芽孢桿菌BC4鉻抗性相關基因chrA的克隆表達

蒼巖　陳旭　冉鐘呂　蔡亞君

摘 要：以芽孢桿菌BC4菌株為對象，通過對其鉻抗性相關基因chrA的克隆表達來測定其編碼蛋白ChrA還原Cr（VI）的能力以及該蛋白在芽孢桿菌Cr（VI）去除中的作用，可幫助進一步闡明芽孢桿菌與Cr（VI）的作用機理，并為芽孢桿菌應用于鉻污染治理奠定理論基礎。PCR擴增出芽孢桿菌BC4菌株鉻抗性相關基因chrA，PCR產物經克隆與測序，得到chrA完整的DNA序列。該序列大小為1182bp，共編碼393個氨基酸，預測編碼蛋白分子量為43kDa。根據利用NCBI所進行的BLAST序列比對結果，判斷該基因為鉻轉運蛋白編碼基因。將chrA基因PCR產物雙酶切后連接到表達載體pET28b并轉化進大腸桿菌BL21中，對其表達產物進行分析。結果表明，chrA基因在大腸桿菌BL21中表達約43kDa的蛋白，與預期結果相符；重組菌株對Cr（VI）的耐受能力高于對照菌株，說明ChrA蛋白在芽孢桿菌BC4的Cr（VI）抗性機制中起重要作用，且重組菌株對Cr（VI）具備較強的抗性。

關鍵詞：芽孢桿菌；chrA基因；基因克隆與表達；重組菌株

中圖分類號：X172文獻標識碼：A文章編號：2095－414X（2023）05－0025－06

0引言

Cr（VI）是一種極強的氧化物質，在接觸到有機體時，會引起強烈的腐蝕性，對生物造成損害：Cr（VI）可通過消化道、呼吸道、皮膚及鼻粘膜進入人體，在肝臟、腎臟、內分泌腺等器官中積累，危害人體健康[1]；高濃度的Cr（VI）會抑制植物生長，導致葉片黃化和壞死[2]。Cr（VI）的毒性約是Cr（III）的100倍[3]，Cr（III）在土壤、水環境中均有分布，是人體必需的痕量飲食營養元素，相對Cr（VI）毒性較低。因此，對鉻污染的治理通常通過將Cr（VI）還原為Cr（III）以消除或減輕其危害。

目前有關Cr（VI）污染的治理方法主要有化學、物理、生物修復３種，其中化學還原[3]、吸附[5]、反滲透[6]、電化學[7-8]等方法處理價格昂貴，不能完全將重金屬去除，且試劑消耗高，會產生有毒污泥而造成二次污染。因此，這些方法還不適宜處理低濃度Cr（VI）污染[9]。與傳統的物理化學方法正好相反，生物修復方法的優點是能量和材料要求低，且無二次污染，這使得該方法更經濟、環保和安全。

在幾種可行的方法中，耐鉻菌將Cr（VI）生物轉化為相對無毒的Cr（III）具有投資少、操作方便、不產生二次污染的優點，其已逐漸發展為一種便宜又方便，處理也十分徹底的方法。微生物對于Cr（VI）的作用機制主要有還原機制和抗性機制[10]。大量研究已分離出可高效去除Cr（VI）的微生物，但微生物對Cr（VI）抗性機制仍不清楚，大多研究都是菌種的分離和去除特性的探究方向[12]，對于微生物的Cr（VI）抗性機制以及相關基因的編碼蛋白還需要進一步探究。

本研究前期從土壤中篩選分離得到一株對Cr（VI）具有較強還原和耐受能力的細菌，初步鑒定為蠟樣芽胞桿菌，為探明該菌對鉻的抗性和還原機制，本研究對芽孢桿菌BC4的一個chrA基因進行了克隆和表達，首先將chrA基因進行PCR擴增，然后以pET28b為表達載體，將chrA基因連接到pET28b上進行重組質粒的構建，然后篩選正確的重組質粒將其導入受體細胞E.coli BL21中，再將其進行Cr（VI）誘導表達。通過比較重組菌株和對照菌株胞內粗提物的Cr（VI）耐受能力，分析chrA基因編碼蛋白的功能，并成功構建了ChrA重組菌株。重組菌株對Cr（VI）具備較強的抗性能力，通過鉻還原菌對Cr（VI）抗性機制的研究，可為微生物應用于治理環境鉻污染提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

