多參數流式細胞術在漿細胞疾病中的臨床應用*

楊柯,趙強,蔡永剛,藺莉(甘肅省中心醫院血液內科,蘭州 730050)

漿細胞(plasma cell,PC)疾病是一組以血清或尿中檢出單克隆副蛋白和/或在骨髓(bone marrow,BM)中存在單克隆漿細胞為特征的異質性血液疾病,主要包括多發性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)、意義未明單克隆免疫球蛋白增多癥(monoclonal gammopathy of unknown significance,MGUS)、漿細胞白血病(plasma cell leukemia,PCL)、輕鏈淀粉樣變性(amyloidosis,AL)、淋巴漿細胞性淋巴瘤(lymphoplasmic cell lymphoma,LPL)/Waldenstr?m巨球蛋白血癥(WM)、POEMS綜合征和孤立性漿細胞瘤(solitary plasmacytoma,SP)等[1]。雖然MM仍被定義為不可治愈,但隨著蛋白酶體抑制劑和免疫調節劑等新藥的出現,MM的治療前景發生了根本性改變,因此,創新的高靈敏度微小殘留病/可測量到的殘留病(minimal/measurable residual disease,MRD)檢測方法變得越來越重要[2]。多參數流式細胞術(multiparameter flow cytometry,MFC)尤其二代流式細胞術(next generation flow cytometry,NGF)在漿細胞疾病的診斷與鑒別診斷、進展風險、預后評估及MRD檢測中具有重要價值。鑒于最近對診斷標準的更新和強調實現疾病嚴格完全緩解的重要性,本文將MFC在漿細胞疾病中的臨床應用作一綜述。

1 MFC在漿細胞疾病中的檢測技術應用

1.1抗體組合及標本要求 歐洲流式聯盟(Euro Flow)推薦NGF抗體組合為2管八色方案,管1為CD38/CD138/CD27/CD45/CD19/CD56/CD81/CD117,管2為CD38/CD138/CD45/CD19/CD56/CyIgκ/CyIgλ,在診斷時最少獲取5×105(50萬)個細胞[3]。NGF進行MRD檢測時需2×107(2 000萬)個細胞,其中1×107(1 000萬)個細胞用于管1表面標記物染色,1×107(1 000萬)個細胞用于管2細胞內標記物和胞質免疫球蛋白輕鏈同時染色。在90%的病例中,需3.6 mL BM抽吸物才能獲得至少2×107個細胞[4]。值得注意的是,BM抽吸物易被外周血稀釋[5],MM病灶的斑片狀分布也可能會產生假陰性結果[6],髂骨第一管抽取樣本用于MFC檢測,可降低樣本稀釋風險[7]。MFC對非漿細胞群體的識別,如CD117+++肥大細胞、有核紅細胞、CD117+髓系前體和CD19+CD45lowCD38+B細胞前體,有利于判斷樣本質量和血液稀釋程度。

1.2分析性能要求 為了克服傳統MFC檢測的局限性,Euro Flow制定了標準化操作程序,以及創新的自動數據分析軟件,靈敏度可達到10-6,并顯示出與NGS良好的一致性(86%)[5]。Euro Flow要求MRD檢測下限(lower limit of detection,LOD)為2×10-6,即10×106個BM細胞中檢出20個克隆性漿細胞,定量下限(lower limit of quantification,LOQ)為5×10-6,即10×106個BM細胞中檢出50個克隆性漿細胞[8]。國際骨髓瘤工作組(the International Myeloma Working Group,IMWG)將MM最低MRD靈敏度定為10-5,雖然NGF和NGS均可達到10-6靈敏度,然而,實現這樣的靈敏度水平在技術上仍具有挑戰性[9]。

