腫瘤二代測序生物信息學分析規范化管理江蘇專家共識

江蘇省醫學會病理學分會,江蘇省醫學會檢驗學分會,江蘇省臨床檢驗中心

目前二代測序(next-generation sequencing,NGS)技術已廣泛應用于腫瘤精準醫療領域。生物信息學分析是NGS檢測過程中至關重要的環節,它能將臨床樣本經過實驗處理及測序后產生的大量序列數據破解為可靠的變異信息,幫助臨床全方位找尋致病根源,為疾病的篩查、診斷以及治療策略的制定提供重要依據。生物信息學分析流程主要通過計算機編程語言將不同的生物信息學分析軟件及數據庫按流程封裝的方式實現自動化的標準輸入和輸出,然后通過高性能服務器完成從原始測序數據到變異結果的檢測與注釋;整個過程包括數據清洗、數據比對、比對后數據預處理、變異識別、變異過濾和變異結果報告,以及必要的質量控制點對全過程進行監測從而保證分析結果的準確可靠。傳統分子檢測技術如常規PCR等,通常是對已知或有限信息的確認,而基于生物信息學分析的測序技術則更多的是對未知結果的探尋和發現,因此如何選擇軟件及其參數以及數據庫信息進行多種變異的檢出和注釋,如何規范生物信息學分析流程的性能驗證,如何建立NGS數據分析的質量控制體系以保證檢測結果的準確性等,都是目前NGS實驗室面臨的巨大挑戰。為此,江蘇省醫學會病理學分會、江蘇省醫學會檢驗學分會和江蘇省臨床檢驗中心組織省內病理學及分子生物學領域的相關專家共同制定本共識,對人員要求、測序數據要求、生物信息學分析平臺的基本要求、生物信息學數據庫以及生物信息學分析的基本流程及其性能驗證和質量控制等方面提出規范化管理的要求。本共識以腫瘤實體瘤體細胞突變NGS生物信息學分析為主線,覆蓋胚系突變和血液系統腫瘤方面的關鍵要素。

1 生物信息學分析人員的要求

共識1:腫瘤NGS生物信息學分析人員可來自生物信息學、計算機科學、基礎醫學、臨床醫學等多個專業,應掌握生物信息學專業知識、數據分析常用工具和編程語言,能夠建立、有效運行和評估優化生物信息學分析流程,具備數據分析、處理及質量評估的能力,并定期參加臨床實驗室基本知識培訓和考核,包括實驗原理和操作流程、實驗室安全、醫學倫理、人類遺傳資源管理和信息安全等內容,通過相應的崗位能力評估及授權后方可上崗。

2 測序數據的基本要求

目前主流的二代測序儀按其原理和來源主要分為3類:基于可逆末端終止法和邊合成邊測序技術的Illumina測序儀、基于半導體測序技術的Ion Torrent測序儀和基于聯合探針錨定聚合技術的MGI測序儀。實驗室應優選經過中國國家藥品監督管理局(National Medical Products Administration, NMPA)注冊、用途寬廣、性能穩定、操作簡便的二代測序儀,同時考慮儀器的性能指標、技術參數、臨床用途、運行成本等是否能夠滿足實驗室目前的臨床實際應用和未來發展需求[1]。

2.1下機數據的質量控制 測序儀原始的下機數據稱為原始數據(raw data),在對原始數據分析之前需要進行質量控制。主要流程為通過測序儀配套的質控軟件設置相應的質控指標對原始數據進行質量評估,質控合格后才能進入生物信息學分析流程;否則,應查找原因并及時糾正,必要時重新進行濕實驗。

共識2:實驗室應明確所用測序儀的原始下機數據的質控指標。核心質控指標為測序下機數據量和原始測序數據Q30,還可包括其他指標如簇密度和簇通過率等。質控合格標準應在檢測方法建立時確定,至少滿足測序儀說明書最低要求,其中測序下機數據量和Q30作為變異檢測的重要指標,通常要求有效下機數據比例不低于80%、Q30不低于80%。