芽孢桿菌BC4為本實驗室分離所得。表達載體pET-28b和感受態細胞E.coli BL21由實驗室-80℃超低溫冰箱內保存。

1.2 菌種與質粒

質粒小提試劑盒、PCR產物純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、2×Taq Master Mix酶、6×DNA loading buffer、BM2000 DNA Marker、1KB DNA Ladder均購自大連寶生物工程公司，BamHI、SalI限制性內切酶，T4 DNA連接酶，均購自Sigma公司；瓊脂糖（Biowest公司），LB培養基（每升含10g胰蛋白胨，5g酵母粉，10gNaCl，固體培養基另添加2%瓊脂），卡那霉素使用濃度為50ug/mL；鼠抗His-tag稀釋液（一抗：封閉液為1∶2000，4℃保存，可短期內重復利用三次），羊抗鼠IgG-HRP稀釋液（二抗：封閉液為1∶5000，4℃保存，可短期內重復利用三次），抗體均購自武漢亞科因生物技術有限公司，其余均為國產或進口分析純試劑。

1.3 細菌裂解液模板的制備和質粒的提取

將活化后的芽孢桿菌BC4菌液劃線接種到含有LB培養基固體平板上，在培養箱內（37℃）倒置培養12h，挑取菌落于無菌水中，震蕩懸浮至菌體全部分散，在沸水中水浴10min，立刻冰浴。離心取上清，即得PCR擴增所用菌裂解液模板[13]。質粒的提取按照質粒小提試劑盒說明書操作。

1.4 芽孢桿菌chrA基因的克隆

根據NCBI數據庫中chrA基因同源序列，利用軟件Primer Premier5設計引物：

ChrA-F：CGGGATCCCGTTGGAAAATAACAAATAC（引入BamHI酶切位點）

ChrA-R：GTCGACTTACAAAATGGATAGAATATATCCGC（引入SalI酶切位點）

引物由武漢科邁欣生物科技有限公司合成。以提取的芽孢桿菌BC4的DNA為模板，ChrA-F、ChrA-R分別為上、下游引物，2×PCR Master Mix酶擴增chrA基因。PCR擴增反應體系及程序如表1所示，1%瓊脂糖凝膠電泳測定PCR產物，并對正確PCR產物進行DNA提純試劑盒提純回收。

1.5 感受態細胞的制備

感受態細胞的制備方法參考《分子克隆實驗指南》第三版（2002）[14]方法進行。

1.6 基因表達載體的構建

用T4連接酶將純化產物進行連接，將雙酶切后的目的基因片段及表達載體 pET28a雙酶切產物連接，根據載體和目的片段的大小和摩爾比確定二者的使用量，計算得到的連接體系（25μl）：2.5μL 10×T4 DNA Ligase Buffer，20.5μL DNA，1μL載體質粒，1μL T4 DNA Ligase。4℃條件下反應72h。

連接完成后，65℃水浴加熱10min使連接酶失活。將全量25μL連接產物加入200μL E. coli BL21感受態細胞中混合均勻，冰置30min。在42℃恒溫水浴中加熱90s，即刻冰浴2min；加入890μL于37℃預熱過的LB液體培養基，混勻后，37℃，120rpm振蕩培養3h。取350μL培養產物于含50μg/mL卡那霉素的LB平板，緩慢晃動使液體培養物均勻分布在培養基表面，待晾干后置于37℃恒溫培養箱培養。

培養16h后觀察平板菌落生長狀況，挑選單菌落接種至裝有5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養基試管內，過夜培養后取菌液提質粒并采用BamHI/SalI雙酶切進行目的基因驗證。

