QuEChERS 結合UPLC—MS/MS 測定水產品中4 種黃曲霉毒素及其裂解規律研究

龔敏 陳明亮 金鵬 紀少凡 王朝政 李備

（1. 海南省現代農業檢驗檢測預警防控中心 海南?？?570100；2. 海南醫學院第一附屬醫院康復醫學科 海南?？?570100；3. 浙江農林大學農業與食品科學學院 浙江杭州 311300；4. ?？诤ｊP技術中心/海南省食品檢驗檢測中心 海南?？?570311）

黃曲霉毒素主要是黃曲霉和寄生曲霉等菌種產生的次生代謝產物，是一類聚酮衍生的呋喃氧雜萘鄰酮物，產生并分布于農作物生長、收獲、儲存、運輸等各個階段，常見的黃曲霉毒素有B1、B2、G1、G2四種亞型，是目前具有最高生物學活性的毒素，毒性是氰化鉀的10 倍，砒霜的68 倍[1]。研究表明，黃曲霉毒素在水產飼料中普遍存在[2-3]，并在水產生物體內富集，造成水產生物飼料轉化率和抗病能力低、死亡率增加[4-6]。同時，水產生物在攝入被黃曲霉毒素污染的飼料后，其肌肉組織中存在毒素殘留風險[7]，影響消費者的身體健康。2019 年11 月，水產品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的檢測被列入海關總署《2019 年度進出口食品化妝品抽樣檢驗及風險計劃》補充計劃，但目前尚無水產品中黃曲霉毒素殘留含量的檢測標準。傳統的黃曲霉毒素檢測方法主要有酶聯免疫法和免疫親和層析凈化-液相色譜法，且現有的水產品中黃曲霉毒素檢測的文獻較少，前處理方法主要采用固相萃取凈化[8-9]，存在檢測過程繁瑣、耗時、成本高等問題，對其質譜裂解規律的研究亦鮮有報道。QuEChERS（Quick、Easy、Cheap、Effective、Rugged、Safe），是近年來國際上最新發展起來的一種用于檢測的快速樣品前處理技術，利用吸附劑與基質中的雜質相互作用而達到除雜凈化的目的，具有快速、簡便、成本低、對環境友好等優勢[10]。本研究采用QuEChERS[11-12]結合超高效液相色譜-串聯質譜儀檢測，建立了一種水產品中4 種黃曲霉毒素殘留量的高效檢測方法，并對其可能的質譜裂解機理進行研究。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 三重四級桿液質聯用儀（美國Waters 公司）；旋渦混勻器（廣州IKA 公司）；離心機（Eppendorf 公司）；G-285 電子天平（Mettler公司）。

1.1.2 試劑 甲醇、乙腈、甲酸、乙酸均為色譜純（德國默克公司）；中性氧化鋁、C18、PSA、佛羅里硅土吸附劑（迪馬科技）；QuEChERSEMR-Lipid（安捷倫公司）；黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2 標準品（純度均大于等于99%，購自天津阿爾塔）。

1.2 方法

1.2.1 標準溶液配制 標準品采用甲醇作為溶劑，配制成25 μg/mL 標準儲備液，置于-20℃下避光保存。

1.2.2 樣品處理 將粉碎勻漿后的樣品準確稱取5 g（精確至0.01 g），于50 mL 離心管中，加入20 mL 乙腈渦旋震蕩提取5 min 后，加入5 g 無水硫酸鈉，渦旋震蕩混合1 min；以9 000 r/min 離心5 min，吸取1 mL 至玻璃試管中，加入100 mg 中性氧化鋁吸附劑，渦旋混合1 min 后，以5 000 r/min離心3 min，取上清液過濾膜（0.22 μm），待LCMS/MS 測定。

1.2.3 色譜條件 色譜柱：Waters BEH C18（2.1 mm×50 mm×1.7 μm）；流速：0.35 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL；流動相：5 mmol 乙酸銨-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫程序見表1。

1.2.4 質譜條件 電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應監測（MRM）模式，離子源溫度150 ℃，脫溶劑氣溫度 500 ℃，脫溶劑氣流速1 000 L/h，錐孔反吹氣流速150 L/h，碰撞氣體（氬氣）流量0.14 mL/min。質譜優化條件見表2。

2 結果與分析

2.1 提取溶劑的選擇

水產品含有大量的蛋白質、脂肪。乙腈極性較大，作為提取溶劑時，蛋白質、脂肪等難被提取出來，能夠有效減少提取過程中的共萃物，被作為QuEChERS 法常用的提取溶劑。黃曲霉毒素類化合物屬于弱極性化合物，4 種黃曲霉毒素均易溶于乙腈。分別考察乙腈、0.1%甲酸-乙腈、1%甲酸-乙腈、0.1%乙酸-乙腈、1%乙酸-乙腈作為提取溶劑的提取效果。結果表明，酸化乙腈的提取效果與直接采用乙腈作為提取溶劑的提取效果無顯著差異，故采用乙腈作為水產品中4 種黃曲霉毒素的提取溶劑。