2.2數據拆分 數據拆分是利用樣本標簽信息(barcode/index)將測序儀原始下機數據拆分為單個樣本下機數據的過程。數據拆分軟件應與測序平臺相互匹配,可設置測序儀自動拆分或測序完成后生物信息學分析流程的拆分。數據拆分的關鍵參數是最大允許的標簽堿基錯配個數,該閾值應小于所有標簽間的最小漢明距離?；旌蠝y序時建議使用雙端唯一標簽標記,避免因標簽跳躍造成樣本間的交叉污染。

共識3:實驗室應根據實驗方案設計,確定樣本與標簽序列的對應關系以及允許的標簽堿基錯配個數,以保證數據拆分的準確性。通常情況下,標簽堿基錯配個數應設置為0或1。

3 生物信息學分析平臺的基本要求

3.1計算機與服務器的搭建 NGS數據分析需要配備高性能處理速度的計算機服務器,其核心組件包括處理器、內存、存儲設備和網絡部件。實驗室應根據樣本規模、樣本周轉時間、不同檢測產品的數據量大小、測序儀通量以及生物信息學分析流程所需計算資源等進行服務器配置,同時還需考慮未來需求增加的可能,定期升級維護以確保數據分析的穩定性。

3.2操作系統與分析軟件 NGS生物信息學分析軟件及其運行環境主要基于Linux操作系統,常用的分析軟件主要包括數據質控軟件、序列比對軟件、SAM/BAM文件處理軟件、變異識別和注釋軟件等。在生物信息學分析軟件及數據分析流程應用于臨床檢測前應對其進行性能評估,驗證分析結果能否達到預期目的。

3.3數據的存儲與安全

共識4:實驗室應建立NGS全流程的數據存儲管理規范,包括文件類型、存儲格式、存儲時限、存儲位置和環境、存儲清理和轉存、備份周期等,確保數據信息的便捷使用、安全管理與可追溯性。數據的安全管理應嚴格遵循《中華人民共和國人類遺傳資源管理條例》和GB/T 39725—2020《信息安全技術健康醫療數據安全指南》,確保數據的訪問、傳輸、使用和公開等過程處于有效保護和合法利用的狀態。

4 生物信息學數據庫

NGS相關的生物信息學數據庫可根據生物信息學分析流程分為序列比對數據庫、突變過濾數據庫、突變注釋與解讀數據庫等,或者根據數據庫功能分為群體數據庫、疾病相關數據庫、臨床試驗數據庫、藥物數據庫等(表1)[2]。實驗室應根據臨床實際應用的需求和檢索目的,綜合NGS各流程所需要的數據信息,選擇使用合適的公共數據庫或自建數據庫,并對運行中的數據庫進行評估和驗證。建議數據庫保持至少半年更新一次,保存更新記錄以及驗證過程與結果的記錄。

表1 腫瘤NGS常用生物信息學數據庫

5 生物信息學分析的基本流程

共識5:實驗室應建立、優化、評估生物信息學分析流程并文件化(圖1)。整個流程需要以全自動化的方式進行搭建,完成從拆分測序數據到各個模塊自動分析、質控、樣本異常監控、結果流轉的過程,且每個數據分析模塊均應有對應的質控監測方法及標準的輸入和輸出文件,應通過性能驗證確認預先設定好的每個分析參數及相關質控閾值。

注:Q30,堿基質量值(pherd quality score,Q)大于30的比例;SNV,單核苷酸變異(single nucleotide variation);Indel,短片段插入或缺失;CNV,拷貝數變異(copy number variation);Fusion/Rearrangement,融合/重排;MSI,微衛星不穩定(microsatellite instability)。圖1 腫瘤NGS生物信息學分析的基本流程(虛線框內)

5.1數據清洗

共識6:經過數據拆分后,不同測序平臺的數據均統一為fastq格式,堿基質量值的含義互通,質控指標可共用。為了確保進入生物信息學分析的數據的質量,應對拆分后的數據進行清洗,去除接頭序列、低質量序列、低復雜度序列、過短序列等,清洗后得到的數據通過質控后才能進入后續分析。

常用的NGS數據清洗軟件有fastp、AdapterRemoval、Trimmomatic和Cutadapt等[3]。不同的數據清洗步驟及軟件可能會對后續的數據分析結果產生不同的影響,因此,在進行數據清洗時,應根據具體實驗設計和數據質量要求進行調整和優化,以確保最終分析結果的準確性。

