編織型藥物洗脫食管覆膜支架及其體外抑制細胞增生性能

王 玥，李金奉，王 璐，b，c，關國平，b，c

(東華大學 a.紡織學院,b.紡織面料技術教育部重點實驗室,c.紡織行業生物醫用紡織材料與技術重點實驗室, 上海 201620)

食管是位于人體咽和賁門之間的細長消化管道,食管癌是全球癌癥死亡的第六大常見原因[1]。食管鱗狀細胞癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)是最常見的食管癌之一[2]。我國食管癌的發病率排在所有惡性腫瘤的第5位,致死率排在第4位,發病人數居世界首位[3]。食管癌晚期病人的食管管徑約70%會被癌組織浸潤,進而導致食管狹窄[4]。對于早、中期食管癌患者,可以采用內鏡下擴張[5]、光動力學[6]等手段來緩解其食管狹窄癥狀;而對于晚期、高齡食管癌患者,多采用食管支架植入術[7]來打開或重建狹窄的食管管腔[8]。

目前臨床上應用較為廣泛的食管覆膜支架通常包括手工編織的支架和負載的流延膜。手工編織的支架多采用鎳鈦(NiTi)合金絲[9],而流延膜的材料包括硅膠、聚氨酯等。傳統覆膜支架的生產工藝流程長、耗時多、生產效率低,產品質量的一致性不易控制。此外,有研究[10]表明,食管支架植入術后最常見、最嚴重的遠期并發癥為食管再狹窄,其發生比例可達30%～40%。發生食管再狹窄的直接原因是覆膜強度不足而破裂,間接原因包括癌組織的生長、正常組織因機械刺激而發生的異常增生[11-12]。

解決食管再狹窄,一方面需要提高覆膜強度,另一方面可考慮開發藥物洗脫支架[13]。治療食管狹窄的藥物洗脫支架(drug eluting stent,DES)已被證明可以緩解支架誘導的組織增生或腫瘤生長[14]。藥物洗脫支架常用藥物為雷帕霉素、紫杉醇和五氟嘧啶(5-FU)[5]。理想的藥物洗脫支架可抑制腫瘤生長而不影響內皮修復過程[15],其藥物釋放時間應維持在2周以上[16]。載藥覆膜支架要持續維持均勻的力學強度、良好的柔順性,就要在覆膜支架材料選擇和結構設計方面做深入研究[17]。郭慶海[18]以乙烯酸乙烯酯共聚物為載體、5-FU為增生抑制藥物,所制備的食管支架沒有出現嚴重局部炎癥反應和毒性反應。有的藥物洗脫支架不但可以抑制組織增生,還可以抗腫瘤[19],可使術后食管再狹窄率降至5%～10%[20]。載體材料可選擇聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA)、聚乳酸(polylactic acid,PLA)等[21]醫用可降解高分子材料,其可以較好地控制降解時間,從而控制藥物釋放速率。載藥覆膜的制備工藝主要有浸漬法、噴涂法、熱壓法、靜電紡絲法[22]。

本文采用機械編織的方法一次成型食管覆膜支架,以PLGA為載體材料、雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)為細胞增生抑制藥物,對該覆膜支架進行涂層、載藥,并對一體化編織食管覆膜支架和載藥覆膜支架進行較系統的測試和表征,以期為進一步開發生產效率高、產品質量穩定、覆膜強度高,以及具有細胞增生抑制效果的食管覆膜支架產品提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