2 MFC在漿細胞疾病診斷與鑒別診斷中的臨床應用

2.1克隆性漿細胞和正常漿細胞鑒別的臨床應用 正常漿細胞CD38表達水平高于其他BM中有核細胞亞群,但CD38對漿細胞表達無特異性,MM細胞通常傾向表達較低水平的CD38,因此需使用CD45、CD38、CD138和光散射參數(SSC)組合來識別。大多數正常骨髓漿細胞(BMPCs)的免疫表型為CD38bright/CD19+/CD45dim/CD56-/CD27bright/CD81bright/CD117-,胞質輕鏈(cKappa/cLambda)呈多克隆表達(kappa:lambda比例約為1～4)(圖1)[10]。與正常漿細胞相比,克隆性漿細胞常出現CD19、CD27、CD38、CD45和CD81表達下調以及CD56、CD28、CD5、CD117和CD200過表達[11],除了CD117幾乎不在正常漿細胞上表達外,上面定義的大多數異常表達都可以在正常漿細胞中出現[12]。在克隆性漿細胞上還可觀察到CD13、CD33和黏附分子CD44(以及CD44的變異亞型)、CD49d和CD221異常表達。因此,由MFC識別的克隆性漿細胞應通過多個異常表型的同時存在來確認。

注:正常漿細胞免疫表型為CD45dim/CD38bright/CD138+/CD19+/CD56-/CD81bright/CD117-,胞質輕鏈cKappa、cLambda呈多克隆表達(紅色細胞群);藍色細胞群為CD19+ B淋巴細胞。圖1 正常BM 漿細胞的免疫表型

2.2MGUS、SMM和活動性MM(active multiple myeloma,aMM)中的臨床應用 MFC在漿細胞疾病中最重要的應用是從正常漿細胞中區分克隆性漿細胞,這對于鑒別MGUS、SMM和aMM以及識別反應性漿細胞增多癥、具有廣泛漿細胞分化的B-NHL(如MZL和LPL)和罕見的IgM型MM至關重要。研究表明,正常漿細胞占BM漿細胞比例(nPCs/BMPCs)閾值為3%時有助于區分MGUS和MM,在98%的MGUS中有超過3%的nPCs/BMPCs,而在MM中不到2%[13],與MM相比,MGUS中存在更高比例的nPCs/BMPCs[14]。nPCs/BMPCs閾值為5%時不僅有助于區分MGUS和aMM,還可以提示較高的進展風險[15]。還有研究表明,異常漿細胞占BM漿細胞比例(aPCs/BM)和漿細胞/CD117+前體細胞比值是區分MGUS和MM最有影響力的參數[16]。

CD56、CD20、CD45和CD117等抗原表達模式在MGUS中與MM類似,與MGUS相比,CD200在MM中表達頻率更高[17],CD27在MM中弱表達以及CD19丟失更常見,CD19在MGUS中表達強度低于正常漿細胞,但高于MM[18]。一些研究還發現了免疫表型特征對MM細胞遺傳學異常的預測價值,如CD28表達與t(14;16)和del(17p)相關;CD117表達與t(4;14)、del(13q)和非超二倍體核型相關;CD20和CD23表達與t(11;14)相關等。然而,由于敏感性和特異性不足,這些發現臨床應用依然有限。

2.3孤立性漿細胞瘤中的臨床應用 研究表明,在49%(17/35)的孤立性骨漿細胞瘤(solitary plasmacytoma of bone,SBP)患者和38%(11/29)的髓外漿細胞瘤(extramedullary plasmacytoma,EMP)患者中可檢測到克隆性漿細胞,其中71%的SBP患者最終進展為MM,而未檢出克隆性漿細胞的SBP患者僅為8%(風險比17.4,P<0.001),EMP中沒有觀察到顯著差異[19]。因此,在SBP患者中,基于MFC檢測存在克隆性漿細胞成為定義進展風險最重要的預后標志物。

2.4AL淀粉樣變性中的臨床應用 MFC可用于確認導致淀粉樣蛋白輕鏈沉積的潛在克隆性漿細胞的存在(圖2),這種克隆性漿細胞幾乎存在于所有AL患者中。有研究報道,AL淀粉樣變性患者的漿細胞表型與MM患者相似,基于MPC-1、CD45和CD49e等標記可對漿細胞亞群進一步表征,其中中間型漿細胞(MPC-1+CD45-CD49e-)是AL淀粉樣變患者診斷和隨訪的預后標志物[20]。在35例新診斷的AL患者中研究證實,BM漿細胞比例是一個重要預后因素,BM漿細胞<1%和≥1%組患者2年OS分別為90%和44%。在診斷時,nPCs/BMPCs以5%為閾值可確定一組OS延長的患者亞組,2年OS分別為88%和37%,在這些病例中,49%(17/35)的AL患者在診斷時有>5%的nPCs/BMPCs[21]。