鑒定正確的質粒即為chrA基因在質粒pET28a T7啟動子控制下表達的重組質粒，將其命名為pETChrA，重組菌株命名為E-pETChrA。

1.7 重組菌株的蛋白表達

將鑒定正確的重組菌株E-pETChrA轉接到5mL含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37℃，120rpm條件下震蕩培養過夜，2％接種量轉接至100mL的新鮮的含50μg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，當培養至OD600約0.6時，加入終濃度為40mg/L的Cr（VI）誘導過夜培養，同時誘導空載體轉化菌株作為空白對照。12000rpm離心1min，收集菌體。

1.8 表達產物的SDS-PAGE及Western-blot檢測

取15?L的4×Protein SDS-PAGE loading buffer和45?L的純化蛋白混合后，沸水浴10min，8000rpm、4℃下離心1min得到蛋白膠樣品。蛋白質電泳使用的分離膠濃度為10%、積層膠濃度為5%。具體配方如表2所示，分別吸取上述溶液添加至50mL小燒杯中，輕柔且迅速地搖晃燒杯10s使其混合均勻，此步驟的目的是使丙烯酰胺能夠快

速聚合，再在兩個玻璃板中間緩慢添加液態凝膠，向凝膠上添加適量無菌水至液面與玻璃板齊平，使凝膠表層無氣泡，將制膠裝放于35℃的恒溫箱中，等待30min，待凝膠聚合結束后，濾紙條將其上無菌水吸干。將5%積層膠（3mL體系）添加至50mL小燒杯中，輕柔且迅速地搖晃燒杯10s使其混合均勻，在凝膠填充前插入一個規格為0.75mm的梳子，添加凝膠后，將制膠裝置放于35℃恒溫箱，等待30min。

取預染Marker3?L、煮沸離心后的蛋白膠樣品10?L，分別在孔內點樣，連接蛋白質電泳裝置，設置恒定電壓100V，接通電源進行電泳，待樣品跑到下端終止跑膠，時長約2-2.5h，根據每次的跑膠速度適當調整。跑膠結束后用超純水清洗，然后用染色液染色20min，超純水洗去浮色后再用脫色液脫色兩次，每次15min，上述步驟均在室溫的搖床內操作，轉速調至60rpm，脫色結束后將蛋白膠過夜浸泡在7%冰醋酸中脫去底色，拍照記錄并觀察。

Western-blot具體操作為：SDS-PAGE電泳結束后未染色的凝膠切下實驗所需部分，將三層濾紙、PVDF膜、蛋白膠、三層濾紙依次放置于轉膜裝置中，加入電轉液，接通電源，電壓20V，電流60mA，轉膜1.5h至PVDF膜上；轉膜完成后在搖床里進行TBST（2.4gTris-base，8.7gNaCl，再加入1ml TWEEN-20，加入超純水至1L容量瓶刻度線，調節pH為7.5，滅菌后使用，4℃保存）洗膜兩次各10min，室溫、60rpm；洗膜后用封閉液（1g脫脂奶粉溶于20mL無菌的TBST中）封閉2h；后續實驗步驟均在在4℃低溫環境下；封閉結束后用TBST洗膜三次各10min；再將清洗過的膜放入鼠抗His-tag稀釋液（一抗，1∶2000）中孵育過夜，孵育完成再用TBST洗膜三次各10min，再放入羊抗鼠IgG-HRP（二抗，1∶5000）中孵育1h，然后用TBST洗膜兩次各10min；最后利用DAB顯色試劑盒進行結合有辣根過氧化物酶的膜的顯色檢測，