直徑為0.2 mm的鎳鈦合金絲(廣東富江醫學科技有限公司);線密度為333 dtex的滌綸長絲(貝爾泰新纖維制品有限公司);30/50/60邵爾硬度的硅膠混煉膠(上海錦上化工有限公司);四氫呋喃(柯林斯(Collins));PLGA75/25(n(LA) ∶n(GA)=75∶25)和PLGA50/50(n(LA) ∶n(GA)=50∶50)(濟南岱罡生物降解材料),其中,LA為乳酸,GA為羥基乙酸;雷帕霉素、二氯甲烷、乙腈和無水乙醇(羅恩試劑);磷酸緩沖鹽(phosphate buffer saline,PBS)溶液(自制);BioMine stent(Meril);Supralimus stent(Sahajanand);FireBird stent(上海微創醫療器械有限公司);成纖維細胞L929和腫瘤細胞DU145(中科院細胞庫);DMEM基礎培養基、MEM基礎培養基、青霉素-鏈霉素和胰蛋白酶(Gibco);AM/PI活/死細胞染色劑(1000 T、凱基生物科技有限公司);Cell Counting Kit-8試劑盒(500 T、上海翊圣生物科技有限公司);細胞培養瓶和24孔與96孔細胞培養板(康寧生命科學有限公司)。

1.2 覆膜支架的設計與制備

1.2.1 一體化編織食管覆膜支架的制備

一體化編織食管覆膜支架的制備流程如圖1(a)所示,采用32錠編織機將滌綸復絲與NiTi合金絲編織成一體化食管覆膜支架(Y-ES)。先對NiTi合金絲進行熱定型處理,再將NiTi合金絲纏繞至錠子。通過繞紗機將滌綸單絲并股纏繞到錠子上,將纏有滌綸復絲與NiTi合金絲的錠子按圖1(b)所示的方式排列,其中,藍色粗線代表NiTi合金絲,黑色細線代表滌綸復絲。

圖1 一體化編織食管覆膜支架制備示意圖Fig.1 Schematic diagram of the preparation of integrated braided esophageal covered stents

1.2.2 硅膠食管覆膜支架的制備

硅膠食管覆膜支架的制備流程如圖2所示。采用32錠編織機,用NiTi合金絲編織內徑為9 mm的裸支架(N-ES)。利用硝酸-氫氟酸清洗裸支架表面30 min,再在超聲波清洗器中用去離子水清洗3次,50 ℃烘干。分別取邵爾硬度為30、50、60的硅膠各5 g,并置于45 mL的四氫呋喃中進行溶解,得到硅膠溶液。再將N-ES支架浸漬在硅膠溶液中以制備傳統的硅膠食管覆膜支架。硬度為30、50、60的硅膠食管覆膜支架分別記為C30-ES、C50-ES和C60-ES。

圖2 硅膠食管覆膜支架制備示意圖Fig.2 Schematic diagram of the preparation of silicone esophageal covered stents

1.2.3 一體化編織食管載藥覆膜支架的制備

將直徑為9 mm、長度為20 mm的Y-ES支架在二氯甲烷中浸泡2 h后通風處理2 h,再置于超聲波清洗器中清洗3遍,再次通風處理2 h,在50 ℃的條件下干燥。在遮光條件下,分別稱取1.2 g PLGA75/25和PLGA50/50并置于2個100 mL的離心管中,分別向2個離心管中加入0.06 g雷帕霉素(RAPA),再加入60 mL二氯甲烷進行溶解,即制得載藥溶液[23]。

將預處理過的Y-ES支架垂直放入載藥溶液中,并將離心管放置在搖床中,以轉速60 r/min振蕩2 h。試樣取出后放在37 ℃的干燥箱中干燥2 h,即制得2種一體化編織食管載藥覆膜支架,記為PLGA75/25-RAPA-Y-ES、PLGA50/50-RAPA-Y-ES。