5.2數據比對及比對后數據預處理

共識7:根據樣本類型(DNA/RNA)使用符合行業標準推薦的軟件及其參數進行數據比對。參考基因組推薦采用1000G(phase 2)使用的人類參考基因組序列hs37d5。比對率作為評估樣本比對效果的重要指標應納入質控。

常用DNA比對軟件包括BWA、Sentieon和Bowtie2等,RNA比對軟件包括STAR、Tophat等[3]。軟件參數的選擇可參考開源社區、文獻專利中公認或主要使用的方法。在進行數據比對時,需根據分析目的對比對工具和參數設置進行調整并進行多次比較和優化,以保證下游分析結果的準確性[4]。

共識8:預處理方式應根據測序文庫制備的方法以及比對和變異識別適用的軟件來確定,通常包括PCR重復產物的過濾、復雜區域重比對、堿基質量值矯正等。預處理生成的數據通過質控后才能進入后續分析。實驗室對于已經生成報告的樣本,其比對結果應采用BAM文件格式存儲至少2年。

常用的BAM文件排序、去重工具包括Picard、sambamba和SAMtools等,復雜區域重比對和堿基質量值矯正通?？刹捎肎ATK軟件的IndelRealigner和BQSR模塊實現[3-4]。使用特異性分子標簽(unique molecular index,UMI)標記DNA片段,在比對后進行PCR去重分析,可有效排除DNA單鏈損傷、PCR擴增錯誤、測序錯誤等環節引入的假突變;通過UMI去重可獲得原始DNA分子的一致序列,常用公共軟件包括Fgbio、Gencore和smCounter2等[5]。復雜區域重比對,可減少基因組復雜區域比對的偏差,保證Indel檢出的準確性。此外,測序儀報告的堿基質量值會因測序系統誤差表現不精確,從而影響變異檢測的可信度,實驗室應結合所使用的變異檢測軟件及所檢測的變異類型進行堿基質量值矯正[1]。

5.3變異識別 生物信息檢出變異指的是與參考基因組序列不同的位點,包括單核苷酸變異(SNV)、短片段插入或缺失(Indel)、拷貝數變異(CNV)、融合/重排(Fusion/Rearrangement)、微衛星不穩定(MSI)等。不同的變異類型需使用不同的軟件相互配合才能準確地識別出所有變異。同時,實驗室應基于NGS檢測系統的性能驗證結果,確定各種變異類型檢測對樣本質量(如腫瘤細胞占比、樣本均一性等)的最低要求。

5.3.1SNV、Indel檢出

共識9:SNV、Indel的檢出與軟件算法以及參數設置有關,對變異檢出有影響的參數均應納入性能驗證范圍。

由于外周血cfDNA(circulating free DNA)的濃度低,通常需要提高樣本的測序深度來獲得更高靈敏度。通過UMI分子標簽、對照樣本和健康人群基線可以減少實驗噪音對低頻突變位點的影響。此外,還需要識別來源于克隆性造血的突變,可采用高深度的對照樣本對其進行判定。

5.3.2CNV檢出

共識10:CNV檢測的結果應與熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)結果進行一致性比較,并以GCN(基因拷貝數)的方式進行報告。

CNV分析軟件包括CNVkit、DECoN、CONTRA、CNVnator和XHMM等[7]。CNV通過評估腫瘤樣本相對于對照樣本或基線樣本的深度變化計算獲得[8],可以CNV(擴增倍數)、CN(拷貝數)或GCN(基因拷貝數)三種方式報告檢測結果。腫瘤占比或樣本均一性不合格的樣本不建議做CNV檢測;如果評估腫瘤樣本占比存在不足,且臨床難以再獲取滿意樣本(二次活檢或腫瘤脫落細胞)時,實驗室可在知情同意后通過生物信息算法模擬評估檢測樣本中腫瘤占比,輔助CNV的檢測。

5.3.3Fusion/Rearrangement檢出

共識11:Fusion/Rearrangement的檢測準確性與基因結構的復雜性有關,對于基因斷裂點處于低復雜度或者重復區域的融合需要進行嚴格的過濾及IGV(integrative genomics viewer,交互式基因組瀏覽器)審核。RNA融合檢測需要區分選擇性剪切的不同形式以及低表達基因的融合。DNA融合檢測與RNA融合檢測具有各自的局限性,實驗室可采用DNA+RNA組合檢測方式互相彌補不足以提高檢測準確性。