觀察出現條帶后立刻用無菌水沖洗顯色劑，終止顯色反應并拍照。

1.9 重組菌株的Cr（VI）抗性檢測

為了檢測重組菌株E-pETChrA的Cr（VI）抗性是否增強，應用平板劃線法將重組菌株E-pETChrA和對照菌株E-pET28b分別在固體培養基平板上接種，其中卡那霉素的濃度為50?g/mL，37℃恒溫培養箱倒置培養12h；挑單菌落至5mL含50?g/mL卡那霉素的LB培養基中活化，其中一組重組菌株E-pETChrA加入50mg/L的無菌Cr（VI）溶液進行誘導表達，其他組不做特殊處理，37℃，120rpm條件下培養24h；將重組菌株及對照菌株的分別按照2%接種量分別轉接至裝有100mL含不同濃度Cr（VI）（0、30、50、80、100、130、160、200、240mg/L）的液體培養基錐形瓶中（體系內卡那霉素的濃度為50?g/mL），培養24h后測定其OD600，繪制菌株在不同濃度Cr（VI）培養條件下生長情況圖。每組設置三個平行。

2結果

2.1 PCR產物的電泳結果

以芽孢桿菌BC4基因為PCR模板，擴增出的PCR產物電泳結果見圖1。由上述PCR產物的電泳圖片可知得到的PCR產物大小約1200bp，與chrA基因（1182bp）大小一致，說明PCR成功擴增出了chrA基因DNA。

2.2 芽孢桿菌chrA基因編碼蛋白氨基酸序列分析

經全基因組測序，得到ChrA的氨基酸序列如下：

MENNKYTFHTLLEIFLVSFKLGITSFGGPVAHLGYFHHEYVEKRKWMDERIYGDLVALCQFLPGPASSQVGMGVGLLRGGVFGAIISWIGFTLPSVLVLVFFASFLNQFDLGSAGWIHGLKLVAVAIVAHAIWGMAQKLTPDRNRATIAIATASIALLWPSSWTQVTLIIISGFIGWLLYRNEPISQSQHIKVPISKNIAVSCLVLFFGLLLLLPILRPFSYYIALFDSFYRSGALVFGGGHVVLPLLEGEFVQNGMMTKEQFLAGYGLTQAMPGPLFTFASYIGAVLNGTLGAILATIAIFLPAFLLVIGVLPFWDSVRKISFIQGALLGVNAAVVGILLAAFYDPIWTSTIMNAVDFVFASLLFCLLAFWKTPPWVIVILGAFGGYILSIL

由上可以得知chrA基因可以編碼393個氨基酸，其理論分子量約為43kDa。

將氨基酸序列在NCBI數據庫中進行BLAST序列比對，并構建進化樹，結果見圖2。

由圖2可知，與chrA基因編碼的氨基酸序列同源性最高的是Bacillus cereus菌株chromate transporter WP000429767.1，同源性最高為99.75%，基本可判斷chrA基因編碼的蛋白屬于鉻酸鹽轉運蛋白，該類蛋白可將進入細胞的鉻迅速轉運至細胞[15]，從而提高鉻還原菌對鉻酸鹽的耐受性。

2.3 重組表達菌株的鑒定

大量活化含表達載體質粒的菌株E-pETChrA并提取質粒，將質粒均用BamHI/SalI雙酶切后膠回收其酶切產物，電泳檢測結果見圖3，瓊脂糖凝膠電泳結果顯示：泳道2表示酶切后形成的2個DNA片段條帶，大小分別約為5300bp和1200bp，與pET28b質粒理論長度5369bp以及chrA基因理論長度1182bp十分接近，可初步定性認為成功構建重組質粒。

2.4 表達產物的SDS-PAGE電泳分析及Western-blot檢測

分別在含有卡那霉素的LB培養基中活化培養對照菌株E-pET28b和重組菌株E-pETChrA，培養得到的菌液各取1mL離心后棄上清，菌體用60?L ddH2O懸浮混勻，加入4loading buffer混合均勻后沸水浴10min后自然冷卻，離心取上清。取預染marker 5?L、處理得到的蛋白膠樣品各10?L點樣，進行SDS-PAGE電泳，結果見圖4，預測蛋白的分子量與SDS-PAGE膠上的蛋白大小一致，為43kDa；經Western-blot鑒定上述特異性條帶為重組菌株所表達的目的蛋白。

