1例無創產前檢測提示13-三體綜合征與21-三體綜合征同時高風險胎兒的產前診斷

張穎,王皖駿,段紅蕾,李潔(南京大學醫學院附屬鼓樓醫院產前診斷中心,南京 210008)

無創產前檢測(noninvasive prenatal testing,NIPT)是通過提取孕婦外周血中胎兒游離DNA,對其進行測序及生物信息學分析,最終實現對胎兒染色體非整倍體患病風險進行評估[1-2]。NIPT因其敏感性高、特異性高、無創等優點已在臨床上廣泛應用。近年隨著測序深度的增加及生物信息學算法的優化,NIPT不僅實現了對胎兒常見染色體非整倍體(21、18 和13號染色體)的篩查,還被擴展到其他染色體非整倍體及染色體微缺失/重復綜合征(microdeletion/microduplication syndrome,MMS)的篩查[3],即擴展性NIPT。本研究對1例無創產前檢測提示13-三體綜合征、21-三體綜合征同時高風險的孕婦進行產前診斷及家系分析,為臨床遺傳咨詢提供參考。

1 對象與方法

1.1研究對象 孕婦,23歲,孕1產0,自然妊娠孕17周,單胎,早孕超聲顯示胎兒頸項透明層厚度(nuchal translucency,NT)2.4 mm。孕婦門診自愿要求進行NIPT以評估胎兒常見染色體病患病風險,并簽署知情同意書。NIPT報告提示13-三體綜合征、21-三體綜合征同時高風險,經遺傳門診咨詢后,行羊水穿刺進行胎兒染色體微陣列分析,孕婦及其丈夫同時采集外周血進行染色體核型分析。本研究通過南京鼓樓醫院倫理委員會批準(批準文號:2022-120-02)。

1.2主要儀器與試劑 高速冷凍離心機(美國ThermoFisher公司),Qubit 2.0核酸定量儀(美國ThermoFisher Scientific公司),熒光定量PCR儀(美國ABI STEPONE PLUS公司),NextSeq CN500基因測序儀(美國Illumina公司),分析軟件為ChAS4.0 GLS-120全自動染色體核型分析系統(德國Leica公司),GE Voluson E10彩色多普勒超聲診斷儀(美國GE公司),配備腹部凸陣探頭(3～5 MHz)。

血漿游離DNA提取試劑盒,胎兒染色體非整倍體檢測試劑盒,測序反應通用試劑盒均購自杭州貝瑞公司。CMA芯片AITymetrixCytoScan750K(美國ThermoFisher公司),外周血染色體培養基、羊水染色體培養基(廣州白云山公司)。

1.3方法

1.3.1NIPT及擴展性NIPT 使用EDTA-K2抗凝管采集孕婦外周血10 mL,4 h內冷凍離心機1 600 r/min 10 min、普通離心16 000 r/min 10 min后分離血漿,保存于-20 ℃。提取血漿游離DNA,并且對提取的血漿游離DNA濃度進行檢測。文庫構建和純化后,利用熒光定量PCR儀進行文庫定量。采用基礎性、擴展性NIPT樣本混合上機測序方式,擴展性NIPT樣本的DNA文庫上機量為普通NIPT的5倍。使用NextSeq CN500 測序儀及配套試劑盒進行DNA測序[4]。

1.3.2羊水染色體微陣列分析(chromosomal microarray analysis, CMA) 知情同意后,由婦產科醫生于孕17周在超聲引導下行羊膜腔穿刺術,采集羊水10 mL?；蚪MDNA提取、CMA實驗及分析、驗證流程按本中心常規操作流程進行[5]?？截悢底儺?copynumbervariariations,CNVs)的性質主要依據ClinGen2019年頒布的指南,報告原則為:(1)在具有重要臨床意義的區域,DNA拷貝缺失>100 kb;(2)在已知具有重要臨床意義的區域外,連續DNA拷貝缺失達 500 kb以上或連續拷貝重復達1 Mb以上(在這些區域內的探針密度達到每100 kb具有20個以上探針,同時存在1個在線人類孟德爾遺傳基因)。

1.3.3外周血染色體核型分析 使用肝素鈉抗凝管采集外周血3 mL,采用常規方法細胞培養、收獲、制片、G顯帶,染色體分辨率為450～550條帶,每份標本計數20～50個中期分裂相,分析3～5個核型,按人類染色體國際命名系統(ISCN 2016) 描述核型。

1.3.4NIPT質量控制管理及結果判斷判斷標準[6]胎兒游離DNA比例>3%,下機數據Q30≥85%,36.5%1.5 Mb,擴展性 NIPT 單個樣本唯一比對序列數據量>10 Mb,為質控合格。Z>3為重復或三體型高風險,Z<-3為缺失或單體型高風險。CNVs拷貝數>2.4判斷為母源性重復,拷貝數<1.6判斷為母源性缺失。