2.5巨球蛋白血癥中的臨床應用 與MM類似,幾乎所有WM患者在出現臨床癥狀之前都經歷了IgM-MGUS和冒煙型WM的良性階段,但區分IgM-MGUS和冒煙型WM尚存在爭議,IgM-MGUS和冒煙型WM的主要區別在于是否有淋巴漿細胞淋巴瘤浸潤BM的形態學證據。目前尚未鑒定出特異性的WM/LPL標志物,從成熟的靜息記憶B細胞持續分化成漿細胞是WM的主要標志(圖3)。最近,B細胞上CD13的表達被提出作為WM標志物,但CD13的表達與漿細胞分化有關,也可在MZL或MM中表達[22]。迄今為止,關于WM/LPL的表型特征尚未達成共識,WM克隆B細胞最常見的免疫表型為:CD19+/CD22low+/CD23-/CD25+/CD27+/SmIgM+,CD79b和CD81在所有病例中呈陽性,CD27(51%)、CD38(50%)和CD200(62%)可觀察到異質性雙峰表達模式,CD305(LAIR1)在正常B細胞上呈雙峰異質表達,但在69%的WM病例中不表達[23]。與大多數其他成熟B細胞腫瘤相比,WM不表達CD5、CD10、CD11c和CD103,但MZL除外。區分WM和MZL最有用的標記是SmIgM和CD79b(兩者都在WM中過表達),CD305在MZL中上調[23]。WM中克隆漿細胞的抗原譜與正常漿細胞更相似,與MM明顯不同,從IgM-MGUS到有癥狀WM患者顯示CD19+/CD20+/CD45+/SmIgM+的BM漿細胞比例逐漸增加,同時CD56完全丟失[23]。漿細胞的不同抗原譜,以及MYD88突變狀態(在IgM-MM中不存在)和t(11;14)(q13;q32)(在IgM-MM中發生率較高)對區分WM和IgM-MM有重要參考價值,可見,MFC是鑒別IgM疾病的有用工具。

注:克隆性漿細胞表型為CD38+/CD138+/CD19+/CD20part+/CD22part++,顯示與克隆B細胞相似的kappa輕鏈限制(藍色細胞群)?？寺⌒訠細胞為CD19+/CD20+/CD22+/CD5-/CD10-/Kappa+(紅色細胞群),患者同時有IgM單克隆蛋白,支持LPL的診斷。圖3 1例具有漿細胞分化的小B細胞NHL

對244例新診斷的IgM單克隆球蛋白患者BM進行MFC分析,包括67例IgM-MGUS,77例冒煙WM和100例有癥狀WM,結果顯示,從IgM-MGUS到冒煙和癥狀性WM,B細胞的比例逐漸增加,BM中B細胞比例>10%和B細胞克隆性程度(100%)對于排除IgM-MGUS具有高度特異性,但仍然沒有一個基于MFC的標準可以完全區分IgM-MGUS和WM,表明該疾病的3個階段之間有大量的重疊,包括遺傳特征[24]。MFC也是一種預測WM患者預后的有價值的工具,冒煙型WM患者BM 中B細胞>10%并表現出完全輕鏈限制性比其他冒煙WM患者進展風險更高,相反,BM中B細胞<10%的癥狀性WM患者其疾病侵襲性較低,OS較好[24]。在42例WM患者中證實,BM中單克隆B細胞>5%可獨立于血液學反應預測較短的無進展生存期(PFS)和總生存期(OS)[25]。

2.6漿細胞白血病中的臨床應用 研究表明,PCL克隆性漿細胞與MM中CD38、CD138、CD2、CD3、CD10、CD13、CD16和CD15等抗原表達模式相似,不同的是,CD20在PCL中高表達,CD56、CD9、CD117和HLA-DR在PCL中低表達,與MM和MUGS相比,PCL中CD40表達降低[26]。CD49和CD56的陰性表達先前已被認為與更具侵襲性的疾病相關,并被認為是PCL可能的標志。CD28和CD27標記可能有助于區分原發性PCL和繼發性PCL,CD28是MM腫瘤演變的標志物,在92%的繼發性PCL病例中可檢測到,而在原發性PCL中僅占33%,相比之下,CD56的表達情況(CD56-/dim)和CD19陰性表達兩者無區別[27]?？傊?與MM相比,PCL患者通常具有獨特的預后特征和更差的預后。