1.3 覆膜耐疲勞性能測試

植入的食管覆膜支架在體內會受到食管的生理性蠕動和吞咽食物的摩擦,因此,覆膜的耐疲勞性能是決定覆膜失效、食管再狹窄的關鍵。利用筆者課題組自主研發的覆膜強度評價裝置[24],對Y-ES、C30-ES、C50-ES和C60-ES的覆膜耐疲勞性進行測試。測試參數:試樣長度為7 cm,隔距為5 cm,測試頭移動距離為1.5 cm,移動速度為1 m/min。測試頭為醫用不銹鋼小球,測試頭直徑為9.3 mm。測試完畢,用體式顯微鏡(PXS8-T型,尼康株式會社)分別觀察4種覆膜的形態變化。在上述覆膜強度測試前后,使用人體生物管道徑向壓縮儀(LLY-06D型,萊州電子儀器有限公司)對4種覆膜支架的徑向支撐力進行測試,每種支架測試3個不同位置點,測試結果取平均值。

1.4 覆膜支架表面形態觀察

取一體化編織食管載藥覆膜支架,用掃描電鏡觀察支架表面形態及載藥情況。取藥物釋放試驗后的一體化編織食管覆膜支架,同等條件下觀察覆膜支架的表面形態及藥物釋放情況。

1.5 水接觸角測試

利用OCA15EC型接觸角測試儀對PLGA75/25-RAPA-Y-ES、PLGA50/50-RAPA-Y-ES的表面親水性進行測試。

1.6 體外藥物釋放試驗

配制pH值分別為7.4和6.5,濃度為0.15 mol/L的PBS溶液。取4支10 mL的離心管,分別加入4 mL PBS溶液,其中,1支加入pH=7.4的PBS溶液,另外3支加入pH=6.5的PBS溶液。

將PLGA50/50-RAPA-Y-ES試樣分別置入盛有pH=6.5和7.4的PBS溶液的離心管中,完全浸沒,將離心管置于37 ℃、60 r/min搖床上振蕩。每24 h后將樣品分別轉移至與原條件相同的PBS溶液下繼續進行藥物釋放試驗。將PLGA75/25-RAPA-Y-ES、PLGA50/50-RAPA-Y-ES分別置入盛有pH=6.5的PBS溶液的離心管中,將離心管放于37 ℃、60 r/min搖床上振蕩。每24 h后將樣品分別轉移至另一個盛有pH=6.5 的PBS溶液的離心管中,相同條件下繼續進行藥物釋放試驗。

檢測藥物釋放24 h的PBS溶液中的藥物釋放量。向溶液中加入乙腈溶液以充分溶解藥物,制得乙腈體積分數為40%的PBS溶液,渦旋后用紫外分光光度計測量吸光度,根據標準曲線測得對應藥物濃度。重復以上操作,直至藥物完全釋放。雷帕霉素的累積釋放量及累積釋放率的計算如式(1)和(2)所示。

(1)

(2)

式中:M為雷帕霉素累積釋放量,μg;r為雷帕霉素累積釋放率,%;ρi為第i次取樣時溶液中雷帕霉素的質量濃度,μg/mL;Vi為第i次取樣時雷帕霉素溶液的體積,mL;ρn為第n次取樣時溶液中雷帕霉素的質量濃度,μg/mL;Vn為第n次取樣時雷帕霉素溶液的體積,mL;m為支架上的總載藥量,μg。

1.7 載藥覆膜體外抑制細胞增生試驗

為了體外釋放藥物操作方便,本文制備規格為10 mm×10 mm的滌綸(PET)平紋織物作為載體覆膜來替代一體化編織食管覆膜支架主體,并用上述步驟制備了以PET平紋織物為載體的載藥覆膜(PLGA75/25-RAPA-PET、PLGA50/50-RAPA-PET)以及非載藥覆膜(PLGA50/50-PET)。采用CCK-8和活/死細胞染色法進行載藥覆膜的體外抑制細胞增生試驗。A組為PLGA75/25-RAPA-PET、B組為PLGA50/50-RAPA-PET、C組為PLGA50/50-PET對照組、D組為培養皿空白組,將A、B和C組樣品制備成直徑為14 mm的圓片并進行滅菌處理。試驗選用L929成纖維細胞系和DU145腫瘤細胞系,培養基分別為DMEM(含10% 胎牛血清及1%的雙抗)和MEM(含10% 胎牛血清及1%的雙抗)。

