SULT1C2在肝癌中表達及其與預后關系生信分析

閆偉華,趙樹超,張敏,時維平,周璇,馬曉軍

(青島大學附屬醫院,山東 青島 266000 1 病理科; 2 麻醉科)

肝癌是世界上第六大常見惡性腫瘤,也是導致癌癥相關死亡的第二大原因[1]。由于早期診斷困難,大多數肝癌病人確診時已處于中晚期而錯過了有效治療的機會,預后很差[2-3]。即使手術切除,術后生存率也不高[3]。因此,深入了解肝癌發生和發展的分子機制,對于開發肝癌的早期診斷的分子生物標志物和尋找新的治療策略至關重要。

磺基轉移酶1C2(SULT1C2)是胞漿硫轉移酶1C(SULT1C)亞家族的一員,是一種Ⅱ相解毒酶,通過在靶標上添加硫酸鹽基團來促進外源物質通過尿液或膽汁排出。SULT1C2對硝基苯酚和誘變劑N-羥基-2-乙酰氨基熒烯均表現出硫化活性,在致癌物質的活化中起重要作用[4]。SULT1C2已經被證明在人的胃、腎和甲狀腺以及胎兒肝和腎中表達[5]。目前已有研究顯示,SULT1C2在結腸腺癌細胞系LS180中表達[6],在肺腺癌中高表達并導致預后不良[7]。但關于SULT1C2在肝癌中作用的研究較少。因此,本研究通過癌癥基因組圖譜(TCGA)、基因表達綜合(GEO)和基因型-組織表達(GTEx)數據庫,并結合臨床樣本探討SULT1C2基因表達與肝癌的關系,并進一步探討其潛在的作用機制,為確定SULT1C2基因與肝癌的關系提供依據。

1 資料和方法

1.1 數據資料的收集

從TCGA數據庫下載33種泛癌表達數據,并下載肝癌病人的臨床信息,共將341例肝癌樣本納入研究。以肝癌為關鍵詞從GEO數據庫中篩選原始數據的數據集,共9個符合條件,分別為GSE10 2097、GSE12 1248、GSE22 058、GSE25 097、GSE36 376、GSE46 444、GSE57 957、GSE76 297和GSE76 427,分別下載原始數據,提取SULT1C2基因表達信息。肝癌分子圖譜數據庫(HCCDB)[8]用于進一步研究SULT1C2在泛癌、正常組織和肝癌組織中的表達。

1.2 癌和癌旁組織的收集

收集青島大學附屬醫院器官移植中心2014年3月—2017年8月切除的96對肝癌和癌旁組織,置于-80 ℃保存用于SULT1C2在肝癌中表達的研究。術前已告知病人及其家屬標本的采集不會造成任何額外的經濟和健康負擔。所有參與者都簽署了書面知情同意書。

1.3 總RNA的提取

稱量冷凍的肝癌和癌旁組織100 mg,加入含800 μL Trizol裂解液的1.5 mL離心管并用組織破碎儀破碎。組織勻漿置于4 ℃離心機1 500 r/min離心5 min,上清轉移至新的離心管于室溫裂解5 min。組織裂解液加入160 μL的氯仿,混勻,平衡15 min?；旌弦河? ℃條件下、12 000 r/min離心10 min,上層RNA轉移入新的EP管。RNA用異丙醇沉淀并通過離心分離,分離并沉淀后的RNA用體積分數為0.75的乙醇洗滌。RNA干燥后用DEPC水10 μL溶解。

1.4 cDNA的合成

SuperScript?Ⅲ First-Strand Synthesis kit用于cDNA的合成。將cDNA合成試劑盒平衡至室溫,使用前將每種成分混合并短暫離心。將總RNA(≤2.5 μg)、dNTP混合物(1 mmol/L)、隨機引物(5 mg/L)和水添加至體積5 μL。將RT緩沖液、RNaseOUT(2 U)、DDT(10 mmol/L)、SuperScript?Ⅲ(10 U)和MgCl2(5 mmol/L)添加到PCR管至總體積為10 μL。隨后,在PCR儀中運行標準的cDNA合成程序。合成的cDNA用DEPC水稀釋至200 μL,并在-20 ℃下儲存。

1.5 qRT-PCR檢測組織中SULT1C2的表達

在平衡至室溫后,將引物、Sybr Green和cDNA充分混合。在短暫離心后,在384孔PCR板中加入3.8 μL雙蒸水、1.0 μL cDNA、5.0 μL Sybe Green和0.2 μL引物(10 μmol/L)制備PCR溶液。PCR程序:95 ℃變性15 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸50 s,共進行40個循環。Sybr Green用于確定Cq值。管家基因GAPDH用于校驗靶基因的表達水平。PCR所用引物及其序列見表1。

表1 PCR擴增引物及其序列

1.6 統計學分析

TCGA下載泛癌數據后,以SULT1C2表達值為標準,將病人分為SULT1C2高表達和低表達兩組。Limma R包用于差異分析,clusterProfiler R用于基因富集分析(GSEA),pheatmap用于熱圖的繪制,用Kapalan-Meier曲線分析SULT1C2對肝癌病人生存的影響,用Pearson法檢驗SULT1C2與信號通路間的線性關系,t檢驗用于檢測兩組數據間差異。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 SULT1C2基因在肝癌組織中的表達

