基于網絡藥理學對參芪地黃湯治療糖尿病視網膜病變的主要活性成分及潛在基因分析

林稱心，李光智

海南省中醫院內分泌科，海南?？?570203

糖尿病視網膜病變（diabetic retinopathy, DR）是糖尿病的主要并發癥之一，可導致患者視力下降，甚至失明，是糖尿病患者致殘的主要原因之一[1]。在中醫學理論里DR 屬于“消渴目病”范疇，是因素體陰虛，虛火旺盛，耗氣傷津致使目睛失養所引發的疾病[2]。所以治療上應當扶正固本、益氣養陰。參芪地黃湯就是基于這一治法開發而來。參芪地黃湯的前期臨床隨機對照研究表明，DR 患者規律服用該方12 周，能顯著降低眼底檢查評分[3]。然而，由于參芪地黃湯治療DR 的作用機制尚未明確，這也限制了該方的進一步推廣。為初步探討參芪地黃湯治療DR 的機制，給進一步的實驗室研究做好前期鋪墊。本研究采用網絡藥理學方法，分析出了參芪地黃湯治療DR 的藥物-化合物-靶基因機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 參芪地黃湯主要活性成分和藥物作用靶基因的篩選

本研究通過中藥系統藥理學數據庫與分析平臺（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform, TCMSP）(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)檢索參芪地黃湯組成藥物：太子參、黃芪、熟地黃、山藥、枸杞子、山萸肉、澤瀉、丹皮、茯苓、決明子、甘草的所有活性成分?；钚猿煞趾Y選條件設置為口服利用度≥30% 和類藥性≥0.18[4]。此外，本研究還通過TCMSP 檢索出活性成分的靶基因。

1.2 DR 疾病基因的獲取以及交集基因的篩選

本研究通過基因卡數據庫（https://www.genecards.org/）中輸入關鍵詞：Diabetic Retinopathy，檢索DR 的疾病基因并建立數據集。然后將疾病基因與1.1 篩選出的藥物靶基因取交集，得到兩者的交集基因，并利用文氏圖展示。

1.3 交集基因中的核心基因篩選

STRING 數據庫(http://string-db.org)能夠通過人類已知的蛋白相互作用信息，預測出所檢索蛋白中的核心蛋白[5]?；谶@一點，本研究通過STRING數據庫建立交集基因的蛋白互作網絡（proteinprotein interaction network, PPI）（參數設置為：a.物種限制為人類；b.隱藏游離點；c.設定置信度＞0.7；d.其他保持默認設置），對交集基因進行分析，獲取蛋白相互作用，并保存其TSV 格式文件，最后將TSV格式文件導入Cytoscape3.9.0 軟件繪制PPI 網絡，用于后續進一步分析。

1.4 中藥名-活性成分-交集基因網絡的建立

為了篩選參芪地黃湯治療DR 的關鍵活性成分，本研究將1.1 和1.2 部分得到的中藥、中藥活性成分和交集基因導入Cytoscape3.6.1 軟件建立藥物-活性成分-交集基因的相互作用網絡關系圖，并利用該軟件中的CytoNCA 插件分析網絡節點的相關拓撲參數。

1.5 交集基因的細胞功能注釋分析與通路富集分析

為獲取交集基因的細胞功能注釋和信號通路富集分析結果，本研究最后再將1.2 獲取的交集基因導入DAVID 在線工具（https://david.ncifcrf.gov/）進行分析。

2 結果

2.1 參芪地黃湯有效成分及藥物靶點的篩選結果

在TCMSP 數據庫本研究共檢索到179 種參芪地黃湯主要活性成分，并獲得這些活性成分作用的靶基因320 個。

2.2 疾病基因和交集基因的篩選結果

通過Gene cards 數據庫本研究收集到DR 的疾病基因3 834 個，與2.1 的藥物基因進行交集分析后得到交集基因143 個。

2.3 核心基因的篩選結果

本研究將2.2 中獲得的交集基因導入STRING數據庫，建立PPI 互作網絡。隨后將獲得的數據錄入Cytoscape 進行網絡分析，得到143 個節點，2 873條邊。使用Cytoscape NCA 插件計算Betweenness unDir、Closeness unDir、Degree unDir 值，值越高說明該節點在PPI 網絡中越核心[4]。其中前5 個核心基因為絲氨酸/蘇氨酸激酶1（protein kinase B, AKT1）、腫瘤壞死因子-α (tumor necrosis factor-alpha, TNFα)、白細胞介素-1β(interleukin-1 beta, IL-1β)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、白細胞介素-6 (interleukin-6, IL-6)。

2.4 中藥-活性成分-交集基因網絡

本研究利用Cytoscape 3.9.0 軟件，構建了一個包含中藥名-活性成分-交集基因的關系網絡。通過對該網絡的拓撲分析，發現度值最高的前五個活性成分分別是槲皮素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇和異鼠李素。