CCK-8試驗參照試劑盒說明書進行。試驗設置1、3、7 d共3個時間點,每個時間點每組設置3個平行樣(n=3)。到培養時間后,吸出24孔板中培養基,用PBS溶液清洗每個樣品3次。避光條件下,采用CCK-8和基礎培養基的體積比為10∶90配制CCK-8試劑,將兩者混合均勻后,每孔中加入500 μL CCK-8試劑,將24孔培養板放回培養箱繼續培養2 h。

培養完成后,轉移24孔板中的液體到96孔板中,24孔板的每個孔取3次,每次100 μL。在波長450 nm處,用酶標儀測量吸光度。吸光度越大,意味著活細胞數量就越多。體外細胞抑制率[25]計算如式(3)所示。

(3)

式中:RIR為細胞抑制率,%;At為試驗組450 nm處的吸光度;Ac為空白組450 nm處的吸光度。

為了進一步觀察體外細胞增殖情況,對A、B和C組樣品進行活/死細胞染色。將L929和DU145種植在樣品上分別培養1和3 d后,取出培養板,吸出培養基,用PBS溶液清洗樣品3次。黑暗條件下配置活/死染色液,V(PBS溶液)∶V(染色劑)=2 000∶1。在PBS溶液中先加PI后再加AM染液,混合均勻后加入試驗孔中,每孔加入200 μL染色液,放入37 ℃培養箱中45 min后,避光條件下將染色液吸出,用PBS溶液清洗樣品3次,在熒光顯微鏡下觀察活/死細胞情況。

1.8 數據的統計分析

2 結果與討論

2.1 覆膜支架的結構與外觀

一體化食管覆膜支架(Y-ES)、金屬裸支架(N-ES)、硅膠覆膜支架(C-ES)的形態結構如圖3所示。Y-ES結構規整、致密,滌綸長絲有序交錯,NiTi合金絲規則分布并與滌綸絲均勻交織為一體,管徑勻稱(見圖3(a))。N-ES結構規整、管徑一致、孔尺寸均勻(見圖3(b))。C-ES的硅膠膜能夠均勻地將金屬絲及其交織點完全包裹,裸支架的孔被封閉,覆膜并未對金屬支架的結構和直徑產生明顯影響(見圖3(c))。

圖3 3種編織型食管支架樣品外觀Fig.3 Appearance of three braided esophageal stents samples

一體化食管覆膜支架表面在未清洗、已清洗、載藥和藥物釋放后的掃描電鏡圖如圖4所示。清洗前支架附著有明顯的雜質(見圖4(a))。清洗后的覆膜支架表面清潔、光滑,NiTi合金絲外觀無變化,表面雜質已去除(見圖4(b))。載藥涂層支架表面有均勻光滑的載藥涂層(見圖4(c))。藥物釋放試驗后的覆膜支架結構仍然保持原樣,但樣品表面載藥涂層可見明顯脫落(見圖4(d))。

圖4 一體化食管覆膜支架表面的掃描電鏡圖Fig.4 SEM images of integrated esophageal covered stent

2.2 食管覆膜耐疲勞性能測試

4種食管覆膜支架在疲勞測試前后的外觀形態如圖5所示。由圖5可知:疲勞測試前后Y-ES結構無明顯變化;在疲勞測試前,C-ES覆膜均勻,膜結構完整,表面無明顯氣泡;在疲勞測試后,C-ES表面的硅膠覆膜有不同程度褶皺和破損,且受損程度由大到小依次為C30-ES、C50-ES、C60-ES。

圖5 4種食管覆膜支架疲勞測試前后的外觀形態(×100)Fig.5 Appearance of four esophageal covered stents before and after fatigue test(×100)