3 MFC在循環漿細胞檢測中的臨床應用

MFC檢測循環漿細胞(circulating plasma cells,CPCs)可能為MM的診斷和預后提供了一種有前途和微創的評估方法[28]。CPCs被認為是一個獨立的預后因素,可有效反映腫瘤負荷,在診斷或誘導治療后,高水平CPCs可以預測高危MM并提示較差的治療反應和不良預后。MFC可在100%的NDMM、59%的MUGS以及18%的SP患者中檢測到CPCs,MGUS、SMM和aMM的CPCs頻率(中位數)分別從0.000 2%(0.008個/μL)增加到0.004%(0.16個/μL)和0.04%(1.9個/μL)[29]。較高數量的CPCs還與MGUS和SMM惡性轉化風險增加相關[30],研究表明,MGUS患者存在≥0.058 CPCs/μL時,可定義為進展高風險組[29]。SMM患者存在CPCs時,中位進展時間僅為10個月,且CPCs在評估腫瘤負荷方面優于BM漿細胞[31]。通過NGF檢測CPCs≥0.02%的SMM患者表現出超高的轉化風險,PFS為11個月,對這些患者進行早期干預已被證明可以顯著降低惡性轉化率[30]。CPCs閾值為2%時可用作識別超高風險的NDMM,同時是一個不良預后因素[32]。對于符合移植的NDMM患者,外周血中CPCs的評價優于BM 漿細胞,是適合移植的NDMM患者診斷時最相關危險因素之一,CPCs≥0.01%可能是新的分期系統中的一個新的危險因素[33]。在接受自體移植的高危MM患者中,自體移植物中CPCs的存在與程度均與較差的PFS和OS相關[34]。此外,CPCs有助于PCL的診斷,還可用于MRD評估,有研究者認為,每個外周血中MRD陽性病例在BM中也可檢測到MRD,提示CPCs可作為BM MRD持續性檢測的替代物,但仍然有很高的假陰性率[35]。CPCs數量的增加會導致腫瘤更快、更廣泛地擴散到整個BM及髓外部位,因此,致力于清除CPCs的新策略可改善患者結局。然而,PCs從BM遷移的原因和機制仍不清楚,最近研究表明,TP53的突變和涉及染色體調控和粘附的途徑可能是CPCs形成的潛在機制[36]。

與BM漿細胞相比,CPCs顯示出更多靜止細胞的特征,對化療藥物具有更強的耐藥性和更高的自我更新潛力,以及更不成熟表型,這表明CPCs可能構成并表現為MM干細胞特性。CTPCs在免疫表型上比BM漿細胞更不成熟,這體現在某些標記物的表達水平顯著降低,如漿細胞在從次級淋巴組織遷移過程中獲得的標記物CD38和CD138,以及將漿細胞錨定在基質結構上的黏附分子CD56、CD117和CD81以及激活/分化相關抗原CD27和Vs38c等,還表達較低水平的增殖相關標記物ki67[37]。

4 MFC在漿細胞疾病轉化風險及預后評估中的臨床應用

MFC可以用于預測MGUS和SMM轉化為aMM的風險,也可以用于確定一小群預后良好的aMM患者即具有MGUS-like特征的患者,還可以提供預后信息,如定性預后參數:CD56、CD117、CD28、CD19、CD81、CD27、CD43等;定量預后參數:漿細胞占BM有核細胞比例(PCs/BM)、異常漿細胞占BM漿細胞比例(aPCs/BMPCs)和CPCs等。

4.1定性預后參數 已有研究試圖根據漿細胞抗原譜對患者進行風險分層,但只有少數抗原被證明具有預后價值。CD56是神經細胞黏附分子(nerve cell adhesion molecule,N-CAM)異構體,已知參與MM細胞和BM基質錨定,CD56陰性表達(<10%)可加速MM細胞的轉移擴散。CD56與MM預后的關系目前存有爭議,研究表明,MM中CD56陽性與更高的溶骨負荷相關,其在克隆性漿細胞上表達是1個不良預后因素[38]。也有研究表明,CD56陰性是不良預后因素,與乳酸脫氫酶(LDH)、β2-微球蛋白水平升高相關,但未影響OS[39]。其他研究表明,CD56陰性可能與髓外受累、漿母細胞形態、PCL、非超二倍體染色體異常以及PFS有關,患者OS更差[40]。還有研究表明,CD56陰性與淀粉樣蛋白顯著相關,同時,淀粉樣蛋白也是1個獨立的不良預后因素[41],預后不良細胞遺傳學IgH/FGFR3易位的發生率在CD56陰性的患者中也更為常見[42]。此外,存在≥2個高危細胞遺傳學的患者中,CD56陰性可進一步識別PFS和OS較差的MM患者[43]。