常用的DNA結構變異(structural variation, SV)分析軟件包括Lumpy、CREST和Delly等[9],RNA融合分析軟件包括STAR-fusion、Arriba、Fumap和FusionCatcher等[10-12]。

(2)能源礦產與黑色金屬礦產從業人員居多。2017年河北省持證礦山企業能源礦產從業人員較多，為11.71萬人，占礦山企業從業人員總數的62.26%，其中煤礦10.75萬人，占能源礦產從業人員總量的91.80%；其次是黑色金屬礦產從業人員4.35萬人，占礦山企業從業人員總量的23.13%。其中鐵礦企業從業人員4.34萬人，占黑色金屬礦產從業人員總數的99.97%。

5.3.4MSI檢出

共識12:MSI可以使用配對樣本或人群基線進行分析;對于使用基線的MSI分析,閾值需要根據不同的測序平臺進行驗證。MSI的探針設計應采取雙端設計。生物信息學分析產生的MSI結果應采用多重熒光PCR毛細管電泳法和/或免疫組織化學(immunohistochemistry,IHC)法進行驗證。

常用的MSI分析軟件包括MSIsensor、mSINGs和MANTIS等[13]。如無對照樣本同步分析,則需基于微衛星穩定(Microsatellite stable,MSS)的樣本構建參考基線,通過評估腫瘤樣本與基線的差異位點來計算MSI?；€會受到所用測序平臺以及實驗批次的影響,因此基線和閾值均需基于實驗室已確認的檢測系統及其實驗流程進行驗證。不同類型的MSI位點和數量會直接影響MSI檢測的性能,可在全基因組范圍內篩選足夠數目且具有明確分類效果的MSI位點。

5.4變異過濾 由于實驗與測序過程以及軟件算法中可能存在的系統誤差,通過生物信息學分析初步識別出的變異通常會包含一些假陽性位點,因此在變異識別后需要對其進行進一步的過濾,除去假陽性,提高檢測準確度。實驗室應基于內部建立的且經性能驗證確認的相應質控標準進行變異過濾。

5.5變異的注釋

5.5.1變異命名的標準化 在完成變異識別和過濾后,需對所識別出的SNV、Indel位點進行HGVS(Human Genome Variation Society,人類基因組變異協會)格式轉換。實驗室需在指定基因組注釋體系下進行轉換以得到cHGVS以及pHGVS信息。建議從LRG、RefSeq以及HGNC數據庫中獲得參考轉錄本的編號,同一個突變注釋到多個轉錄本時應優先選擇經典轉錄本;否則,建議選擇非經典轉錄本上的影響等級最高或文獻使用最頻繁的轉錄本[14]。

5.5.2變異基因功能的注釋 針對腫瘤體細胞變異,實驗室應先進行變異注釋,再對變異進行致癌性評級,最終明確變異的臨床意義(如療效預測或預后判斷等)[15];對于胚系變異,應先按照ACMG遺傳變異分類標準或單個基因(如TP53、CDH1等)胚系變異分類標準進行致病性評級,再明確變異的臨床意義。常見的人群、基因功能、癌癥和藥物相關數據庫注釋見表1。

5.6生物信息分析軟件版本控制

共識13:實驗室應建立完善的生物信息分析軟件版本控制方案,確保始終使用現行有效的版本進行結果分析;當版本更新時應重新進行性能驗證,同時應保存所有與生物信息分析軟件版本的使用、更新和驗證有關的記錄。

生物信息分析軟件發生變更時,包括參數調整或版本升級等,應建立測試數據集并使用變更前和變更后的版本分別進行測試,檢查運行結果是否存在差異以及差異是否符合預期要求,任何可能影響到準確性的更新都應完成生物信息學分析流程的測試及驗證。