4種食管覆膜支架疲勞測試前后的徑向支撐力變化如圖6所示。由圖6可以看出:C30-ES、C50-ES和C60-ES徑向支撐力在疲勞測試后顯著變小(p<0.05),而Y-ES的力學性能依然保持穩定。由此表明一體化覆膜支架具有良好的力學性能穩定性,這降低了支架在臨床使用后由于徑向支撐力變化而發生移位的風險[26]。

圖6 4種食管覆膜支架疲勞測試前后的徑向支撐力Fig.6 Radial retention forces of four esophageal covered stents before and after fatigue tests

2.3 載藥覆膜支架的水接觸角

研究[27]表明,植入性材料親水性好意味著較好的生物相容性。比較了不同規格PLGA涂層的覆膜支架表面的親疏水性,結果如圖7所示。由圖7可知,PLGA75/25-RAPA-Y-ES表面表現為疏水性,PLGA50/50-RAPA-Y-ES表面表現為親水性。由此說明PLGA-RAPA涂層的親疏水性與載體PLGA的規格有關。由于GA的親水性比LA好,而PLGA50/50中GA的比例較高,因此其親水性較好。

圖7 不同規格PLGA載藥涂層的水接觸角Fig.7 Water contact angle of the drug coatings with different specifications of PLGA

2.4 體外藥物釋放情況分析

2.4.1 溶液pH值對體外藥物釋放的影響

藥物的擴散、溶解及PLGA的降解受到體液pH值的影響,從而影響藥物的釋放行為。設計了2種不同的pH溶出環境,pH=6.5的PBS溶液模擬食道生理環境,pH=7.4的PBS溶液模擬人體正常體液?；谥暗脑囼灲Y果,藥物釋放試驗選擇PLGA50/50-RAPA-Y-ES為研究對象,在其他條件不變的情況下,兩種PBS溶液對該載藥覆膜支架的藥物累積釋放率的影響如圖8所示。由圖8可知,pH=7.4環境下的藥物累積釋放速率略高于pH=6.5的環境,原因是較低的pH值環境不利于PLGA降解,故低pH值會減緩藥物釋放速率[28]。

圖8 不同pH環境下載藥覆膜支架的藥物釋放曲線Fig.8 Drug release curves of drug-coated stents in different pH environments

2.4.2 PLGA規格對體外藥物釋放的影響

載體PLGA中PL與GA的摩爾比會影響其降解速度及藥物擴散速率。在藥物釋放環境為pH=7.4的PBS溶液中,PLGA75/25-RAPA-Y-ES和PLGA50/50-RAPA-Y-ES的藥物釋放結果如圖9所示。由圖9可知,PLGA50/50-RAPA-Y-ES的藥物累積釋放率顯著高于PLGA75/25-RAPA-Y-ES。造成這一結果的原因有兩方面:一方面,由于GA含量高且親水性好,更容易吸附水分子,藥物擴散更加容易;另一方面,GA含量高、相對分子質量小,載體自身的降解速度快,導致藥物累積釋放率高。

圖9 不同載體規格的載藥覆膜支架藥物釋放曲線Fig.9 Drug release curves of drug-coated eluting stents with different carrier specifications

2.5 藥物釋放動力學分析

本研究的藥物釋放方式主要是通過可降解載體的溶解和藥物的擴散,擴散是藥物釋放的主要形式。相關研究[29]表明,體外藥物釋放動力學有降解型藥物釋放(藥物釋放曲線為線性,釋放速率基本不變)、擴散型藥物釋放(藥物釋放曲線為拋物線,釋放速率逐漸減小)。

本研究制備的2種一體化編織載藥食管覆膜支架與商用雷帕霉素支架的藥物累積釋放率曲線如圖10所示。

圖10 幾種雷帕霉素藥物洗脫支架藥物釋放曲線Fig.10 Drug release curves of several rapamycin drug-eluting stents