CD117(原癌基因c-KIT)是一種酪氨酸激酶受體,在70%的MGUS患者和30%的MM患者中表達,疾病復發時常丟失。在MGUS和MM患者中,CD117陽性MM患者有更多的超二倍體核型以及更少的14號染色體易位,總體上預后較好,CD117陰性的患者表現為更高的BM漿細胞浸潤,更多見的腎功能損害、貧血和臨床晚期[44]。CD56和CD117雙陰患者顯示更差的預后。

CD28(T細胞共刺激受體)在約35%的MM病例中表達,對MM 漿細胞具有高度特異性,CD28與疾病進展相關,CD28可能參與BM基質內樹突狀細胞-漿細胞的相互作用,進而支持MM細胞的存活[45]。在新診斷MM(newly diagnosed MM,NDMM)中證實CD19、CD28表達和CD117缺失與顯著較短的PFS和OS相關,并確定了三個獨立的風險組:高風險(CD28+CD117-)、中風險(CD28-CD117-或CD28+CD117+)和低風險(CD28-CD117+)組,還揭示了CD19的不良預后作用[46]。大多數CD19陽性患者不表達CD117,這導致MM患者的預后更差,相比之下,CD20的表達在伴有t(11;14)的NDMM中是1個良好預后因素[47]。

CD19受CD81調控,CD81在45%的MM中表達,克隆性漿細胞中CD81的表達是aMM患者的獨立預后因素,同時也是SMM患者進展風險標志[48]?；贑D19和CD81這兩種抗原提出了一種新的正常漿細胞成熟軸,即漿細胞亞群從CD19+/CD81+到CD19-/CD81+和CD19-/CD81-逐漸分化,MM細胞也符合這種漿細胞分化模式,并在225例NDMM患者中發現,59%存在完全分化(CD19-/CD81-)克隆,38%存在中間分化(CD19-/CD81+)克隆,3%存在低分化(CD19+/CD81+)克隆,分化不良患者預后不佳[49]。

CD27是一種在漿細胞上高表達的腫瘤壞死因子受體,CD27陰性與較低的凋亡率相關,提示NDMM患者預后不良[50],CD27低表達還與高危遺傳學異常相關并可作為MM進展的標志。然而,PCL中顯示CD27高表達,這對地塞米松誘導的細胞凋亡具有保護作用,CD27在MM和PCL的差異表達尚不清楚。CD24同樣是MM進展和生存的預后標志物,CD24表達升高的患者PFS和OS顯著延長,但該研究又證實CD117、CD56和CD45沒有預后價值,CD19的表達與PFS單獨呈負相關,與OS無關[51]。此外,CD43[52]和CD155[53]也是NDMM的獨立不良預后因素。先前有一些研究報道,具有髓系標記物如CD13或CD33表型的MM患者預后較差,但也有研究表明,差異未達到統計學意義[54]。

4.2定量預后參數 PCs/BM和aPCs/BMPCs與MGUS和SMM到MM的進展風險增加相關,已被確定為獨立預后參數。研究表明,aPCs/BMPCs>95%的MGUS患者和SMM患者5年進展為aMM的累積概率顯著高于aPCs/BMPCs<95%的患者[55]。在單因素分析中,診斷時相對較高比例的nPCs/BMPCs(>5%)與更好的PFS和OS相關,同時具有更低的BM侵犯、更高的血紅蛋白水平和較低頻率的免疫麻痹[14]。在322例MGUS患者中研究得出,異常漿細胞(A)與正常漿細胞(N)比值是決定進展為MM的關鍵預后變量,A/N>4患者組5年進展到MM的累積概率顯著高于A/N<4患者組[56]。此外,S期漿細胞比例增加(>2%)與較短的PFS和OS密切相關。還有研究基于aPCs/BMPCs≥95%、DNA非整倍體和免疫麻痹進行多變量分析,aPCs/BMPCs≥95%和DNA非整倍體用于MUGS評估,aPCs/BMPCs≥95%和免疫麻痹用于SMM評估,結果顯示,在MGUS中無、有1個或2個危險因素的患者,從MGUS進展到MM的5年累積概率以及SMM進展為有癥狀性疾病的風險依次遞增[55]?；贛FC定義的DNA和細胞質輕鏈免疫球蛋白(DNA/CIg)指數也是無癥狀克隆性漿細胞疾病進展為MM的主要預后因素,還可以高度預測NDMM的PFS和OS[57]。