2.5 細胞功能注釋及通路富集分析結果

在DAVID 平臺，本研究根據錯誤發現率（false discovery rate, FDR）＜0.01 分別對143 個交集基因的細胞功能和通路富集情況進行了分析。結果顯示：細胞功能共有976 種，其中涉及生物過程的有767種；涉及細胞組成的有81 條；涉及分子功能的有128 條。通路富集分析方面，本研究還找到了101條信號通路，根據FDR 由小到大排名前十的有癌癥通路、糖尿病并發癥中的高級糖基化終末產物-受體信號通路、脂質與動脈粥樣硬化、流體剪切力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、胰腺癌、癌癥中的蛋白聚糖、前列腺癌、內分泌耐藥、膀胱癌。根據FDR＜0.01 分別列出了前10 條GO 條目和KEGG 通路，見表1、表2。

表1 潛在基因的細胞功能注釋結果（FDR＜0.01）

表2 通路富集分析結果（FDR＜0.01）

3 討論

在本研究中，通過Cytoscape 3.9.0 軟件篩選出的參芪地黃湯治療DR 度值最高的前5 個活性成分為槲皮素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇、異鼠李素。其中，槲皮素被發現可以對DR 模型小鼠的炎癥反應產生抑制作用，而且該研究還指出，這種作用是通過抑制TNF-α、IL-6 和IL-1β 產生的，這與本研究的研究結論基本一致，從側面證實了本次研究的可靠性[6]。山奈酚有研究證實靶向調控VEGF，抑制AKT1/外來信號調節激酶1/2 信號通路的激活從而對DR 產生治療作用[7]。異鼠李素也有研究發現可以通過抑制線粒體蛋白激酶/核因子-κB 信號通路，減輕DR 大鼠視網膜損傷及細胞凋亡[8]。而豆甾醇和β-谷甾醇對于DR 的干預作用，目前暫無相關研究報道，可以作為下一步的研究方向。

通過PPI 網絡圖，本研究篩選出參芪地黃湯治療DR 的前5 個核心基因為AKT1、TNF-α、IL-1β、IL-6、VEGF。

AKT1 屬于蛋白激酶B 家族，是磷脂酰肌醇3-激酶下游信號通路的主要效應器之一，對調節糖脂代謝具有重要作用，根據其不同功能，AKT 還可細分為AKT1、AKT2 和AKT3 三個亞型。在這些亞型中，AKT1 在人體各類組織器官中表達廣泛[9]。

AKT1 通過與同源結構域的信號蛋白和磷脂酰肌醇依賴激酶Ⅰ結合，并與磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸結合，從而轉移到細胞膜上，調節細胞的糖原合成、糖異生和葡萄糖攝取[10]。這些功能使得AKT在細胞內維持糖平衡方面扮演著關鍵的調節者角色。所以AKT 對人體糖代謝有著重要影響，參芪地黃湯可能通過對該基因的調控，穩定糖代謝，從而對DR 產生治療效果[11]。

最近的研究表明，炎癥反應在DR 病程中扮演著重要角色，許多炎癥因子例如：TNF-α、IL-1β、IL-6 和VEGF 等都對DR 的發展起著促進作用[12]。

TNF-α 是機體炎癥反應的先導因子，一旦TNF-α 與其特異性受體結合，便能夠通過促進其他炎癥因子的釋放，從而介導炎癥反應過程[13]。TNF-α 廣泛分布于視網膜組織中的血管內皮細胞，激活后會提高視網膜血管通透性，并加速血管內皮細胞增殖及血管外基質形成[14]。一份臨床隊列研究顯示，DR 患者的淚液中TNF-α 水平顯著超過健康人水平，并且TNF-α 水平與視網膜病變程度正相關[15]。

IL-1β 和IL-6 同屬于趨化因子家族。過度釋放的IL-1β 和IL-6 可能是視網膜疾病發展的一個重要潛在因素。據目前的報道，兩者可能通過以下幾種生物學機制對DR 產生影響：①促進炎癥反應，不少研究顯示IL-1β 和IL-6 會促進其他炎癥因子的表達以及炎性細胞的募集，從而加重視網膜組織的炎性損傷[16]；②提高視網膜通透性，導致視網膜水腫。IL-1β 和IL-6 可以作用于多種細胞信號通路，從而降低緊密連接蛋白的表達以及減少血管緊張素水平，打破血管收縮平衡，從而造成視網膜血管內皮細胞損傷，最終導致視網膜通透性增加[17]。

VEGF 是一種具有高度特異性的促血管內皮細胞生長因子，對DR 的影響主要體現在兩個方面：①能增加血管通透性，導致視網膜水腫[18]；②提高視網膜局部細胞間粘附分子和其它活性物質的釋放，導致血管內皮細胞增殖，促進視網膜新生血管生成[18]。

綜上所述，本研究通過網絡藥理學研究，對參芪地黃湯治療DR 的作用機制進行了初步的研究，研究發現了槲皮素、山奈酚、豆甾醇、β-谷甾醇、異鼠李素等活性成分以及AKT1、TNF-α、IL-1β、IL-6和VEGF 等藥物作用基因。這些活性成分和基因均有相關文獻報道與DR 緊密相關，從側面證明了本次研究結果的可靠性。