其中,BioMine stent[30]所用載體為PLLA(poly(L-lactide)acid)和PLGA,Supralimus stent載體是PVP(polyvinyl pyrrolidone)和PLGA,FireBird stent[31]載體是聚烯烴類聚合物。由圖10可知,5種藥物支架的藥物釋放速率均呈現先快后慢的趨勢。其中,本研究制備的載藥涂層與BioMine stent涂層結構相似,且載體均為可降解聚合物,藥物釋放模式為溶出和溶蝕擴散。本研究制備的2種載藥覆膜支架與商用支架呈現相同的緩釋特性,未見突釋現象。PLGA75/25-RAPA-Y-ES的藥物釋放時間超過42 d,而PLGA50/50-RAPA-Y-ES的藥物釋放有效時長可達30 d以上,兩者的釋藥速率介于3種商用支架之間。體外釋放過程用OriginPro 2021軟件進行模型擬合[32],包括Zero Order、First Order、Higuchi和Ritger-Peppas等4種模型,擬合結果如表1所示。由表1可知,PLGA載雷帕霉素體系的體外藥物釋放行為更接近Higuchi模型,其R2值分別達0.995(PLGA75/25)和0.953(PLGA50/50),擬合度最高。

表1 藥物體外釋放擬合模型Table 1 Fitting models of drug release in vitro

2.6 載藥覆膜體外抑增生性能

為了便于細胞試驗操作,在探究載藥涂層抑制細胞增生性能時,選擇PLGA-RAPA-PET作為研究對象。將成纖維細胞和腫瘤細胞種植到各個樣品上后,通過CCK-8試劑盒對細胞增殖情況進行考察,CCK-8試驗結果如圖11所示。由圖11可知,在整個試驗過程中,A組(PLGA75/25-RAPA-PET)和B組(PLGA50/50-RAPA-PET)的吸光度均比C組(PLGA50/50-PET)和D組(空白組)低,存在顯著性差異。吸光度越大意味著活細胞數量越多,藥物對成纖維細胞和腫瘤細胞的生長都具有顯著抑制作用,且隨著時間的延長,兩組細胞的抑制率都呈增大趨勢。由此可見,細胞增殖抑制率結果如圖12所示。由圖12可知,培養7 d時,A、B組兩種細胞的抑制率均高于88%。進一步通過活/死細胞染色觀察細胞存活情況(見圖13),隨著時間的增加,PLGA75/25-RAPA-PET組和PLGA50/50-RAPA-PET組中死細胞的數量明顯增加。但是,大部分細胞在PLGA50/50-PET表面能夠良好生長,細胞形態正常,說明該樣品的生物相容性良好,細胞能正常增殖分化,但細胞相容性不及空白對照組(培養板)。

圖11 CCK-8試驗結果Fig.11 Results of CCK-8 assay

圖12 細胞增殖抑制率結果Fig.12 Results of proliferation inhibition rate

圖13 活/死細胞染色結果Fig.13 Results of live &dead staining

3 結 語

本研究設計并制備了一種編織型一體化載藥覆膜支架,其管壁平整、直徑穩定。疲勞測試結果表明,與硅膠覆膜支架相比,一體化覆膜支架的覆膜外觀形態未見明顯破損,并且未明顯降低該覆膜支架的徑向支撐性能。以PLGA50/50為藥物載體、雷帕霉素為模型藥物,采用浸漬法構建的藥物涂層均勻穩定。體外藥物釋放符合Higuchi模型,藥物釋放主要依賴擴散效應。藥物釋放曲線與商用雷帕霉素藥物洗脫支架一致,釋藥效果基本可以達到商用水平。體外細胞試驗結果表明,載藥覆膜具有顯著的抑制細胞增殖作用,包括成纖維細胞和腫瘤細胞。由此可知,開發的載藥一體化食管覆膜支架具有雙重預防食管再狹窄的功能,即高強覆膜的屏蔽作用和抑制組織異常增生功能。研究結果可為開發下一代新型食管覆膜支架產品提供新的思路和試驗依據。