3、6：E-pETChrA）

2.5 重組表達菌株的表達產物活性分析

分別測定重組菌株E-pETChrA和對照菌株E-pET28b在含不同濃度Cr（VI）（0、30、50、80、100、130、160、200、240mg/L）的LB液體培養基中的抗Cr（VI）能力。由圖5可知重組菌株具有一定的Cr（VI）的抗性能力，其最高能耐受130mg/L的Cr（VI），即重組菌株E-pETChrA的抗Cr（VI）生長能力顯著高于對照菌株E-pET28b。即ChrA蛋白的表達賦予了大腸桿菌更高的Cr（VI）耐受能力。

Cr（VI）抗性同樣在不誘導和經過50mg/LCr（VI）誘導兩種條件下測得。初始菌液濃度基本保持一致，隨著培養基中Cr（VI）含量的增加，經過Cr（VI）誘導的E-pETChrA菌液濃度明顯高于未經誘導的菌株。經過Cr（VI）誘導的E-pETChrA對Cr（VI）的最大耐受能力為130mg/L，而未經過Cr（VI）誘導菌株在30mg/LCr（VI）環境下很難存活下去，OD600均未達到0.2。

3結論

本文以一株具有Cr（VI）還原能力的細菌為對象，經基因組測序鑒定其為芽孢桿菌屬，命名為BC4，對其鉻抗性相關基因chrA的克隆及表達進行了研究。PCR擴增出chrA基因，經克隆與測序得到chrA完整的DNA序列。該序列大小為1182bp，編碼393個氨基酸，預測編碼蛋白分子量為43kDa。通過NCBI進行BLAST序列比對，構建其系統發育樹，判斷該基因為鉻轉運蛋白編碼基因。將chrA基因PCR產物擴增進行雙酶切后連接到表達載體pET28b并轉化進感受態細胞BL21中，對其表達產物進行分析。結果表明，chrA基因在大腸桿菌BL21中表達的蛋白約43kDa，與預期結果相符；重組菌株對Cr（VI）的耐受能力遠高于對照菌株，最高能耐受100mg/L的Cr（VI），說明ChrA蛋白在芽孢桿菌BC4的Cr（VI）抗性機制中起重要作用，重組菌株對Cr（VI）具備較強的抗性。該研究為將來將基因工程菌和Cr（VI）抗性基因在Cr（VI）污染土壤或水中的應用奠定基礎，因此，該技術的發展具有十分重要的意義。

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Clonal Expression of Bacillus Cereus BC4 Chromium resistance-associated gene chrA

CANG Yana， CHEN Xua， RAN Zhong-lva，CAI Ya-juna，b

（a.School of Environmental Engineering;b.Engineering Research Center for Clean Production of Textile Dyeing and Printing，

Wuhan Textile University， Wuhan Hubei 430200， China）

Abstract：In this paper， Bacillussp. BC4 strain was used as the target， and its chromium resistance-related gene chrA was cloned and expressed to determine the ability of its encoded protein ChrA to reduce Cr（VI） and the role of this protein in the removal of Cr（VI） by Bacillus， which can help to further elucidate the mechanism of Bacillus and Cr（VI） and lay the theoretical foundation for the application of Bacillus to chromium pollution treatment. The PCR amplified the chromium resistance-related gene chrA of Bacillusstrain BC4， and the PCR product was cloned and sequenced to obtain the complete DNA sequence of chrA. The sequence size was 1182bp， encoding 393 amino acids， and the predicted molecular weight of the encoded protein was 43kDa. The expression product was analyzed by double digestion of the chrA gene PCR product and ligated into the expression vector pET28b and transformed into E. coli BL21. The results showed that the chrA gene expressed about 43kDa protein in E. coli BL21， which was consistent with the expected results; the tolerance ability of the recombinant strain to Cr（VI） was higher than that of the control strain， indicating that the ChrA protein played an important role in the Cr（VI） resistance mechanism of Bacillus BC4， and the recombinant strain possessed a strong resistance to Cr（VI）.

Keywords：Bacillus cereus; chrA gene; Gene cloning and expression; Recombinant strain

（責任編輯：周莉）

*通訊作者：蔡亞君（1980-），女，副教授，博士，研究方向：環境中重金屬的鈍化修復及其生態效應.