2 結果

2.1NIPT結果 胎兒游離DNA濃度(cell-free fetal DNA,ffDNA)19.5%,有效數據量為2.4 Mb,室內質控Q30顯示93.8%,GC含量為40.07%,結果提示13-三體綜合征和21-三體綜合征同時高風險,分別為(Z13:8.62)(Z21:6.48),考慮到21-三體綜合征、13-三體綜合征同時發生的可能性較低,采用擴展性NIPT對剩余血漿樣本進行了復檢。擴展性NIPT結果顯示,胎兒游離DNA濃度為18.5%,有效數據量為11 Mb,約為普通NIPT的5倍,室內質控Q30顯示94.8%,GC含量39.69%,結果提示該病例同時為13號染色體部分三體及21號染色體部分三體同時高風險,分別為(Z13:8.98)(Z21:4.78),具體重復片段位置為13q14.2-q34,21q11.2-21.3。見圖1、2。

注:數據量明顯升高,Z值大于3提示有重復。圖1 擴展性NIPT 21號染色體數據結果

注:數據量明顯升高,Z值大于3提示有重復。圖2 擴展性NIPT 13號染色體數據結果

2.2胎兒羊水染色體微陣列結果 羊水染色體微陣列結果提示13號染色體和21號染色體重復,具體為13q14.2q34(50646848-114342258)×363.7 Mb,21q11.2q21.3(13644166-26035771)×312.4 Mb,結果和NIPT及擴展性NIPT結果顯示一致。

2.3胎兒父母外周血染色體結果 經外周血染色體核型細胞培養后,G顯帶顯示胎兒父親外周血染色體核型為46,XY,胎兒母親外周血染色體核型顯示46,t(13,21)(q14.3, q11.2),為染色體平衡易位攜帶者。見圖3。

注:紅框顯示胎兒母親發生易位的片段。圖3 胎兒羊水CMA結果及胎兒母親外周血染色體核型

3 討論

NIPT以檢測21-三體綜合征、18-三體綜合征及13-三體綜合征等疾病為主要目標,具有99%的特異性和敏感性[7],盡管如此,母體染色體異常、限制性胎盤嵌合體、胎兒游離DNA 濃度過低、多胎妊娠等均可能影響NIPT的結果,產生假陰性和假陽性[8]。擴展性NIPT是通過加深測序深度并提高生物學信息算法增加了檢測范圍,使得CNV的檢出率明顯提高。Liang 等[9]2019年用擴展性NIPT對 94 085例單胎妊娠婦女的外周血樣進行非整倍體和全基因組MMS篩查,結果顯示對二者均取得了較高的陽性預測值。

本文中孕婦無創產前檢測結果顯示13號染色體和21號染色體Z值同時大于3,考慮到胎兒同時為21-三體綜合征和13-三體綜合征的風險較為罕見,我實驗室利用剩余血漿樣本進行了擴展性NIPT的檢測,結果提示胎兒為13號染色體部分三體及21號染色體部分三體高風險。充分告知孕婦及家屬后,該病例接受了介入性產前診斷,羊水染色體微陣列檢測結果提示13q14.2q34(50646848-114342258)×363.7 Mb,21q11.2q21.3(13644166-26035771)×312.4 Mb ,重復片段大小和位置與NIPT及擴展性NIPT結果一致。胎兒同時存在21、13部分三體,提示父母存在平衡易位攜帶者可能。通過夫妻外周血染色體檢測,結果顯示孕婦本人為21、13號染色體平衡易位攜帶者。

大量研究證實,三體中額外的1條染色體 90% 來源于母親,多是由于卵母細胞在第1次減數分裂時發生錯誤而形成[10]。由于孕婦為非同源染色體相互易位攜帶者,不會引起明顯遺傳效應,故表型正常,但由于存在13號和21號染色體的易位,在減數分裂中,根據不同的分離方式可形成18種類型的配子,與正常的精子結合形成18種合子,其中1/18為正常者,1/18為平衡易位攜帶者,其余16/18均為部分三體、部分單體或單體、單體合并三體型患者,導致流產、畸胎、死胎及異常染色體患兒的出生。染色體平衡易位攜帶者生育時可選擇輔助生殖技術進行植入前診斷或自然受孕后在孕期行產前診斷,降低生育患兒風險。

對于普通NIPT有特殊提示或者罕見提示的樣本,擴展性NIPT在染色體片段重復/缺失的檢測上提供更多的遺傳變異信息;但是對于NIPT有特殊提示的孕婦應進行產前診斷進一步明確遺傳學病因,對于有需要的病例可進行家系分析,有利于后續遺傳咨詢及產前診斷的開展。