乳桿菌科(P=0.048)、擬桿菌門(P=0.025)、擬桿菌目S24-7(P=0.025)、布雷德菌屬(P=0.028)相對豐度增高,差異有統計學意義(P<0.05),見圖6。

圖5 放射治療前后E0與E1組間腸道菌群LEfSe分析A.放射治療前;B.放射治療后Figure 5 LEfSe analysis of in-testinal flora between E0 group and E1 group

圖6 放射治療前后E0與E1組間相對豐度存在顯著差異的腸道菌群

2.3.2腫瘤消退率與腸道菌群的關系

2.3.2.1腫瘤消退率與腸道菌群豐富度及多樣性變化的關系 腫瘤消退率<75%為治療效果欠佳(R0)組(n=18),腫瘤消退率≥75%為治療有效(R1)組(n=49),分別對R0、R1組放射治療前后進行對比分析,結果顯示,R0、R1組治療前后α多樣性指數差異無統計學意義(P>0.05)。見表5。

表5 R0與R1組治療前后α多樣性指數比較

2.3.2.2R0組及R1組組間腸道菌群結構的差異 采用距離矩陣Anosim分析方法,對放射治療前后腸道菌群結構的差異進行β多樣性指數顯著性分析,結果顯示,R0和R1組治療前后β多樣性指數差異無統計學意義(P>0.05)。見表6。

表6 R0與R1組治療前后β多樣性指數比較

2.3.2.3R0組及R1組組間腸道菌群組成及差異分析 利用LEfSe確定了患者腸道微生物群的組成變化(顯著差異是對數線性判別分析得分>2和Kruskal-WallisP值<0.05),見圖7,在放射治療前,僅發現R0組中變形菌門變形菌綱(P=0.002)相對豐度較高,在放射治療后,擬桿菌(P=0.037)、毛螺菌科—Lactonifactor(P=0.037)、巴斯德菌(P=0.048)、丹毒絲菌(P=0.040)在R1組相對豐度較高。共篩選出5種菌群豐度差異有統計學意義(P<0.05),見圖8。

圖7 放射治療前后R0組與R1組腸道菌群LEfSe分析A.放射治療前;B.放射治療后Figure 7 LEfSe analysis of in-testinal flora between R0 group and R1 group

3 討 論

現已知某些細菌和病毒和癌癥有關,胃腸道細菌的影響并不局限于消化道內的癌癥,也被證明可以影響肝細胞癌的轉移,可能是通過細菌成分如脂多糖或間接地通過全身炎癥及先天免疫途徑轉移到肝臟[7]。亦有研究報道,由于腸道共生微生物的存在,系統性Th17炎癥因子或抗炎Treg因子被激活,可能改變任何器官的癌癥風險,包括宮頸、卵巢和子宮等[8-9]。

放射治療是宮頸癌治療中的主要手段之一。同步放化療是目前規范的宮頸癌放射治療模式。放化療對人腸道微生物菌群的不良影響已經獲得數據的支持。一項采用16SrRna測序分析宮頸癌患者(n=8)和健康對照組(n=5)的腸道微生物區系,結果表明與宮頸癌相關的腸道微生物菌群在α多樣性指數有增加的趨勢,但差異無統計學意義(P>0.05);β多樣性指數分析表明癌癥患者與健康對照組之間的群體結構的組間變異性差異有統計學意義,宮頸癌患者糞便標本中以變形菌屬最豐富,其中7個屬(大腸桿菌志賀菌屬、玫瑰桿菌屬、假單胞菌屬、梭狀芽孢桿菌屬、乳桿菌科UCG-004屬、多爾菌屬和琥珀酸桿菌屬)的相對豐度差異有統計學意義(P<0.05)[10]。類似的研究表明,癌癥患者和健康人群兩組的胃腸道微生物菌群差異有統計學意義。癌癥患者治療前放線菌的相對豐度是健康人的30倍,而梭桿菌、變形桿菌的相對豐度分別是健康人的7.4%、1.4%[11]。也有發現在接受盆腔放射治療后的患者與健康人群相比,其腸道微生物群的豐度、多樣性普遍降低[12]。本研究前瞻性分析宮頸癌患者外照射前后腸道菌群的變化,結果顯示,放射治療前后α多樣性指數差異無統計學意義(P>0.05);β多樣性Bray-Curtis指數差異有統計學意義(P<0.05),說明治療前后腸道菌群組成差異有統計學意義,發現放射治療后變形桿菌門、γ-變形菌綱、腸桿菌目、腸桿菌科的相對豐度降低,而梭狀芽胞桿菌類成員以及毛螺菌科的Dorea屬、韋榮菌科的厭氧菌屬、變形桿菌屬的相對豐度顯著升高。有研究發現厚壁菌門和梭菌經放射治療后分別顯著減少10%和增加3%,差異有統計學意義(P<0.05)[11];另一研究發現放射治療期間腸道菌群組成發生明顯變化,變形桿菌增多,梭狀芽胞桿菌減少,但放射治療后這些菌群恢復到基線水平,而類桿菌種類增加[13]。有研究報道在放射治療后,宮頸癌患者腸道菌群中擬桿菌門的普雷沃菌明顯減少,而厚壁菌門的鏈球菌和梭狀芽胞桿菌明顯增多(P<0.05)[14]。由此可見,研究結果不一,較多研究發現接受放射治療后的腸道菌群豐度及多樣性是降低的。

本研究在放射性腸炎的分層分析中的結果與上述結果有相似之處,即在治療后及放射性腸炎組中差異有統計學意義的菌群多為條件致病菌,且菌群種類相對增多;并而首次發現發生放射性腸炎的宮頸癌患者中,其腸道菌群以乳桿菌科、擬桿菌門、擬桿菌目S24-7科、f-Erysipelotrichaceae.g-Bulleidia為主。

目前尚無對腫瘤消退情況與腸道菌群變化相關性報道。在根據腫瘤消退率的分層分析中發現,R0與R1兩組中腸道微生物菌群的豐富度α多樣性指數及β多樣性指數差異無統計學意義。但可觀察到在放射治療期間,菌群的組成及相對豐度是有變化的。治療前,僅發現R0組中變形菌門、變形菌綱相對豐度較高;治療后,擬桿菌、Lactonifactor、巴斯德菌、丹毒絲菌(Erysipelotrichaceae)在R1組相對豐度較高。Erysipelotrichaceae是從屬于厚壁菌門的一種革蘭陽性菌,其相對豐度與腫瘤壞死因子α水平及肝臟脂肪代謝水平呈正相關,其特定分類群可能參與炎癥反應,而其他分類群具有高度的免疫原性[15]。因此Erysipelotrichaceae可能與代謝紊亂及炎癥具有一定相關性,本研究發現丹毒絲菌在經放射治療后腫瘤消退率較高的患者腸道中相對豐度較高,其是否可以增加放射治療的抗腫瘤效果還有待進一步的研究觀察,且有必要研究其代謝譜以及其豐度的變化對宿主的直接影響。

綜上所述,宮頸癌患者外照射前后腸道菌群結構和組成均有顯著改變,此變化可能與增加放射性腸炎的發生有關,并可能對近期治療效果產生一定影響。