6 生物信息學分析流程的性能驗證

生物信息學分析流程的性能驗證指的是實驗室在完成“濕實驗”性能驗證后,利用內部建立的生物信息學分析流程對已知變異的樣本數據進行分析,驗證在已建立的質量控制標準下的分析結果是否能滿足預期性能指標的要求(如正確度、精密度和檢測限等)[1,14];如未能滿足,則需要查找原因,進一步優化分析流程,再次進行驗證,直到滿足為止;其最終目的是確保檢測范圍內所有變異能夠準確檢出。

6.1性能驗證指標

共識14:性能驗證指標應包括但不限于正確度、精密度(重復性和重現性)、分析敏感性(檢測限)、分析特異性(干擾)、臨床敏感性(基因區域和變異檢測范圍)、臨床特異性(交叉反應)等內容,經分析和驗證后應確保該生物信息學分析流程所有使用軟件分析得到的結果能滿足相應臨床檢測的預期用途,并確定所有變異類型和影響臨床診療決策的重要基因的分析參數及檢測范圍。

6.2性能驗證樣本 性能驗證樣本可使用已知變異的臨床樣本測序數據、參考品測序數據和模擬數據,三類數據樣本各有優缺點,可互為補充[1]。

臨床樣本的樣本類型應與常規檢測樣本一致,且應盡量包含所有預期可檢測到的變異類型及頻率,所有變異的陰陽性狀態均需已知且準確。參考品的樣本類型宜盡量模擬臨床樣本真實情況;實驗室可按照特定的突變類型、突變頻率、突變數目進行陽性參考品、陰性參考品、不同組織類型以及不同實驗參數的樣本配置,原則上是能夠全面地對生物信息學分析流程的各方面進行準確的性能驗證。模擬數據包括從頭模擬和測序數據編輯兩種方法,后者更適合生物信息學分析流程的性能驗證。模擬軟件包括BAMSurgeon[16]、Mutationmaker[17]和VarBen[18],其中VarBen包含突變類型最多,包括SNV、Indel、Complex Indel、CNV和SV等。模擬數據的驗證可進行閾值的調整以及多個算法模型的優化和選擇,通過不同比例的陽性樣本進行ROC曲線以及F1值[19]綜合評估,選擇最佳參數閾值。模擬數據可以幫助軟件實現功能驗證,但因其難以復現真實樣本分析中的隨機誤差和系統誤差,無法完全取代臨床樣本/參考品的真實測序結果。

7 生物信息學分析過程的質量控制

7.1分析流程的質量控制

共識15:實驗室應針對生物信息學分析各環節設置相應質量指標進行質控,對于“失控”的異常數據或結果應查找原因并建立明確的異常處理方案。

在建立生物信息學分析流程的過程中,應針對每個環節設定必要的質量指標及其控制標準(圖1和表2)。目前對于不同檢測產品或測序分析系統尚無統一化標準,實驗室應基于檢測方法的特點及臨床預期用途針對這些質量指標建立自己的控制范圍或閾值并開展定期評估。各環節的質量指標包括:(1)數據清洗:測序數據量、Clean reads Q30、有效序列占比、有效序列長度、接頭污染率、GC含量和堿基平衡;(2)數據比對及比對后數據預處理:比對率、中靶率、重復率、插入片段長度、有效測序深度、覆蓋均一性、樣本污染率和樣本損傷;(3)變異過濾:SNV和Indel(位點有效深度、支持變異reads數、突變堿基質量Q30、突變等位基因頻率、堿基比對質量值、鏈偏好性、DNA損傷和氧化損傷等);CNV(樣本覆蓋均一性和樣本質量等);融合/重排[位點深度、SR(split reads,即覆蓋了融合斷裂點的reads)支持reads數目、堿基比對質量值等];MSI(MSI合格的位點數、MSI不穩定的位點數和MSI不穩定的得分等)。其中最重要質量指標為Clean reads Q30、比對率、有效測序深度和覆蓋均一性[1,14]。各指標的閾值設置應通過性能驗證進行確認。

表2 腫瘤NGS生物信息學分析流程中涉及的質量指標及控制標準

7.2樣本污染質控 樣本污染包括非人源的外源物種污染和實驗室樣本交叉污染。通過計算不同物種對于樣本的污染比例,防止非人源物種、病毒和細菌等外源物種污染。對于實驗室樣本交叉污染,可通過比較配對樣本胚系位點的基因頻率偏移來計算污染比例,常用的腫瘤樣本污染分析軟件有GATK ContEst、VerifyBamID和Conpair等[20]。對于樣本污染比例超過實驗室設置標準的樣本,建議重新實驗或重新采樣。