5 MFC在漿細胞疾病MRD檢測中的臨床應用

盡管MM患者可實現深度緩解(CR/sCR),但仍有部分患者會經歷疾病復發,MFC能夠準確識別和量化克隆性漿細胞,已成為MRD評估的首選檢測方法之一。持續MFC MRD陰性的MM患者5年PFS和OS分別為81%和94%[58]。在sCR/CR和存在高危細胞遺傳學異常的MM患者中,MFC MRD陽性組PFS明顯低于MRD陰性組[59]。>2年持續CR的MM患者還顯示出治愈或MGUS樣的MRD模式[60],因此,提示MRD陰性可作為生存結果替代終點。

除了在細胞學分析中BM漿細胞百分比與MFC相比有較大差異外,NGF評估MM MRD的另一個主要局限與MM 漿細胞表型的高異質性,以及漿細胞表型根據患者的治療方式發生“轉移”有關[61]。已經廣泛證明,使用免疫調節藥物治療的患者可能會發生漿細胞表型的變化,尤其使用Daretumab(達雷妥尤單抗)的患者。Daretumab(達雷妥尤單抗)是一種抗CD38 IgG1 kappa人單抗,與獨特的CD38表位結合具有高親和力,是復發/難治性疾病MM患者的有效藥物治療[62],CD38是MFC識別漿細胞的關鍵標志物,使用達雷妥尤單抗降低了MRD檢測靈敏度,而CD138雖相對特異但不穩定,易隨細胞老化或樣本儲存從細胞表面脫落。因此,新的標志物,如CD200、CD33、CD54、CD229、CD307、CD319、CD150和VS38,已被提議包含在MFC MRD抗體組合中[37]。CD229不能可靠地精確區分異常漿細胞和正常漿細胞,這限制了其臨床實用性[63]。VS38c高表達可識別MM細胞,特別是在Daretumab治療的患者中[64]。

MRD狀態還能預測移植結果,研究表明,在295例接受自體干細胞移植(autologous stem cell transplantation,ASCT)治療的NDMM患者中,ASCT后+100 d MRD陰性(靈敏度為10-4)的患者,其PFS和OS均顯著延長。同樣,移植后3個月和6個月檢測到克隆性漿細胞與明顯較短的PFS和OS相關,而在這些時間點未檢測到克隆性漿細胞的患者疾病進展風險較低,5年OS為100%[65]。MRD狀態在不符合條件的老年移植患者中也是最重要和最獨立的預后因素之一。

MRD評估主要集中在BM漿細胞上,沒有涉及到同樣在預后中發揮作用的BM微環境,而且BM受累可能并不均勻,髓外也可能存在病灶,因此,基于MFC的MRD檢查和影像學檢查往往存在差異?！耙后w活檢”技術的發展避免了BM取樣中異質性缺陷,但敏感性較低。

6 結語

利用MFC進行免疫表型分析已成為惡性漿細胞疾病診斷和監測的常規手段。目前關于MFC在以下不同領域的臨床應用已經達成共識:漿細胞疾病的鑒別診斷和分類,MGUS、SMM和MM的預后分層以及MRD監測;此外,MFC還有助于揭示MM的發病機制和化療耐藥性。MFC在即將到來的免疫治療時代同樣具有重要意義,特別是在定義和監測治療靶點如CD38、SLAMF7、PD-L1、BCMA和許多其他尚未發現的靶點方面。然而,在最佳樣本采集、最佳檢測時間點、流程標準化以及不斷發展的表面抗體靶向藥物方面的挑戰仍然存在,并將需要解決。