2.2 凈化條件的選擇

動物源性樣品基質復雜，脂質干擾是影響檢測的重要因素，不僅會導致儀器對待測組分的靈敏度下降，還會縮短儀器和色譜柱的使用壽命，所以質譜分析前應進行除脂凈化。本研究使用EMR-Lipid、C18、PSA、中性氧化鋁、佛羅里硅土對脂肪有一定吸附能力的吸附劑進行凈化。結果表明，使用EMR-Lipid、C18 和佛羅里硅土作為吸附劑回收率偏低，尤其在使用佛羅里硅土凈化時，回收率不足50%；PSA 作為吸附劑雖然回收效果好，但在檢測黃曲霉毒素G2時不能有效除去譜圖中的雜質峰，基線不平穩，影響定量分析的準確性。采用中性氧化鋁作為凈化劑時，4 種黃曲霉毒素的回收率好，基線平穩，能夠滿足檢測需求，主要是由于中性氧化鋁作為吸附劑，分子表面可呈電中性，易吸附芳香族和脂肪胺等富電化合物，同時能夠保留含氧、硫、磷的基團。經中性氧化鋁凈化樣品和未凈化樣品檢測的黃曲霉毒素G2譜圖見圖1。不同凈化方式下，4 種黃曲霉毒素在羅非魚和對蝦中的添加濃度水平為10.0 μg/kg 時，回收率見圖2。

圖1 凈化前后羅非魚樣品中黃曲霉毒素G2 色譜圖

圖2 不同凈化方式在添加水平為10.0 μg/kg 時的回收率

2.3 色譜條件選擇

分別考察了水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈、5 mmol/L 乙酸銨水溶液-乙腈、0.1%甲酸-5 mmol/L乙酸銨水溶液-乙腈作為流動相對峰形、響應值等影響。結果表明：選擇0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸銨水溶液-乙腈作為流動相時，4 種黃曲霉毒素響應值最高、峰形最好。所以選用 0.1%甲酸-5 mmol/L 乙酸銨水溶液乙腈作為流動相體系，4種黃曲霉毒素標準色譜圖見圖3。UPLC 使用的超高壓色譜柱體積小，進樣量過大容易產生溶劑效應，導致峰形變寬，出現前延峰；同時，進樣量大小直接影響到儀器靈敏度和方法檢測限。本研究以5 ng/mL 的黃曲霉毒素B1標準溶液為例，比較了進樣量在2 、5、6、7、8、9、10 μL 時的峰形和響應值變化。由圖4 可見，進樣量大于5 μL時，峰形開始變寬，峰高不再隨進樣量增大成比例增高，5 μL 為最佳進樣量。

圖4 不同進樣體積黃曲霉毒素B1 色譜圖

2.4 黃曲霉毒素的裂解機理研究

采用質譜針泵直接注射黃曲霉毒素標準品，一級質譜采用正離子掃描待測物的母離子，選用[M + H]+作為分子離子峰。經氦氣轟擊分子離子后，利用二級質譜對碎片離子進行分析，選用豐度最高的2 個離子碎片作為子離子。通過質譜對4 種黃曲霉毒素八組離子對可能的裂解過程進行詳細分析。黃曲霉毒素的裂解機理見表3。

表3 黃曲霉毒素的裂解機理

表4 四種黃曲霉毒素的線性方程及相關系數

2.5 基質效應、線性關系及檢出限

采用相對響應值法（基質中待測組分響應/純溶劑中待組分響應×100%）[13-14]對基質效應進行評價。結果表明：經過中性氧化鋁凈化后，4 種黃曲霉毒素在水產品中的基質添加回收率均在90%～100%，基質效應可忽略不計。4 種黃曲霉毒素在0.1～10.0 ng/mL 有良好的線性關系，線性方程及相關系數見表 4。以實際檢測時的信噪比（S/N）10 作為定量限，本方法的定量限為0.4 μg/kg。

2.6 回收率與精密度試驗

采用羅非魚和對蝦樣品作為基質，分別進行低、中、高3 個水平的加標回收實驗，每個添加濃度做6 次平行試驗，考察回收率和精密度?；厥章始癛SD見表5、6?；厥章试?3.1%～95.4%，RSD為2.0%～6.2%。

表5 羅非魚中4 種黃曲霉毒素不同添加濃度水平下的平均回收率和相對標準偏差（n=6）

表6 對蝦中4 種黃曲霉毒素的平均回收率和相對標準偏差（n=6）

3 結論

利用QuEChERS 結合UPLC—MS/MS，建立了水產品中4 種黃曲霉毒素的超高效液相色譜-質譜/質譜檢測方法。該檢測方法采用乙腈作為提取溶劑，中性氧化鋁為吸附凈化劑，以多反應監測模式掃描，外標法定量。通過分析結果可知，該檢測方法操作簡便、靈敏度高、定量準確，能滿足水產品中黃曲霉毒素的檢測要求。