7.3配對樣本胚系及性別質控 配對樣本胚系及性別質控用于判斷已建流程所分析的數據是否與送檢樣本保持一致。胚系一致性主要采用對照樣本與腫瘤樣本胚系位點的一致性進行判定,性別預測則一般采用性染色體上STR(short tandem repeats,短串聯重復)區域測序覆蓋度的差異進行判定。對于胚系不合格的樣本需要進行臨床病理核查,比如患者近期是否存在輸血、異基因造血干細胞移植、器官移植等可能產生胚系不一致的因素,如果不是可以解釋的原因,則需要重新實驗或者重新采樣。

7.4結果質控

共識16:生物信息學分析流程應具備標準的輸入和輸出,其中輸出的結果文件至少應包含樣本的唯一性標識以及突變的基本信息。生物信息分析結果的比較需要在相同的實驗、相同的流程或者檢測限下才具有可比性。在臨床上不能僅依賴生物信息的變異檢出作為最終的結果,尤其是結果處于質量指標的灰區范圍時,應采取其他方式或方法學進行驗證。

各種變異類型在輸出結果時至少應包含的信息:(1)SNV、Indel:染色體、物理位置、參考序列堿基、突變堿基、突變頻率、支持突變的Reads數、基因名、轉錄本號和基因區間,以及其他的功能性注釋以及人群數據庫注釋。陽性判斷閾值可結合突變頻率和支持突變的reads數目進行判定,對于血液腫瘤微小殘留病(MRD)監測樣本的變異,還需要結合初診的變異信息來進行判定;(2)CNV:染色體、起始物理位置、染色體臂、基因名、log2比值、基因拷貝數。在腫瘤占比以及樣本均一性合格的情況下,可通過基因拷貝數或腫瘤細胞的拷貝數劃定基因擴增/缺失的閾值,對于染色體倍增產生的CNV需進行區分和標記;(3)Fusion/Rearrangement:基因名、轉錄本號、外顯子號、斷裂點位置、斷裂點有效深度、SR支持reads數目、DP(discordant paired-end reads,即非一致成對讀序,成對的reads分別比對到融合的5′伴侶基因和3′伴侶基因)支持reads數目和突變頻率。對于RNA融合基因檢測,需要在管家基因表達合格的前提下進行陽性閾值的判定和計算融合的相對表達量,通常以突變頻率以及SR支持reads數劃定陽性判斷閾值;(4)MSI:MSI位點合格數、MSI不穩定的位點數量、MSI得分(MSI score)和MSI狀態(MSI-H或者MSS)。在樣本質控合格的情況下,可通過MSI得分進行MSI狀態的閾值判定,否則,則不能進行該位點MSI的判定。

執筆：陳劼、楊軍、朱衛東、丁穎、解珺丹、張騰騰

整合和審修：趙建華、何軍、章宜芬

倡議和終審：許斌

參與本共識修訂的人員及單位(按姓氏漢語拼音順序排列)：常志力(南京世和基因生物技術股份有限公司)、陳劼(江蘇省中醫院)、楚玉星(蘇州吉因加生物醫學工程有限公司)、鄧望龍(江蘇先聲診斷醫學有限公司)、丁穎(江蘇省人民醫院)、郭凌川(蘇州大學附屬第一醫院)、何軍(蘇州大學附屬第一醫院)、孔令印(蘇州貝康醫療股份有限公司)、解珺丹(蘇州大學附屬第一醫院)、劉雅紅(江蘇省臨床檢驗中心)、饒秋(中國人民解放軍東部戰區總醫院)、汪俊軍(中國人民解放軍東部戰區總醫院)、夏艷(臻和精準醫學檢驗實驗室無錫有限公司)、楊軍(南京鼓樓醫院)、章宜芬(江蘇省中醫院)、張騰騰(蘇州大學附屬第一醫院)、趙建華(江蘇省臨床檢驗中心)、朱衛東(蘇州大學附屬第一醫院)。