應用HCCDB在線HCC數據庫研究SULT1C2在正常組織、泛癌組織和肝癌組織中的表達。研究結果顯示,SULT1C2在各種器官和組織中表達的均值為0.89,而SULT1C2在泛癌的腫瘤組織中的表達高于癌旁組織(6.67vs3.67)。見圖1A。其中,SULT1C2基因在結腸癌(COAD)、嫌色腎細胞癌(KICH)、 肝癌(LICH)和肺腺癌(LUAD) 組織高表達,在食管癌(ESCA)、腎透明細胞癌(KIRC)、腎乳頭狀細胞癌(KIRP)、 肺鱗狀細胞癌(LUSC)和甲狀腺癌(THCA)組織中低表達。見圖1B。肝癌組織中SULT1C2的表達高于癌旁、肝硬化組織和正常組織。見圖2A。同樣,GEO數據分析結果顯示,SULT1C2在多個肝癌數據集的腫瘤組織中高表達。見圖2B。采用qRT-PCR檢測進一步驗證這一結果,證實了SULT1C2在肝癌組織中的高表達。見圖2C。

A:HCCDB在線數據庫中SULT1C2在正常組織中的表達,綠色虛線表示均值;B:HCCDB在線數據庫中SULT1C2在泛癌和癌旁組織中的表達,紅色表示癌癥樣本,藍色表示正常組織,紅線表示癌癥樣本的表達均值,藍線表示正常組織的表達均值。與癌旁組織相比,*P<0.05,**P<0.01,****P<0.000 1。

A:SULT1C2在HCCDB數據庫HCC數據集中腫瘤組織、肝硬化組織、癌旁和正常組織中的表達;B:SULT1C2在GEO數據庫HCC數據集中癌和癌旁組織中的表達;C:qRT-PCR檢測93對肝癌和癌旁組織中SULT1C2的表達。紅色表示SULT1C2高表達樣本,藍色表示SULT1C2低表達樣本。與癌旁組織相比,***P<0.001,****P<0.000 1。

2.2 肝癌組織中SULT1C2基因表達與病人預后的關系

對TCGA數據庫中的肝癌組織進行Kaplan-Meier分析,結果顯示,SULT1C2高表達組病人的總體生存率(OS)低于低表達組(高風險=125,低風險=245,P<0.01)。見圖3A。高表達組病人疾病特異性生存率(DSS)也低于低表達組(高風險=114,低風險=248,P<0.05)。見圖3B。然而,高表達組病人的無病生存率(DFI)和無進展生存率(PFI)與低表達組比較差異無顯著性(P>0.05)。見圖3C、D。

A:SULT1C2基因不同表達病人的OS;B:SULT1C2基因不同表達病人的DSS;C:SULT1C2基因不同表達病人的DFI;D:SULT1C2基因不同表達病人的PFI。

2.3 SULT1C2相關信號通路GSEA分析

GSEA分析結果顯示,SULT1C2表達在不同腫瘤組織中信號通路并不完全一致,信號通路在不同組織可能被激活或抑制。見圖4A和圖4B。與泛癌不同的是,E2F、G2M檢查點和MYC信號通路的基因頻率和基因數量在SULT1C2表達肝癌中是被激活最高和最多的。見圖4C、D。

A:GESA分析SULT1C2表達在泛癌中調節的信號通路;B:SULT1C2表達在泛癌中激活/抑制信號的比率;C:E2F、G2M檢查點和MYC信號通路在SULT1C2表達的肝癌中被激活;D:E2F、G2M檢查點和MYC信號通路與肝癌中SULT1C2表達正相關。

3 討 論

SULT超家族的酶參與外源物質和內源化合物的代謝,并調節激素的生物活性[9]?；谒鼈儾煌淖饔?評估SULTs的表達和調控對于理解個體對藥物和毒物的反應以及疾病病因學具有重要意義[10-11]。SULT1C是SULT家族的一個分支,位于染色體2q12上,是胎兒發育過程中代謝和致癌的一個潛在的重要決定性因素。然而,人們對其生理功能仍知之甚少,主要是由于SULT1C在胎兒期表達,而在成人組織中低表達[4,12-13]。SULT1C2是第一個被克隆的人類SULT1C成員[5],其在肝癌中的研究較少。本文研究結果顯示,SULT1C2在肝癌組織中高表達,且其高表達時病人預后較差。

細胞內存在一系列嚴密的調控機制,以確保細胞周期不同時期的有序進行。細胞周期的嚴密調控可因基因突變、缺失、異位、擴增等改變而發生紊亂以致形成腫瘤[14]。作為視網膜母細胞瘤蛋白下游的效應因子,E2Fs通過細胞周期蛋白的進入調控細胞周期的進程[15]。MYC是細胞增殖過程中必不可少的轉錄因子,通過反式作用調控細胞的發育、生長和分化。MYC的異常表達誘導細胞對生長因子的依賴性減少,從而導致細胞永生化和細胞特性的改變[14-15]。SULT1C2表達的信號通路在不同的腫瘤組織中并不完全一致,可能是由于其信號通路在不同的組織中被激活或抑制。

綜上所述,本文生信分析結果提示,SULT1C2基因在肝癌中高表達,它可能通過激活E2F、G2M檢查點和MYC信號通路誘導肝癌病人的不良預后,故SULT1C2有望成為肝癌潛在的診治新靶點。本研究存在不足之處,即未闡明SULT1C2基因是如何通過E2F、G2M檢查點和MYC信號通路影響肝細胞癌的進展。因此,今后的研究將進一步探討SULT1C2在肝癌發生發展中的作用及其分子機制,以期為其成為肝癌潛在的早期診斷和治療新靶點提供線索。